劉 源, 隋正紅??, 劉昊昕, Sadaf RIAZ,2

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266003; 2. Department of Microbiology,University of Veterinary and Animal Sciences, Lahore 54660, Pakistan)

鏈狀亞歷山大藻(Alexandriumpacificum)作為重要的赤潮甲藻，在全球范圍內(nèi)分布廣泛，對(duì)由其引發(fā)的赤潮的機(jī)理的研究受到了研究者的廣泛關(guān)注。研究表明，氮、磷濃度的升高對(duì)該藻的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[1]。鐵、錳等微量元素是觸發(fā)塔瑪亞歷山大藻爆發(fā)性增殖的重要因子之一，同樣在鏈狀亞歷山大藻中，錳濃度的提升(18～36 μg/L)，使得其生長(zhǎng)速率也隨之上升。Laabir等的研究發(fā)現(xiàn)光照強(qiáng)度從10～90 μmol photons·m-2·s-1的提高，對(duì)鏈狀亞歷山大藻的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[2-3]。由于甲藻基因組巨大且復(fù)雜，目前的研究發(fā)現(xiàn)鏈狀亞歷山大藻基因組在60 G左右[4]，因此在研究基因調(diào)控機(jī)制方面對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和研究就顯得更為重要。

表達(dá)譜及轉(zhuǎn)錄組通過篩選不同條件下差異表達(dá)基因進(jìn)行后續(xù)分析，所獲得的信息往往是碎片化的，可能會(huì)忽略不同處理或不同組織間基因的表達(dá)存在的內(nèi)在聯(lián)系或相關(guān)性。WGCNA以比較轉(zhuǎn)錄組或表達(dá)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，是一種從高通量數(shù)據(jù)中挖掘模塊信息的算法。與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組分析重點(diǎn)關(guān)注差異表達(dá)基因不同，WGCNA分析采用皮爾遜相關(guān)系數(shù)或其他統(tǒng)計(jì)學(xué)方法衡量基因間的表達(dá)關(guān)系，從而構(gòu)建基因共表達(dá)模塊(Module)，其分析可以覆蓋整個(gè)轉(zhuǎn)錄組，并將復(fù)雜的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸納整理，從而對(duì)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)行補(bǔ)充并獲取新的發(fā)現(xiàn)。在高等植物中，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序找到了羽衣甘藍(lán)不同組織的芥子油苷的代謝的相關(guān)基因，隨后對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的相關(guān)合成基因進(jìn)行WGCNA分析發(fā)現(xiàn)，根以及衰老的葉子可能是芥子油合成發(fā)生的主要組織[5]。WGCNA理論最早在2005年提出，隨后在理論的基礎(chǔ)上完成了基于R語(yǔ)言完成相關(guān)軟件包的開發(fā)[6]。在WGCNA的分析過程中，首先構(gòu)建基因共表達(dá)模塊(Module)，基因模塊中含有一組具有似表達(dá)模式的基因。模塊中的樞紐基因(Hub gene)作為模塊中與其他基因連接最緊密的基因往往決定了一個(gè)模塊的特性，更容易發(fā)現(xiàn)與性狀相關(guān)的生物學(xué)意義。

WGCNA被廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)研究方面。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究中，通過對(duì)100多位患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的WGCNA分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)癌癥相關(guān)的基因模塊，而該模塊的樞紐基因也成為了治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的關(guān)鍵靶基因[7]。此外，在阿爾茲海默癥、骨質(zhì)疏松癥等的研究中[8-9]，也找到了與治病相關(guān)聯(lián)的基因及治療的靶點(diǎn)。在植物中，通過WGCNA分析在擬南芥中找到了參與中種子萌發(fā)的基因模塊，并由此對(duì)種子萌發(fā)過程中基因調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了深入的研究[10]。在蘋果中，利用WGCNA分析找到了與蘋果酸味產(chǎn)生相關(guān)的基因模塊。

本研究通過模擬赤潮爆發(fā)的條件對(duì)鏈狀亞歷山大藻進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序，利用表達(dá)譜測(cè)序后得到的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)，計(jì)算基因間的相關(guān)性，從而構(gòu)建基因共表達(dá)模塊，并將模塊與鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長(zhǎng)(EG)相關(guān)聯(lián)，對(duì)顯著性相關(guān)的模塊內(nèi)的樞紐基因進(jìn)行篩選并進(jìn)行功能富集分析，以探索鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長(zhǎng)的分子機(jī)制。

1 鏈狀亞歷山大藻表達(dá)譜測(cè)序

1.1 藻種來源及培養(yǎng)

鏈狀亞歷山大藻藻株來源于中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。具體培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)基：f/2培養(yǎng)基(不加硅)；光照強(qiáng)度：30 μmol·m-2·s-l；溫度：(20±1)℃；光暗周期：12 h︰12 h。

