鄭捷，方慶全，涂金花

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廈門 361003）

EBV encoded RNA（EBER）是Epstein-Barr virus（EBV，EB病毒）編碼的小RNA，該病毒不僅廣泛潛伏于健康人群，而且是一些非腫瘤疾病如傳染性單核細(xì)胞增多癥等的病因。更重要的是，EB病毒與越來越多的腫瘤性疾病密切相關(guān)[1，2]。EBER原位雜交法因其準(zhǔn)確的定位、極高的特異性和靈敏性已成為公認(rèn)的EB 病毒標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，并作為病理輔助診斷的重要依據(jù)之一在日常工作中應(yīng)用越來越廣泛。由于原位雜交檢測(cè)步驟多，容易受各種因素（如組織標(biāo)本的預(yù)處理、標(biāo)本類型、酶的消化程度、雜交后洗滌等）的影響。在臨床實(shí)際工作中對(duì)骨髓活檢組織行EBER原位雜交檢測(cè)時(shí)，常因組織脫片或者染色結(jié)果不穩(wěn)定需要進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。為此，本研究通過實(shí)驗(yàn)，從脫鈣方法、蛋白酶K消化時(shí)間、抗體孵育溫度三個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，摸索較佳的檢測(cè)條件。

材料與方法

1 標(biāo)本來源

收集廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2014年5月—2018年5月間確診為EB病毒相關(guān)疾病且標(biāo)本類型為骨髓活檢組織的病例35例。其中NKT細(xì)胞淋巴瘤18例，EBV相關(guān)淋巴組織增殖性疾病17例。所有標(biāo)本均經(jīng)l0%中性福爾馬林固定不少于6h。

2 設(shè)備與試劑

設(shè)備：原位雜交儀為Thermo BriteTM公司S500-24 型；

試劑：原位雜交檢測(cè)試劑盒購自福建泰普公司。脫鈣液的配置：①10%硝酸脫鈣液：硝酸10ml加入90 ml蒸餾水；②強(qiáng)酸混合脫鈣液配制方法：10%中性福爾馬林500ml與95%乙醇500ml混合后，加入甲酸200ml，最后緩慢加入濃鹽酸150ml；③ 改良EDTA脫鈣液配制方法：250g乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）溶于1350ml磷酸鹽緩沖液（PBS），待完全溶解后加入40%甲醛150ml，最后加入適量氫氧化鈉（NaOH），將pH值調(diào)到7.0左右[3]。

3 方法

3.1 脫鈣方法及脫鈣終點(diǎn)的判定

將選取的35例標(biāo)本每例分為三段，分別放入三種不同的脫鈣液室溫下進(jìn)行脫鈣：A組用10%硝酸脫鈣液脫鈣1～1.5h后取出流水沖洗30min；B組用強(qiáng)酸混合脫鈣液脫鈣2-3h后流水沖洗30min；C組用改良EDTA脫鈣液脫鈣20～24h后流水沖洗30min～1h。骨髓組織浮起，以尖鑷探測(cè)骨髓活檢組織變軟或大頭針能輕松刺入組織視為脫鈣完成[4]。

3.2 不同脫鈣液脫鈣后的骨髓活檢組織行EBER原位雜交檢測(cè)

①組織脫水與制片：將脫鈣完成后的A、B、C三組骨髓活檢標(biāo)本放入自動(dòng)脫水機(jī)中脫水、透明、浸蠟，包埋。制片時(shí)將組織粘附于APES處理的防脫載玻片，厚度為3μm，60～70℃烤片1h，脫蠟。②蛋白酶K消化：甩干切片，將組織周圍液體用濾紙擦干，滴加蛋白酶K與PBS按1×25比例配制的酶工作液，室溫孵育5min，蒸餾水洗1×1min。③雜交:滴加20μl探針/切片，加蓋玻片，原位雜交儀55℃變性 60～90min，37℃雜交 4～16h。48℃ PBS 緩沖液浸泡，移去蓋玻片后PBS繼續(xù)浸泡洗滌3×5min。④信號(hào)放大和顯色: 每張切片分別滴加地高辛染色液試劑A, 37℃孵30min，37℃ PBS浸泡3×2min；試劑B室溫孵育30min，PBS浸泡3×2min；試劑C室溫30min，PBS浸泡3×2min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。比較A、B、C三組的脫片率、切片質(zhì)量、雜交陽性信號(hào)的定位與強(qiáng)度、背景清晰度。

