任嬌艷，高立，茍娜，李良，袁爾東，*，楊宜婷，*

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州510641；2.無限極（中國）有限公司，廣東廣州510665；3.中新國際聯(lián)合研究院，廣東廣州510000）

據(jù)流行病學調(diào)查統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)人群中幽門螺桿菌感染率在50%以上，發(fā)展中國家的感染率達到80%～90%[1]。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）是一種微需氧的革蘭氏陰性細菌，呈螺旋狀，能產(chǎn)生有毒性作用的脲酶以中和胃酸，便于其在低pH 環(huán)境的胃部定殖[3]。由于人類免疫反應(yīng)無法有效對抗Hp 這種細菌，它一旦在胃中定殖，便會一直存在于宿主中，其分泌的毒蛋白能破壞胃黏膜上皮細胞的屏障功能，對胃黏膜造成漸進性損傷[4-5]，甚至會引發(fā)十二指腸潰瘍、胃潰瘍、胃腺癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等許多疾病[6-7]。據(jù)統(tǒng)計，10%～20%的Hp 感染者會患上消化性潰瘍，且約有1%的感染者會發(fā)展為胃癌，幾率是正常人的 2 倍～7 倍[8-9]。

研究顯示，根除Hp 可顯著改善胃黏膜萎縮，從而預(yù)防胃癌的發(fā)生[10]。傳統(tǒng)的治療方法是三聯(lián)療法，即質(zhì)子泵抑制劑輔加兩種抗生素[11]。但是，隨著抗菌藥物的廣泛使用，抗菌藥物耐藥性一直在增加，傳統(tǒng)三聯(lián)療法的治愈率也在不斷降低[12]。因此，迫切需要研究出新型根除Hp 的有效方法，以緩解由Hp 感染引發(fā)的胃部損傷。

從天然植物中尋找安全、高效的活性成分，是現(xiàn)代食品、功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。我國傳統(tǒng)的中草藥資源是天然活性成分的巨大寶庫，亟待更深入的研究與開發(fā)。中草藥在治療Hp 感染引起的胃黏膜損傷已顯示出良好療效且副作用小，從中藥中提取活性成分來加以應(yīng)用具有很大潛力[13-14]。目前，多數(shù)研究所用原料為藥用植物[15-17]，而本研究對象選自藥食同源原料，不僅可應(yīng)用于中藥配伍，亦可作為食品基料應(yīng)用于食品研發(fā)。

針對這種不足，本論文在研究各種不同藥食同源的中藥提取物對人胃黏膜上皮細胞（human gastric epithelial cell line，GES-1）影響的基礎(chǔ)上，篩選出具有良好促進GES-1 細胞增殖作用的白扁豆提取物，進一步分析其對Hp 的抑制作用及抑菌機理，探討其對Hp 損傷GES-1 細胞的修復(fù)作用，從而為天然植物活性成分在對Hp 引起胃黏膜損傷的修復(fù)作用方面提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

幽門螺桿菌（Hp）、人永生化胃黏膜上皮細胞（human gastric epithelial cell line，GES-1）：南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院消化科；復(fù)合多糖：無限極（中國）有限公司；白術(shù)、白扁豆、陳皮、山藥：安國市一方藥業(yè)有限公司；無菌脫纖維綿羊血：廣州鴻泉生物科技有限公司，批號180820；CM0331B 哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)、腦心浸液（brain heart infusion，BHI）：廣州翔博生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、含0.01%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的0.25%胰蛋白酶（批號C11995500BT）、雙抗（青霉素、鏈霉素）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）批號 730840：Gibco 公司；革蘭染色液試劑盒：青島海博生物技術(shù)有限公司，批號HB8278；MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C0009。

1.2 儀器與設(shè)備

C-31 型厭氧培養(yǎng)罐（細菌）：上?；鄯f生物科技有限公司；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TOMY SX-700 型高壓滅菌鍋：上海鼎謙生物科技有限公司；UV754N 型紫外可見光分光光度計：INESA 上海儀電分析儀器有限公司；BDS200 型倒置相差顯微鏡：日本Olympus 公司；ST16 型離心機：賽默飛世爾科技公司；FA2204 型萬分之一電子天平：上海安亭科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中藥提取物的制備

