劉小芳,邱阿敏,唐一新,張輝珍,冷凱良,*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266071; 2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266200; 3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,山東青島 266021; 4.青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東青島 266071)

南極磷蝦是目前唯一尚未大規(guī)模開發(fā)且儲(chǔ)量尤為豐富的單種漁業(yè)資源,其資源儲(chǔ)量約為6.5～10億噸,年可捕量相當(dāng)于目前全球海洋捕撈產(chǎn)量的總和[1]。南極磷蝦富含蛋白質(zhì)、人體所必需的全部氨基酸、Omega-3系列多不飽和脂肪酸、磷脂等,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高[2-4]。南極磷蝦油是以南極磷蝦粉為原料經(jīng)提取精制而得,富含EPA/DHA、磷脂以及蝦青素等功能脂質(zhì)[5-6],具有調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、改善腦細(xì)胞功能等多種生理活性[7-9]。2013年我國(guó)衛(wèi)生計(jì)生委第16號(hào)公告已批準(zhǔn)南極磷蝦油為新食品原料,目前其市場(chǎng)價(jià)格達(dá)到每噸70～120萬,成為南極磷蝦產(chǎn)業(yè)最主要的高附加值產(chǎn)品形式。

受原料及加工工藝影響,南極磷蝦油中總砷含量較高,約為2.5～8.3 mg/kg,其中主要砷形態(tài)是無毒的砷甜菜堿,而毒性較高的AsⅢ和AsⅤ等無機(jī)砷含量極低[10]。但受總砷含量較高的影響,人們對(duì)南極磷蝦油的食用安全性仍存在一定疑慮,這也制約了產(chǎn)品市場(chǎng)的發(fā)展。因此,闡釋南極磷蝦油及其主要砷形態(tài)化合物在體內(nèi)的代謝、蓄積和轉(zhuǎn)化情況至關(guān)重要。本課題組前期研究證實(shí),大鼠攝食南極磷蝦油及其砷甜菜堿后,85%的砷會(huì)在24 h之內(nèi)隨尿液排出體外;連續(xù)攝食30 d后,大鼠體重、臟器指數(shù)、血清生化指標(biāo)和組織病理切片分析均未見明顯異常[11],肝臟和腎臟中總砷水平亦未出現(xiàn)顯著變化。為進(jìn)一步全面地解釋南極磷蝦油的食用安全性,本研究繼續(xù)考察了攝食南極磷蝦油及其砷甜菜堿對(duì)動(dòng)物臟器中不同砷形態(tài)含量及相互間轉(zhuǎn)化的影響,以期為南極磷蝦油的科學(xué)消費(fèi)和應(yīng)用領(lǐng)域拓展提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠 體重180～220 g、生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(魯)20140001,青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;南極磷蝦油 紅棕色油狀物,貯存于干燥、密封處,總砷含量3.92 mg/kg、無機(jī)砷含量0.021 mg/kg、砷甜菜堿含量3.57 mg/kg、二甲基砷含量0.29 mg/kg,青島南極維康生物科技有限公司;大豆油,總砷含量0.037 mg/kg 嘉里糧油(天津)有限公司;色譜純甲醇 美國(guó)Fisher公司;磷酸二氫銨、鹽酸、硼氫化鉀、過硫酸鉀、氫氧化鉀等均為分析純 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;亞砷酸根離子(AsⅢ)、砷酸根離子(AsV)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷甜菜堿(AsB)標(biāo)準(zhǔn)溶液 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院;砷甜菜堿(AsB)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%) 日本W(wǎng)ako公司。

SA5型液相色譜-原子熒光光譜聯(lián)用儀 北京普析通用儀器有限公司;7500型電感耦合等離子質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司;PRPx-100陰離子交換色譜分析柱(250 mm×4.1 mm,10 μm) 瑞士Hamilton公司;Milliplus 2150型超純水處理系統(tǒng) 美國(guó)Millipore公司;30-30K型低溫離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司;FA1004N型電子天平 上海民僑精密科學(xué)儀器有限公司;T10型組織勻漿器 德國(guó)IKA公司;STARTER 3100型pH計(jì) 梅特勒托利多有限公司;KQ-500DE型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及大鼠的飼養(yǎng) SPF級(jí)雄性Wistar大鼠30只,隨機(jī)分為6組:大豆油對(duì)照組(7 d組、30 d組)、南極磷蝦油組(7 d組、30 d組)、添加100 mg/kg砷甜菜堿的南極磷蝦油組(7 d組、30 d組),根據(jù)成人每日膳食油脂推薦攝入量25 g等量換算成大鼠每日灌胃劑量為2.625 g油/kg·bw,以最大程度接受南極磷蝦油砷暴露,7 d組連續(xù)灌胃7 d,30 d組連續(xù)灌胃30 d,飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃,濕度40%～70%,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由飲食飲水。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12 h,于末次灌胃后24 h,經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉,剝離肝臟、腎臟,液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 總砷測(cè)定 按照GB 5009.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無機(jī)砷的測(cè)定》中第一法 電感耦合等離子體質(zhì)譜法的規(guī)定執(zhí)行。