3.3 不同蛋白酶K消化時(shí)間的骨髓活檢組織行EBER原位雜交檢測(cè)

將C組用改良EDTA脫鈣液脫鈣的組織蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片3片，厚度3μm，隨機(jī)抽取組成D、E、F四組，分別進(jìn)行5min、9min、13min間隔4min的梯度消化，其余操作步驟同C組，比較D、E、F三組的脫片率、雜交陽性信號(hào)的定位與強(qiáng)度、背景清晰度。

3.4 不同抗體孵育溫度下的骨髓活檢組織行EBER原位雜交檢測(cè)

將C組改良EDTA脫鈣液脫鈣的組織蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片2片，厚度3μm，蛋白酶K消化9min后，分兩組進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。G組：滴加試劑A置于37℃水浴箱孵育30min，滴加試劑B室溫孵育20min，滴加試劑C室溫孵育 30min；F組：試劑A孵育30min、試劑B孵育20min、試劑C 孵育30min均在37℃水浴箱中進(jìn)行，比較G、F兩組雜交陽性性號(hào)的定位與強(qiáng)度、背景清晰度。

4 EBER原位雜交的判讀與染色質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)胞核棕黃色為陽性著色，胞漿和胞膜著色不能視為陽性，只有見核分裂時(shí)可以出現(xiàn)胞漿陽性著色[5]。設(shè)定組織脫片率、切片質(zhì)量、雜交陽性信號(hào)的位置與強(qiáng)度、背景是否清晰有無黃染四項(xiàng)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：①切片質(zhì)量（100分）：切片時(shí)組織相對(duì)較軟，基本能完整切片，不影響診斷，減1～10分；切片時(shí)感覺較硬，部分有沙粒感，切片不夠平整，不影響診斷，減11～30分；切片時(shí)刀片磨損嚴(yán)重，肉眼可見明顯刀痕，組織皺縮，無法制成完整切片，影響診斷，減31～100分。②雜交陽性信號(hào)的定位與強(qiáng)度（100分）：陽性信號(hào)定位準(zhǔn)確，著色較淡，低倍鏡下可分辨，不影響診斷，減1～10分；陽性信號(hào)定位較準(zhǔn)確，著色低倍鏡下不易觀察，需轉(zhuǎn)換至高倍鏡下仔細(xì)辨認(rèn)，不影響診斷，減11～30分；陽性信號(hào)定位不準(zhǔn)確，著色太弱，無法準(zhǔn)確判讀，減31～100分。③背景清晰度（100分）：陽性與陰性細(xì)胞對(duì)比鮮明，雜交背景輕微黃染，不影響診斷，減1～10分；陽性與陰性細(xì)胞對(duì)比度不佳，雜交背景出現(xiàn)不同程度黃染，但仍可作出診斷，減11～31分，雜交背景黃染嚴(yán)重，影響診斷，減31～100分。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生閱片進(jìn)行雙盲評(píng)分，每項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)為評(píng)分的均值。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用率的比較，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同脫鈣方式對(duì)骨髓活檢組織行原位雜交檢測(cè)的影響

