劉溯源，姚利，汪寅，伍亮，張志強

（1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，2安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖學(xué)系，合肥 230036）

關(guān)于脊椎動物消化道內(nèi)分泌細胞的增齡變化，大多數(shù)研究集中于哺乳動物，如小鼠[1]、大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）[2]和長爪沙鼠（Merionesunguiculatus）[3]等。兩棲動物變態(tài)發(fā)育，變態(tài)前后消化道內(nèi)分泌細胞的形態(tài)學(xué)特征和分布密度變化較大[4-8]，但關(guān)于登陸后不同年齡段間的比較研究很少[9-10]。生長抑素（Somatostatin SS）細胞參與動物消化功能的調(diào)節(jié)過程，抑制胃泌素等激素的分泌，對腸道細胞起保護作用[11-12]。中華蟾蜍（Bufo gargarizans）變態(tài)前后多種消化道內(nèi)分泌細胞的出現(xiàn)時間早晚不同，SS細胞在變態(tài)高峰期數(shù)量較少，見于胃部和十二指腸，幼蟾期分布于食管至空腸各段，且分布密度明顯增加[6]。本研究進一步以幼體、亞成體和成體雄性中華蟾蜍為研究對象，對其登陸后消化道SS細胞的形態(tài)學(xué)特征和分布密度進行比較，將為深入理解其消化生理特征提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實驗材料

實驗用雄性中華蟾蜍于2018年7月中下旬捕自安徽省合肥市包河區(qū)大圩鎮(zhèn)曉南村池塘（117.38°E、31.76°N），取幼體、亞成體和成體各8只，體重分別為（8.763 ± 0.945）g、（21.325 ± 0.392）g 和（70.425 ± 5.089）g，體長分別為（4.6 ± 0.1）cm、（6.3 ± 0.1）cm和（8.9 ± 0.2）cm。用雙毀髓法處死不同年齡組的動物，之后解剖取出消化道，取食管、賁門、胃底、幽門、十二指腸、空腸、回腸和直腸各段，每段長約0.5～1cm。去除消化道內(nèi)容物后，各段組織固定于改良的Bouin’s液（不含冰醋酸）中18～24h，再經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，用輪轉(zhuǎn)切片機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號：KD-2258）切片，片厚4～5μm。

2 免疫組織化學(xué)染色

參照牛鑫鑫等[13]對花背蟾蜍（Pseudepidalea raddei）的研究方法，用卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC）法免疫組織化學(xué)染色鑒別和定位不同年齡中華蟾蜍消化道各段中的SS細胞。其中，兔抗人生長抑素單克隆抗體（ZA-0567）和兔鏈霉卵白素-生物素法檢測系統(tǒng)（SP-9001）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，一抗和試劑盒均為美國ZYMED公司產(chǎn)品。染色程序簡述如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，先經(jīng)3%H2O2甲醇溶液處理切片10min，用于消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；之后，再將切片用正常山羊血清孵育10min，用來封閉非特異性反應(yīng)部位，用濾紙吸取羊血清至切片上只有一層薄膜覆蓋為止，迅速滴加約50μl的一抗（SS抗血清）覆蓋全部材料，置于孵育盒中4℃過夜。滴加生物素化的二抗（生物素標記山羊抗兔IgG聚合物）和辣根酶標記鏈霉卵白素復(fù)合物（SABC）工作液，含有二抗和SABC的切片均在室溫條件下孵育1 h，滴加前后均用磷酸鹽緩沖液清洗切片3次，每次5 min。陽性細胞通過DAB-H2O2染色試劑盒來顯示，鏡檢控制染色程度，并及時終止陽性反應(yīng)，之后用稀釋20倍的蘇木精溶液復(fù)染，經(jīng)常規(guī)脫水和透明處理后，中性樹膠封片。陰性對照片以正常羊血清和磷酸鹽緩沖液代替一抗，其余步驟同上。

3 SS陽性細胞計數(shù)與拍照

用Motic-BA 210型顯微鏡觀察切片，計數(shù)SS陽性細胞的數(shù)量，并拍照，放大倍數(shù)為400×。每一年齡組的8只蟾蜍，每只蟾蜍從食管至直腸的8個部位，每個部位均隨機選取1張切片，每張切片計數(shù)3個視野，以3個視野的平均值表示該只蟾蜍該部位SS細胞的分布密度，以8只蟾蜍的平均值表示該年齡組該部位SS細胞的分布密度。

4 統(tǒng)計與分析

用SPSS 19.0 for windows進行數(shù)據(jù)處理。以雙因素方差分析（Two-wayANOVA）（年齡×消化道部位）統(tǒng)計不同年齡組消化道不同部位SS細胞分布密度的差異。以單因素方差分析（One-wayANOVA）及多重比較（Multiple comparisons）post hoctest統(tǒng)計同一年齡組消化道不同部位、不同年齡組同一部位SS細胞分布密度的差異。文中數(shù)據(jù)均以平均值± 標準誤（Mean ± SE）表示，P＜ 0.05為差異顯著，P＜ 0.01為差異極顯著。