1.2.3 砷形態(tài)分析

1.2.3.1 樣品前處理 參照Grotti等[12]的方法進(jìn)行樣品前處理。稱取0.5～2.0 g大鼠肝臟或腎臟樣品,加入25 mL 90%甲醇溶液勻漿,勻漿液于搖床上室溫振蕩提取過夜,8000 r/min離心5 min,取上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮去除甲醇,超純水定容至10 mL,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,待測(cè)。

1.2.3.2 液相色譜檢測(cè)條件 色譜柱:HamiltonPRPx-100陰離子交換色譜分析柱(250 mm×4.1 mm,10 μm);流動(dòng)相:流動(dòng)相A為0.8 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH9.0),流動(dòng)相B為20 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH8.0),梯度洗脫程序見表1;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:100 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of the gradient elution

1.2.3.3 原子熒光檢測(cè)條件 負(fù)高壓:320 V;燈絲總電流:100 mA,主電流/輔助電流:50/50 mA;載氣流速:800 mL/min;原子化器溫度:中溫;原子化方式:火焰法;載流:10%鹽酸溶液,流速4 mL/min;還原劑:3%硼氫化鉀溶液(含5 g/L氫氧化鉀),流速4 mL/min;氧化劑:0.5%過硫酸鉀溶液(含5 g/L氫氧化鉀),流速1.5 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

本研究分析了流動(dòng)相磷酸二氫銨溶液的摩爾濃度與pH對(duì)五種砷形態(tài)出峰時(shí)間和分離效果的影響(表2)。結(jié)果顯示,當(dāng)磷酸二氫銨溶液濃度小于1.0 mmol/L時(shí),AsB、AsⅢ和DMA三種砷形態(tài)化合物可在較短時(shí)間內(nèi)出峰,但MMA和AsV兩種砷形態(tài)化合物不能在30 min之內(nèi)完成洗脫;當(dāng)磷酸二氫銨溶液濃度大于1 mmol/L時(shí),五種砷形態(tài)化合物雖能夠在較短時(shí)間內(nèi)出峰,但AsB、AsⅢ、DMA等三種砷形態(tài)化合物的分離效果不佳。GB 5009.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無機(jī)砷的測(cè)定》關(guān)于無機(jī)砷測(cè)定的HPLC-AFS法中規(guī)定梯度洗脫采用1.0 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH9.0)和20 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH8.0)作為流動(dòng)相。

表2 流動(dòng)相摩爾濃度和pH對(duì)不同砷形態(tài)化合物保留時(shí)間的影響Table 2 Effects of the flow phase concentration and pH on the retention times of the five arsenic compounds

本研究發(fā)現(xiàn),采用0.8 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH9.0)與采用1.0 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH9.0)進(jìn)行洗脫時(shí),效果基本一致。因此,在實(shí)際檢測(cè)時(shí),本研究對(duì)國(guó)標(biāo)方法中規(guī)定的洗脫條件進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化,先采用0.8 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH9.0)進(jìn)行洗脫,再轉(zhuǎn)換為20 mmol/L磷酸二氫銨溶液(pH8.0)進(jìn)行洗脫,既可保證五種砷形態(tài)化合物實(shí)現(xiàn)有效分離,又可在20 min內(nèi)完成檢測(cè)。在上述梯度洗脫條件下,五種砷形態(tài)化合物的色譜分離圖譜見圖1。

圖1 五種砷形態(tài)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of the mixed standard solutions of the five arsenic compounds

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 檢出限與定量限 五種砷形態(tài)化合物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分析結(jié)果見表3。以信噪比S/N=3對(duì)應(yīng)的濃度點(diǎn)作為方法的LOD,以S/N=10對(duì)應(yīng)的濃度點(diǎn)作為方法的LOQ。AsB和MMA的LOD均為0.35 μg/L,LOQ均為1.0 μg/L;AsⅢ、DMA和AsⅤ的LOD均為0.50 μg/L,LOQ均為2.0 μg/L。