稱取中藥原料15 g，粉碎過60 目篩，按料液比1∶20（g/mL）加去離子水，在 80 ℃下回流提取 2 h。過濾、棄去濾渣，在5 000 r/min 條件下離心10 min，減壓濃縮，冷凍干燥，得到中藥提取物，干燥保存，備用。

1.3.2 Hp 活菌懸液的制備

Hp 培養(yǎng)于含有10%FBS 的哥倫比亞培養(yǎng)基中，置于 37 ℃含 5%O2、10%CO2、85%N2的飽和濕度環(huán)境，培養(yǎng)48 h 用于試驗或傳代。將Hp 刮取收集于含10%FBS 的BHI 培養(yǎng)液中，為Hp 活菌懸液。酶標儀檢測 600nm 下 OD600值，以 OD600=1 為 1.0×109cfu/mL[18]，確定Hp 菌懸液濃度。

1.3.3 提取物對GES-1 細胞增殖的測定

用胰酶消化對數(shù)生長期的GES-1 細胞制成單細胞懸液，計數(shù)，以每孔1×104的量接種至96 孔板中，每組設(shè)置6 個復(fù)孔，置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育16 h。加入不同濃度中藥提取物，繼續(xù)孵育24 h。為防止藥物與噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）反應(yīng)影響顯色，則需棄去原培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液輕輕沖洗 2～3 遍后，再加入 5 g/L MTT 溶液 20 μL，再孵育4 h。棄去上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，振蕩溶解結(jié)晶，在570 nm 下測定OD 值[19]。計算GES-1 細胞存活率。

1.3.4 Hp 抑制試驗

用0.1%的二甲基亞砜充分溶解中藥提取物后，再溶于含10%FBS 的BHI 培養(yǎng)液中配成不同濃度的藥液，過 0.22 μm 濾膜，備用。

在 24 孔板中加入 10 μL Hp 菌懸液（109cfu/mL）以及990 μL 不同濃度的藥液，陰性對照組加入不含藥物的BHI 培養(yǎng)液和Hp 菌懸液，陽性對照組則加入含100 μg/mL 阿莫西林和 50 μg/mL 克拉霉素混合抗生素[20]的BHI 培養(yǎng)液和Hp 菌懸液。37 ℃微需氧條件下培養(yǎng)24 h 后，適當稀釋，取50 μL 轉(zhuǎn)至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h 后計數(shù)菌落[21]。

1.3.5 體外抑制脲酶活性試驗

分別將脲酶溶液（10 U/mL）與不同濃度的藥物溶液（125、250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL）各 100 μL混勻至1.5mL離心管中，于37 ℃避光反應(yīng)20 min。加入 50 mmol/mL 尿素 100 μL，在 25 ℃下避光反應(yīng) 20 min。加入貝特洛顯色液并搖勻，在25 ℃避光反應(yīng)10 min。吸取 150 μL 至 96 孔板中，測定 595 nm 處的 OD 值。每個濃度的藥物平行操作3 次?？瞻讓φ战M加入相應(yīng)溶液的溶劑[22]。根據(jù)公式計算出剩余酶活性，運用SPSS 統(tǒng)計軟件求得藥物的IC50。

1.3.6 對Hp 感染損傷GES-1 細胞的影響

在含有10%FBS 及1%抗生素的培養(yǎng)液（dulbecco's modified eagle's medium，DMEM）中孵育 GES-1細胞，當細胞生長達到80%融合時，用胰酶消化處于對數(shù)生長期的GES-1，計數(shù)細胞，以每孔105個/L 的濃度接種于96 孔板上培養(yǎng)過夜。用1.0×109cfu/mL 濃度的 Hp 與 GES-1 細胞按照 100∶1 的體積比共培養(yǎng) 24 h，建立Hp 損傷GES-1 細胞模型[23]。然后，加入不同濃度提取物 100 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 12、24、36、48 h 后，光學顯微鏡下觀察GES-1 細胞形態(tài)的變化，MTT 法檢測計算細胞存活率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均獨立平行測定3 次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準差（mean±SD）的形式表示，采用 SPSS 24.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，通過獨立樣本t 檢驗做顯著性分析，P ＜0.05 為有統(tǒng)計學意義，圖表采用GraphPad Prism 5 進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同中藥提取物對GES-1細胞的影響