結(jié) 果

1 消化道SS細胞形態(tài)學(xué)特征的增齡變化

形態(tài)學(xué)上，SS細胞分為閉合型細胞和開放型細胞。閉合型SS細胞呈圓形，幼體主要分布于直腸（圖1A）和回腸，食管偶見（圖1B）；亞成體主要分布于十二指腸（圖1C），賁門（圖1D）偶見；成體主要分布于幽門（圖1E）、十二指腸和直腸（圖1F），食管（圖1G）和賁門（圖1H）偶見。

開放型細胞形態(tài)多樣，呈三角形、楔形、長棒狀、短棒狀或不規(guī)則形。幼體的SS開放型細胞主要分布于胃底（圖1I）和幽門，食管（圖1J）、賁門（圖1K）和十二指腸（圖1L）少見；亞成體主要分布于幽門（圖1M），食管、賁門、十二指腸、空腸和回腸（圖1N）偶見；成體主要分布于幽門和直腸（圖1O），食管、賁門和胃底（圖1P）偶見。

2 消化道SS細胞分布密度的年齡和部位差異

SS細胞分布密度的年齡（F2,168= 8.906,P＜0.01）和消化道部位（F7,168= 5.062,P＜ 0.01）差異都極顯著，但兩者之間無交互作用（F7,168= 0.974,P＞ 0.05）。

幼體回腸和直腸SS細胞的分布密度較高，食管、賁門較低，但部位間的差異不顯著（F7,56= 1.296,P＞ 0.05）。亞成體幽門顯著高于賁門（F7,56= 2.237,P＜ 0.05），但與其他部位無顯著性差異。成體幽門和直腸顯著高于食管、賁門和胃底（F7,56= 2.874,P＜ 0.05），但與其他部位間的差異不顯著（表1）。

成體空腸SS細胞的分布密度顯著高于亞成體和幼體（F2,21= 6.528,P＜ 0.01），直腸成體顯著高于幼體（F2,21= 4.294,P＜ 0.05），但與亞成體無顯著差異（表1）。

圖1 中華蟾蜍消化道生長抑素細胞形態(tài)學(xué)特征的增齡變化。A，幼蟾直腸圓形的SS細胞；B，幼蟾食管圓形的SS細胞；C，亞成體蟾十二指腸圓形的SS細胞；D，亞成體蟾賁門圓形的SS細胞；E，成蟾幽門圓形的SS細胞；F，成蟾直腸圓形的SS細胞；G，成蟾食管圓形的SS細胞；H，成蟾賁門圓形的SS細胞；I，幼蟾胃底短棒狀的SS細胞；J，幼蟾食管不規(guī)則形的SS細胞；K，幼蟾賁門長棒狀的SS細胞；L，幼蟾十二指腸三角形的SS細胞；M，亞成體蟾幽門楔形的SS細胞；N，亞成體蟾空腸短棒狀的SS細胞；O，成蟾直腸三角形的SS細胞；P，成蟾胃底不規(guī)則形的SS細胞。EP，上皮；SG，胃腺；箭頭，SS陽性細胞；比例尺，15μmFig. 1 Age-related changes of morphological characters of somatostatin (SS) cells along the digestive tract of Bufo gargarizans. A, round shaped SS cells in the rectum of juvenile toads; B, round shaped SS cells in the esophagus of juvenile toads; C, round shaped SS cells in the duodenum of subadult toads; D, round shaped SS cells in the cardia of sub-adult toads; E, round shaped SS cells in the pylorus of adult toads; F, round shaped SS cells in the rectum of adult toads; G, round shaped SS cells in the esophagus of adult toads; H, round shaped SS cells in the cardia of adult toads; I, short-bar shaped SS cells in the fundus of juvenile toads; J, irregular shaped SS cells in the esophagus of juvenile toads; K, long-bar shaped SS cells in the cardia of juvenile toads; L, triangle shaped SS cells in the duodenum of juvenile toads; M, wedge shaped SS cells in the pylorus of sub-adult toads; N, shortbar shaped SS cells in the jejunum of sub-adult toads; O, triangle shaped SS cells in the rectum of adult toads; P, irregular shaped SS cells in the fundus of adult toads. EP, epithelium; SG, stomach gland; arrows, SS positive cells; scale bar, 15μm

表1 中華蟾蜍消化道生長抑素免疫反應(yīng)陽性細胞分布密度的年齡和部位差異（細胞個數(shù)/400×視野）Tab. 1 Age-related and segmental differences of distribution densities of somatostatin immunoreactive positive cells along the digestive tract in Bufo gargarizans (cells/400× fields)