A、B、C三組切片原位雜交染色質(zhì)量結(jié)果比較見表1。比較三組脫片率顯示，A組（42.9%）的脫片率明顯高于B（14.3%）、C（11.4%）兩組的脫片率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）。用三種脫鈣液脫鈣的骨髓活檢組織基本均能完整切片，A組切片時(shí)部分會(huì)有沙粒感，肉眼可見明顯刀痕，B、C兩組切片時(shí)組織相對(duì)較軟，更易切片。雜交陽性信號(hào)定位與強(qiáng)度得分C組均顯著高于A、B兩組，A組原位雜交染色陽性細(xì)胞定位較模糊，信號(hào)弱甚至不顯示，B組陽性細(xì)胞定位準(zhǔn)確，可是陽性信號(hào)的強(qiáng)度不如C組。三組背景染色均較清晰，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。比較A、B、C三組原位雜交染色質(zhì)量（圖1）可見用改良EDTA脫鈣液脫鈣的骨髓活檢標(biāo)本行原位雜交染色效果最好。

2 不同蛋白酶K消化時(shí)間對(duì)骨髓活檢組織行原位雜交檢測(cè)的影響

比較D、E、F三組脫片率，F(xiàn)組（42.9%）明顯高于D組（8.6%）和E組（14.3%）（P＜0.01）。D、E、F三組雜交陽性信號(hào)的定位與強(qiáng)度得分分別為67.5±2.5、82.5±1.2、81.5±1.0，D 組與 E、F 組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。D、E、F三組背景清晰度指標(biāo)得分為 84.7±1.2、85.3±1.0、62.1±2.4，F(xiàn)組蛋白酶K消化時(shí)間長(zhǎng)，背景出現(xiàn)不同程度黃染，與D、E組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。比較E、F三組原位雜交染色質(zhì)量（圖2）可見消化時(shí)間為9min組的切片，雜交效果最好，陽性細(xì)胞著色深，定位準(zhǔn)確，背景干凈，結(jié)果清晰易辨。

圖1 不同脫鈣方式對(duì)骨髓活檢組織行原位雜交檢測(cè)的影響。A，A組組織脫片嚴(yán)重，陽性細(xì)胞信號(hào)不顯示；B，B組組織輕微脫片，陽性信號(hào)定位準(zhǔn)確，信號(hào)較弱；C，C組組織無脫片情況，陽性信號(hào)定位準(zhǔn)確，陽性信號(hào)強(qiáng)；比例尺，50μm。Fig.1 Effect of different decalci fication methods on the in situ hybridization staining in bone marrow biopsy tissues. A, group A had severe tissue detachment from the slide and no positive cell signal was displayed; B, tissue in group B was slightly detached and the positive signal was accurately located but relatively weak; C, there was no detachment in the tissue sections of group C, and the positive signal was accurately located and strong; scale bar, 50μm

3 不同抗體孵育溫度對(duì)骨髓活檢組織行原位雜交檢測(cè)的影響

G、F組雜交陽性信號(hào)定位與強(qiáng)度得分分別為79.3±0.8、89.2±0.5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），背景清晰度得分分別為89.2±0.5、82.2±0.5，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，試劑A孵育30min、試劑B孵育20min、試劑C 孵育30min均在37℃水浴箱中進(jìn)行原位雜交檢查效果更佳。

表1 不同脫鈣方式下的骨髓活檢組織原位雜交染色質(zhì)量評(píng)分Tab.1 Quality score of in situ hybridization staining in bone marrow biopsy tissues under different decalci fication methods

圖2 不同蛋白酶K消化時(shí)間對(duì)骨髓活檢組織行原位雜交檢測(cè)的影響。A，E組陽性細(xì)胞著色深，背景清晰；B，F(xiàn)組背景出現(xiàn)不同程度黃染；比例尺，5μmFig. 2 Effect of different protease K digestion time on the in situ hybridization staining in bone marrow biopsy tissues. A, the positive cells in group E were deeply stained and accurately positioned with a clear background; B, the background of group F showed different degrees of yellow staining; scale bar, 25μm