圖1 為不同中藥提取物以及復(fù)合多糖對GES-1細胞增殖的影響。

圖1 不同中藥提取物對GES-1 細胞增殖的影響Fig.1 Effect of herb extracts on the GES-1 viability

其中，砂仁和白術(shù)提取物對GES-1 細胞的增殖沒有顯著影響（P ＞0.05）。陳皮提取物對GES-1 細胞的增殖表現(xiàn)出抑制作用，且隨著濃度升高，對細胞增殖的抑制作用增強。在濃度達到125.00 μg/mL 以上時，開始對GES-1 細胞生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。在500.00 μg/mL 濃度時，GES-1 細胞的存活率已經(jīng)下降到90%左右。

復(fù)合多糖和白扁豆提取物，對GES-1 細胞增殖有一定的促進作用，且呈劑量依賴效應(yīng)。當濃度達到15.62 μg/mL 以上時，二者對細胞的增殖作用均開始產(chǎn)生顯著影響。在500.00 μg/mL 濃度時，復(fù)合多糖和白扁豆組的GES-1 細胞存活率分別達到122.15 %和125.80%。因此，在所有受試原料中白扁豆提取物促進GES-1 細胞增殖的作用最為顯著，后續(xù)試驗針對白扁豆提取物開展進一步的研究。

2.2 白扁豆提取物對幽門螺桿菌的抑制作用

白扁豆性微溫、味甘，歸脾、胃經(jīng)。據(jù)《名醫(yī)別錄》記載，白扁豆“和中下氣”，可升清降濁，有調(diào)肝和胃的功效[24]。現(xiàn)代研究表明，白扁豆在抗菌、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等方面均有重要的作用。Ye 等[25]從白扁豆中提取出一種抗菌蛋白，可抑制絲核菌和鐮刀霉菌等，且對人類免疫缺陷病毒表達過程中的相關(guān)蛋白酶具有抑制作用。不同濃度白扁豆提取物對Hp 的抑制作用見圖2。

圖2 不同濃度白扁豆提取物對Hp 的抑制作用Fig.2 Inhibition of Dolichos bean seeds extract on Hp

如圖2 所示，白扁豆提取物對Hp 也有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。15.62 μg/mL 白扁豆提取物作用24 h 后，Hp 數(shù)量已由對照組的1.77×107cfu/mL 下降到 6.60×106cfu/mL，抑制率達 62.61 %，與對照組相比的差異高度顯著。

2.3 白扁豆提取物對脲酶活性的影響

白扁豆提取物對脲酶活性的抑制作用見圖3。

脲酶是Hp 的主要致病因子之一，與Hp 的活性密切相關(guān)。Hp 能通過分泌脲酶來分解胃中存在的少量尿素，因而產(chǎn)生的氨能中和部分胃酸以提高Hp 周圍的pH值，便于Hp 在胃部的高酸性環(huán)境下定殖。而且，Hp還能通過產(chǎn)生脲酶以促使胃上皮GES-1 細胞凋亡[26-27]。因此，通過抑制脲酶活性可減弱Hp 的致病性。如圖4所示，白扁豆提取物可明顯抑制脲酶活性，并呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。白扁豆提取物在500 μg/mL 濃度下，對脲酶的抑制率已達到82%。白扁豆提取物抑制脲酶活性的半數(shù)抑制濃度IC50值為397.14 μg/mL。因此，白扁豆提取物可能通過抑制Hp 所產(chǎn)生脲酶的活性，減弱Hp 在胃部的定殖能力，并降低脲酶這一毒力因子對胃部的損傷，從而最終緩解Hp 對胃部的損傷。