1.2 鏈狀亞歷山大藻的處理及藻細(xì)胞收集

鏈狀亞歷山大藻于f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將其中生長(zhǎng)活力較好的藻在黑暗條件下進(jìn)行48 h同步化處理，使其處于同一生長(zhǎng)時(shí)期。同步化完成后以2×106個(gè)/L的濃度將藻接種于高磷高錳(M)、高光(G)、低氮(N)、低磷(P)以及正常培養(yǎng)(C)這五個(gè)處理?xiàng)l件下進(jìn)行培養(yǎng)(見表1)，每個(gè)處理?xiàng)l件設(shè)置3個(gè)平行。

隨后在鏈狀亞歷山大藻生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(第12天)用除菌方法收集藻細(xì)胞，方法如下：在20 ℃條件下，用經(jīng)過無菌處理的10 μm孔徑篩絹過濾藻液，每過濾100 mL藻液用300 mL相應(yīng)的無菌培養(yǎng)基進(jìn)行沖洗，對(duì)沖洗后的藻液用50 mL無菌培養(yǎng)基(含有0.05%Tween-80和0.01 mol/L EDTA)懸浮30 min，超聲破碎1 min(50 w，超聲時(shí)間5 s，間隔時(shí)間5 s)，隨后用溶菌酶(0.5 mg/mL)在20 ℃下處理10 min，加入0.25% SDS處理10 min，用相應(yīng)的無菌培養(yǎng)基沖洗，去除試劑殘留。隨后除菌后的藻液經(jīng)0.01%的吖啶橙染色2 min后，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察[11]，篩選其中的無菌樣品進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 表達(dá)譜所需樣品的處理?xiàng)l件Table 1 Samples used for DGE analysis

收集無菌處理后的鏈狀亞歷山大藻，每個(gè)處理?xiàng)l件的1個(gè)平行即為1個(gè)樣品，每個(gè)樣品中約含5×106個(gè)藻細(xì)胞，共計(jì)15個(gè)樣品保存在液氮中，用于后續(xù)RNA文庫(kù)的構(gòu)建。

1.3 總RNA的提取及文庫(kù)構(gòu)建

1.3.1 總RNA的提取及檢測(cè) 采用RNAiso Plus (Trizol) (TaKaRa)法進(jìn)行對(duì)15個(gè)樣品的總RNA進(jìn)行提取，得到的RNA用DNase I(TaKaRa)進(jìn)行DNA消化，并用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳150 V，10 min進(jìn)行檢測(cè)，用Nano Drop2000進(jìn)行RNA濃度和純度檢測(cè)。

1.3.2 文庫(kù)構(gòu)建 使用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina(NEB)試劑盒按照說明書步驟進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建。

用Oligo(dT)磁珠對(duì)總RNA中的mRNA進(jìn)行富集，用Fragmentation buffer將mRNA隨機(jī)打斷成短片段，利用六堿基隨機(jī)引物合成第一條cDNA鏈，隨后加入dNTPs、DNA polymerase I、RNaseH合成第二條鏈。連接測(cè)序接頭，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，增加模板量，構(gòu)建cDNA測(cè)序文庫(kù)。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

對(duì)構(gòu)建的15個(gè)cDNA文庫(kù)用Illumina Genome Analyzer進(jìn)行單末端100 bp測(cè)序。采用FastQC(v0.11.5)軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，隨后用FASTX-Toolkit(v0.0.6)去除接頭序列，去除N堿基所占比例大于10%的序列，去除低質(zhì)量序列，得到Clean reads。

2 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

2.1 WGCNA分析流程

分析流程見圖1。

圖1 加權(quán)基因共表達(dá)分析流程Fig.1 The process of WGCNA

2.2 WGCNA分析方法

數(shù)據(jù)預(yù)處理以實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)測(cè)序得到的比較轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(SRX368254)為參考序列，通過軟件RSEM(v1.3.0，以期望最大值算法為基礎(chǔ))，計(jì)算表達(dá)譜所有reads的表達(dá)量情況[12]。

利用WGCNA軟件包中的pickSoftThreshold函數(shù)進(jìn)行軟閾值的計(jì)算，軟閾值的標(biāo)準(zhǔn)是使共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)要符合無尺度分布[13-14]。

利用R語(yǔ)言的moduleEigengenes函數(shù)計(jì)算基因模塊的特征向量基因，模塊特征向量基因代表了模塊內(nèi)所有基因的一種表達(dá)模式，再引入樣品的特征，計(jì)算特征向量基因與樣品特征之間的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)越高代表模塊與樣品特征越關(guān)聯(lián)，對(duì)其中顯著相關(guān)模塊進(jìn)行后續(xù)的模塊基因表達(dá)和功能富集分析。利用plotME和barplot函數(shù)將顯著相關(guān)模塊中的基因依據(jù)其在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)量進(jìn)行聚類分析，并繪制各個(gè)模塊的特征向量基因在不同處理?xiàng)l件下的柱狀圖以分析其表達(dá)情況。