表3 五種砷形態(tài)化合物的檢出限、定量限、線性范圍與精密度Table 3 LOD,LOQ,linearity range and precision of the five arsenic compounds

2.2.2 線性范圍與精密度 五種砷形態(tài)化合物線性范圍與精密度分析結(jié)果見表3。結(jié)果顯示,在5～200 μg/L濃度范圍內(nèi),五種砷形態(tài)化合物的峰面積(Y)與濃度(X)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,R2大于0.999,可以通過外標(biāo)法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。采用50 μg/L的不同砷形態(tài)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次,RSD為1.34%～3.97%,方法精密度良好。

2.2.3 加標(biāo)回收率 為驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度,測(cè)定了不同砷形態(tài)化合物的加標(biāo)回收率,結(jié)果見表4。在20～100 μg/L加標(biāo)濃度范圍內(nèi),AsB、AsⅢ、DMA、MMA和AsⅤ的回收率在80.2%～113.0%之間。本分析方法的加標(biāo)回收效果較好,準(zhǔn)確度高,可以用于動(dòng)物臟器組織中不同砷形態(tài)化合物的定量分析。

表4 五種砷形態(tài)化合物的加標(biāo)回收率Table 4 Recoveries of the five arsenic compounds

續(xù)表

2.3 大鼠臟器中總砷和不同砷形態(tài)化合物的含量

不同實(shí)驗(yàn)組大鼠連續(xù)灌胃7、30 d后,肝臟和腎臟中總砷和不同砷形態(tài)化合物的含量分析結(jié)果見表5、表6,砷形態(tài)分析圖譜見圖2、圖3。由表5和表6可知,對(duì)照組大鼠肝臟總砷含量為1.00～1.16 mg/kg,腎臟總砷含量為1.02～1.07 mg/kg。與對(duì)照組相比,連續(xù)灌胃7、30 d后,磷蝦油組、砷甜菜堿磷蝦油組大鼠肝臟和腎臟中總砷含量略有升高,但無顯著性差異(p>0.05)。灌胃7 d與灌胃30 d相比較,各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟和腎臟總砷含量水平均基本一致,無顯著性差異(p>0.05)。

表5 不同實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟中五種砷形態(tài)化合物的含量(mg/kg,n=5)Table 5 Contents of the five arsenic compounds in the livers of the experimental rats(mg/kg,n=5)

表6 不同實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟中五種砷形態(tài)化合物的含量(mg/kg,n=5)Table 6 Contents of the five arsenic compounds in the kidneys of the experimental rats(mg/kg,n=5)

圖2 磷蝦油組大鼠灌胃30d后腎臟砷形態(tài)分析色譜圖Fig.2 Chromatogram of five arsenic compounds in the kidney of the rat fed with krill oil for 30 d

圖3 砷甜菜堿磷蝦油組大鼠灌胃 30d后肝臟砷形態(tài)分析色譜圖Fig.3 Chromatogram of five arsenic compounds in the liver of the rat fed with arsenobetaine added krill oil for 30 d

砷形態(tài)分析結(jié)果顯示,大鼠肝臟和腎臟中主要的砷形態(tài)為AsB,約占總砷含量的80%,其次為DMA,而AsⅢ、MMA和AsⅤ均未檢出。連續(xù)灌胃7、30 d,磷蝦油組、砷甜菜堿磷蝦油組大鼠肝臟和腎臟中AsB和DMA含量較對(duì)照組均無顯著性差異(p>0.05)。灌胃7 d與灌胃30 d相比較,各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟和腎臟中AsB和DMA含量也無顯著性差異(p>0.05)。由此可見,磷蝦油中的砷甜菜堿在大鼠體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生蓄積作用。