圖3 白扁豆提取物對脲酶活性的抑制作用Fig.3 Inhibition of Dolichos bean seeds extract on urease activity

2.4 白扁豆提取物對Hp損傷GES-1細胞的修復(fù)作用

正常的GES-1 細胞形態(tài)多數(shù)呈扁平三角形或多邊形，或近似梭狀，小島狀增殖，貼壁生長。但Hp 與GES-1 細胞共培養(yǎng)24 h 后，大多細胞的棱角消失，胞漿收縮，形態(tài)變圓；細胞之間的連接性降低，貼壁不充分，偶有脫離現(xiàn)象；部分細胞死亡，培養(yǎng)液中出現(xiàn)懸浮的細胞碎片。說明Hp 影響了GES-1 細胞的形態(tài)，對GES-1 細胞的生理活性具有一定損害作用，從而抑制了GES-1 細胞的生長。

不同濃度白扁豆提取物對Hp 損傷GES-1 細胞存活率的影響見圖4。

圖4 不同濃度白扁豆提取物對Hp 損傷GES-1 細胞存活率的影響Fig.4 Effect of Dolichos bean seeds（DBS）extract on the Hpinjured GES-1 cells

在已被Hp 侵染24 h 的GES-1 細胞中加入白扁豆提取物，36 h 后可見GES-1 細胞形態(tài)開始逐漸恢復(fù)常態(tài)，貼壁的GES-1 細胞數(shù)量增多。同時，細胞存活率也開始逐漸發(fā)生變化（圖4）。在較短時間（＜24 h）內(nèi)，較低濃度（10 μg/mL～100 μg/mL）的白扁豆提取物，并不能對Hp 損傷GES-1 細胞的增殖產(chǎn)生明顯影響（P ＞0.05）。但隨著作用時間延長，GES-1 細胞存活率仍有明顯增加。以10 μg/mL 白扁豆提取物作用48 h 后，GES-1 細胞存活率已由模型組的74.77 %提高到87.11%（P ＜ 0.05）。50 μg/mL 白扁豆提取物作用 36 h后，GES-1 細胞的存活率已可提高至100%，達到修復(fù)完全的效果。而高濃度白扁豆提取物的修復(fù)作用，在短時間內(nèi)即可顯現(xiàn)。以500 μg/mL 白扁豆提取物作用12 h 后，GES-1 細胞存活率已達到95%以上，顯著高于模型組的89.86%（P ＜0.05），且能較穩(wěn)定地維持細胞生長。

因此，白扁豆提取物對受Hp 侵染損傷的GES-1細胞具有良好的修復(fù)作用，且呈現(xiàn)明顯的劑量、時間和效應(yīng)的關(guān)系。說明，白扁豆提取物對Hp 感染引起的胃部損傷，具有較好的修復(fù)作用。

3 結(jié)論

對數(shù)種中藥提取物進行篩選后發(fā)現(xiàn)，白扁豆提取物對GES-1 細胞的促增殖作用最為顯著，在500.00 μg/mL 濃度作用下GES-1 細胞存活率可提高到125.80%。同時，白扁豆提取物可有效抑制Hp 生長以及脲酶活性，且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。以15.62 μg/mL白扁豆提取物作用24 h 后，對Hp 抑制率達62.61%；白扁豆提取物對脲酶活性的IC50值為397.14 μg/mL。以Hp 侵染GES-1 細胞24 h 建立GES-1 細胞損傷模型，經(jīng)500 μg/mL 白扁豆提取物作用12 h 后，GES-1細胞存活率可達到95%以上。說明，白扁豆提取物可能通過促進GES-1 細胞增殖同時抑制Hp 及脲酶活性，來修復(fù)Hp 損傷的GES-1 細胞，從而對Hp 感染引起的胃部損傷起到修復(fù)作用。