討 論

中華蟾蜍登陸后消化道SS細胞的形態(tài)學(xué)特征多變，亞成體和成體的分布密度部位間的差異明顯，空腸和直腸的分布密度隨年齡增加而升高，這可能與SS細胞的功能及個體的消化生理狀態(tài)有關(guān)。

1 中華蟾蜍消化道SS細胞形態(tài)學(xué)特征的增齡變化

中華蟾蜍消化道SS細胞最早出現(xiàn)于變態(tài)高峰期的胃部和十二指腸，幼蟾期從食管至空腸都有分布，以閉合型細胞為主，并開始出現(xiàn)開放型細胞[6]。登陸后，中華蟾蜍幼體、亞成體和成體消化道SS細胞分為呈圓形的閉合型細胞，或有細胞質(zhì)突起伸向鄰近細胞的開放型細胞，這與其他兩棲動物相同[9]。大熊貓胃腸道[2]和長爪沙鼠腸道[3]SS細胞的形態(tài)學(xué)特征都無明顯的年齡變化；大鼠生后1d、7d、18d、28d和45d胃腸道各段均有SS細胞分布，形態(tài)多樣，18d時小腸段以開放型細胞為主，SS細胞有細胞質(zhì)突起伸向腸腔，或有突起與鄰近細胞相接觸[14-15]。中華蟾蜍消化道SS細胞形態(tài)多變，這可能主要與SS細胞抑制胃泌素等其他內(nèi)分泌激素分泌的生理功能有關(guān)，有助于保護胃腸黏膜[12]。

2 同一年齡組中華蟾蜍消化道SS細胞分布密度的部位差異

中華蟾蜍消化道SS細胞在變態(tài)高峰期偶見于胃部和十二指腸，幼蟾期有較多數(shù)量的陽性細胞分布于食管至空腸各段[6]。牛蛙（Rana catesbeiana）消化道SS細胞在變態(tài)前期已見于消化道各段，但各段的分布密度無明顯差異，變態(tài)高峰期和變態(tài)后期食管無分布，賁門、胃體和腸道前段的密度增加明顯[7]；從41至46期，極北鯢（Salamandrella keyserlingii）腸道SS細胞41期未見，43期的密度顯著高于其他時期[8]。變態(tài)前后，非洲爪蟾（Xenopus laevis）胃和前腸SS細胞的密度隨發(fā)育進程而逐漸升高[17]，而歐洲林蛙（Rana temporaria）蝌蚪主要分布于胃和前腸[4-5]。大鼠SS細胞于生后1d就已分布于胃腸各段，生后1～45d胃竇部的密度隨日齡的增長而逐漸增多，腸道在18d 時最高[15]；生后5d、15d、30d和 60d的雄性昆明小鼠腺胃的密度顯著高于腸道各段[18]。中華蟾蜍幼體消化道各段的SS細胞數(shù)量相對穩(wěn)定，亞成體和成體幽門密度最高，成體在直腸也有一個密度高峰，但密度低谷都位于消化道前端，暗示SS細胞在幽門可能主要起抑制胃蠕動、減少胃部血流量和平衡其他激素分泌的作用，在直腸主要執(zhí)行抑制腸蠕動和保護腸黏膜的功能[12,16]。

3 中華蟾蜍消化道同一部位SS細胞分布密度的年齡差異

中華蟾蜍消化道SS細胞的密度從幼體至成體空腸和直腸部位上升明顯。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物隨發(fā)育進程的推進，胃部SS細胞的密度變化較大。例如，大鼠生后胃竇部SS細胞隨日齡的增長而逐漸增多[15]，而小鼠則在生后第15d腺胃部SS細胞達到高峰，30d時數(shù)量回落，至60d時又回升至與15d時接近的水平[18]。中華蟾蜍登陸后食管和胃部SS細胞的分布密度均無顯著變化，空腸和直腸密度上升，這與大鼠和小鼠均不相同。隨著年齡增加，中華蟾蜍空腸SS細胞的分布密度持續(xù)升高，說明在亞成體階段已具備較強的消化和吸收食物的能力，增加的SS細胞數(shù)量有助于抑制腸液的分泌，平衡其他激素的含量，使機體的消化和吸收能力處于穩(wěn)定狀態(tài)。直腸是中華蟾蜍重吸收水分和外排食物殘渣的主要通道，該處較多的SS細胞可能對腸黏膜組織起保護作用。

綜上所述，登陸后同一年齡組中華蟾蜍消化道各部位SS細胞的形態(tài)學(xué)特征和分布密度不盡相同，不同年齡組空腸和直腸SS細胞的密度有明顯的增齡變化，這可能是不同年齡段中華蟾蜍適應(yīng)各自消化生理狀態(tài)的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)之一。