3 討論

砷在自然環(huán)境中主要以有機(jī)態(tài)和無機(jī)態(tài)兩種形式存在。水產(chǎn)品中砷化合物主要包括AsB、DMA、MMA、砷膽堿(AsC)、砷脂、砷糖等有機(jī)砷,以及少量的AsⅢ、AsⅤ等無機(jī)砷[13-14]。南極磷蝦中最主要的砷賦存形態(tài)為AsB,且其在加工過程中,易隨著醇提、脫溶、精制等過程而富集至磷蝦油中[12,15],含量達(dá)到磷蝦油總砷含量的90%以上[10,16]。本研究針對(duì)膳食攝入磷蝦油及其砷甜菜堿是否會(huì)在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為無機(jī)砷形態(tài),進(jìn)而引發(fā)機(jī)體損傷這一科學(xué)問題進(jìn)行了重點(diǎn)考察。研究發(fā)現(xiàn),未給予受試物的大鼠肝臟和腎臟中,砷主要是以AsB和DMA兩種形式存在,其它砷形態(tài)特別是毒性較大的無機(jī)砷未有檢出。受儀器檢出限以及樣品前處理方法不同等的影響,檢測(cè)到的砷形態(tài)總量與總砷含量略有差異。大鼠連續(xù)攝食南極磷蝦油或添加100 mg/kg砷甜菜堿的南極磷蝦油7 d或30 d后,肝臟和腎臟中總砷、AsB、AsⅢ、DMA、MMA、AsⅤ含量均未有顯著性變化(p>0.05),證明攝入磷蝦油乃至超出正常磷蝦油中砷甜菜堿30倍含量的供試物并不會(huì)引發(fā)大鼠臟器中砷的蓄積和砷形態(tài)間的相互轉(zhuǎn)化,同時(shí)也證明,磷蝦油中其他成分也不會(huì)對(duì)此代謝過程產(chǎn)生不利影響。前人研究報(bào)道,砷甜菜堿具有低毒、不代謝的特點(diǎn)[17],其沒有明顯毒作用的靶器官,不在體內(nèi)產(chǎn)生蓄積作用[18-20],攝入后主要通過尿液途徑排出體外,小部分隨膽汁等途徑排出,不會(huì)在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為其他形式的砷化合物[21-23],與本文的研究結(jié)果保持一致。

歐盟食品安全局在《食品中砷的科學(xué)觀點(diǎn)》中指出砷元素的毒性與其存在形態(tài)密切相關(guān),無機(jī)砷具有致癌毒性,而有機(jī)砷通常被認(rèn)為是低毒或無毒的[15]。以砷化合物的半數(shù)致死量LD50(mg/kg)計(jì),其毒性由大到小依次為As(Ⅲ)(14)>As(V)(20)>MMA(200～1800)>DMA(200～2600)>AsC(>6500)>AsB(>10000)[24-25]。郭瑩瑩等[26]基于南極磷蝦油中總砷和無機(jī)砷含量的檢測(cè)數(shù)據(jù),結(jié)合南極磷蝦油產(chǎn)品的膳食消費(fèi)量,通過點(diǎn)評(píng)估方法對(duì)南極磷蝦油砷膳食暴露量及食用安全性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)攝食南極磷蝦油對(duì)無機(jī)砷膳食暴露量的貢獻(xiàn)率極低,長(zhǎng)期食用磷蝦油并不會(huì)增加總膳食無機(jī)砷的攝入。綜合以上資料以及本研究的結(jié)果可知,長(zhǎng)期攝食南極磷蝦油并不會(huì)帶來因總砷、無機(jī)砷或有機(jī)砷含量問題而引發(fā)的健康風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

本研究建立了基于HPLC-AFS技術(shù)的動(dòng)物組織臟器中砷形態(tài)分析方法,可實(shí)現(xiàn)大鼠臟器中AsB、DMA、MMA、AsⅢ、AsⅤ等五種砷形態(tài)化合物的定性和定量,五種砷形態(tài)的檢出限為0.35～0.50 μg/L,定量限為1.0～2.0 μg/L,方法在5～200 μg/L濃度范圍內(nèi)線性良好,R2>0.999,加標(biāo)回收率為80.2%～113.0%,RSD為1.34%～3.97%。該方法具有分離度良好,檢測(cè)限低,準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。

大鼠肝臟和腎臟中檢出的砷形態(tài)化合物主要為AsB和DMA,而AsⅢ和AsⅤ等無機(jī)砷形態(tài)未有檢出。大鼠肝臟中AsB含量為0.80～0.89 mg/kg、DMA含量為0.18～0.19 mg/kg,腎臟中AsB含量為0.82 mg/kg、DMA含量為0.16～0.18 mg/kg。短期或長(zhǎng)期攝食南極磷蝦油及其砷甜菜堿后,臟器中砷形態(tài)的組成和含量均未有顯著性變化(p>0.05)。因此,攝食南極磷蝦油不會(huì)產(chǎn)生臟器砷蓄積現(xiàn)象,同時(shí),攝入的砷甜菜堿也不會(huì)在體內(nèi)向毒性較強(qiáng)的無機(jī)砷形態(tài)轉(zhuǎn)化。南極磷蝦油可以作為安全的食品原料在保健食品、生物醫(yī)藥制品領(lǐng)域予以推廣利用。