討 論

EBER原位雜交檢測(cè)是在分子水平上用EBER特有序列設(shè)計(jì)的單鏈DNA探針與靶序列按堿基配對(duì)原則進(jìn)行特異性結(jié)合,從而檢測(cè)出EB病毒。骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)特殊，富含有大量的無機(jī)鈣鹽，骨組織在制片前必須脫鈣去除骨中的鈣質(zhì)，脫鈣的同時(shí)還要盡量減少骨組織結(jié)構(gòu)的損害及核酸分子的丟失，所以脫鈣方式至關(guān)重要，脫鈣液選擇不當(dāng)會(huì)對(duì)原位雜交的結(jié)果產(chǎn)生極大影響。10%硝酸脫鈣液是目前作為病理工作中常用的脫鈣液，脫鈣速度快能力強(qiáng)，但對(duì)細(xì)胞核和組織結(jié)構(gòu)影響較大，對(duì)組織細(xì)胞mRNA破壞較大。強(qiáng)酸混合脫鈣液的脫鈣能力不及硝酸，對(duì)于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞性以及組織細(xì)胞mRNA成分的影響小于硝酸脫鈣液，但酸類脫鈣液均有脫鈣程度不易控制的弱點(diǎn)，脫鈣不足難以制片，脫鈣過度易導(dǎo)致細(xì)胞溶解和組織破壞。EDTA是一種優(yōu)良的鈣螯合劑，性質(zhì)溫和，能有效的保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)。吳鴻雁等[6]通過對(duì)比硝酸、EDTA和新型進(jìn)口脫鈣劑Rapidcal三種不同脫鈣液在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本的熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)中的表現(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，硝酸脫鈣液處理后的標(biāo)本染色效果較差，EDTA脫鈣液處理的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本表現(xiàn)出優(yōu)秀的標(biāo)本質(zhì)量。但EDTA脫鈣時(shí)間長(zhǎng)（4～6周）極大限制了EDTA脫鈣劑的臨床應(yīng)用。因此本研究對(duì)EDTA脫鈣液進(jìn)行改良，運(yùn)用了EDTA-2Na并加入40%甲醛固定液，固定脫鈣同時(shí)進(jìn)行，原位雜交染色質(zhì)量得到了明顯提高。

除了脫鈣方式，酶消化也是原位雜交檢測(cè)成功與否的關(guān)鍵。蛋白酶K消化組織的目的是去除靶核酸周圍的蛋白質(zhì)，增加組織的通透性，暴露靶基因，利于探針滲透，增強(qiáng)雜交信號(hào)強(qiáng)度[7,8]。蛋白酶K消化的關(guān)鍵則是對(duì)消化時(shí)間的把控。本研究通過對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，延長(zhǎng)蛋白酶K消化時(shí)間至9min的骨髓切片原位雜交染色效果最好。

溫度是影響抗原抗體結(jié)合的重要因素，原則上孵育時(shí)間應(yīng)根據(jù)溫度的高低進(jìn)行調(diào)整，溫度低延長(zhǎng)孵育時(shí)間，溫度高相應(yīng)縮短孵育時(shí)間，但在實(shí)際工作中，室溫難以調(diào)整無法標(biāo)準(zhǔn)化，因此本研究將孵育過程更改成在37℃水浴箱中進(jìn)行，一定程度上提高了染色效果。

除了骨髓活檢標(biāo)本脫鈣方式、酶消化時(shí)間、滴加地高辛染液的溫度外，技術(shù)員還應(yīng)重視實(shí)驗(yàn)操作過程中的細(xì)節(jié)，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。例如：①滴加蛋白酶K時(shí)應(yīng)甩干切片，否則蛋白酶被組織上殘留的水份稀釋，會(huì)影響消化的效果；②滴加雜交液后用封片劑進(jìn)行封邊，不但可以防止雜交液揮發(fā)也可以節(jié)約雜交液的用量；③用免疫組化油筆圈出抗體滴加范圍，防止抗體溢到組織邊緣，造成“邊緣效應(yīng)”。

綜上所述，通過優(yōu)化骨髓活檢組織的脫鈣方式，蛋白酶K消化時(shí)間，抗體孵育溫度可顯著降低組織的脫片率，提高EBER原位雜交染色質(zhì)量，使結(jié)果穩(wěn)定性更好，有助于病理醫(yī)生更準(zhǔn)確地進(jìn)行EBV相關(guān)疾病診斷和鑒別診斷。