對(duì)與性狀顯著相關(guān)的每個(gè)模塊利用R語(yǔ)言包ClusterProfiler(v3.6.0)中的enrichKEGG函數(shù)進(jìn)行KEGG富集分析。利用基于基因顯著性和模塊身份的函數(shù)NetworkScreening計(jì)算基因與模塊的相關(guān)性，以相關(guān)性q值為基礎(chǔ)進(jìn)行樞紐基因的篩選。采用Cytoscape軟件中的BinGO插件，對(duì)與性狀顯著相關(guān)模塊的樞紐基因進(jìn)行GO富集分析[16]，富集分析的顯著性水平p<0.05。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)中的顯著性水平的標(biāo)準(zhǔn)為p<0.001，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率 (False discovery rate，F(xiàn)DR)對(duì)p值進(jìn)行驗(yàn)證得到q值，用q<0.05來排除假陽(yáng)性。

3 結(jié)果

3.1 不同處理?xiàng)l件下鏈狀亞歷山大藻的生長(zhǎng)

對(duì)五個(gè)處理?xiàng)l件下的鏈狀亞歷山大藻進(jìn)行隔天計(jì)數(shù)并繪制生長(zhǎng)曲線(見圖2)，以觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，確定取樣時(shí)間。通過繪制的生長(zhǎng)曲線可以看出，在高磷高錳以及高光的誘導(dǎo)條件下，鏈狀亞歷山大藻的生長(zhǎng)速率以及細(xì)胞數(shù)量都高于其他處理?xiàng)l件，表現(xiàn)出了爆發(fā)性生長(zhǎng)的特征，而在低氮和低磷處理?xiàng)l件下，該藻的生長(zhǎng)速率較慢，通過顯微鏡觀察在15天后，該藻開始逐漸衰亡，出現(xiàn)了大量的死細(xì)胞，通過生長(zhǎng)曲線確定選取第12天作為取樣時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同培養(yǎng)條件下鏈狀亞歷山大藻生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of A. pacificum under five treatments

3.2 WGCNA數(shù)據(jù)的預(yù)處理及去除離群樣本

將15個(gè)樣品的表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，去除低表達(dá)量(RPKM值低于3.57)的基因，并篩選不同處理?xiàng)l件下，基因表達(dá)量方差較大的前25%的基因(表明在不同處理間變異性較高)，隨后利用R語(yǔ)言中的WGCNA軟件包gsg數(shù)據(jù)過濾去除離群值，共得到16 326個(gè)基因用于網(wǎng)絡(luò)基因的構(gòu)建。

對(duì)15個(gè)樣品進(jìn)行聚類分析，繪制聚類圖，以檢驗(yàn)樣品組間的相關(guān)性，去除離群樣品，并依據(jù)樣品的處理?xiàng)l件，標(biāo)注其生物學(xué)特征。通過模擬赤潮爆發(fā)的條件，在培養(yǎng)過程中，鏈狀亞歷山大藻在高磷高錳以及高光的誘導(dǎo)條件下的生長(zhǎng)速率和細(xì)胞總數(shù)要顯著高于其他3個(gè)處理?xiàng)l件，表現(xiàn)出了爆發(fā)性生長(zhǎng)的特性，因此將高磷高錳誘導(dǎo)以及高光誘導(dǎo)兩個(gè)處理?xiàng)l件作為爆發(fā)性生長(zhǎng)的樣品特征(Explosive growth，EG)。聚類分析顯示，沒有離群樣本的存在(見圖3)，15個(gè)樣品組間的相關(guān)性較好，均可以用于后續(xù)的分析。圖中紅色代表高光和高磷高錳處理的爆發(fā)性生長(zhǎng)條件。

3.3 基因共表達(dá)模塊的構(gòu)建

在確定軟閾值后，依據(jù)確定值進(jìn)行基因模塊的構(gòu)建。首先計(jì)算兩兩基因間的相似性系數(shù)以及相異度，從而構(gòu)建層次聚類樹。最終得到35個(gè)相關(guān)性基因模塊(見圖4)，不同的顏色代表不同的基因共表達(dá)模塊，灰色模塊為未被分配的基因。

統(tǒng)計(jì)得到的各個(gè)基因模塊的基因個(gè)數(shù)，在這35個(gè)基因模塊中，基因數(shù)目從32到2 812個(gè)不等(見圖5)。

3.4 基因模塊與性狀的關(guān)聯(lián)分析

將每個(gè)基因模塊的特征向量基因與樣品的特征相關(guān)聯(lián)，從而找到與樣品特征密切相關(guān)的基因模塊。圖中顏色越紅代表顯著相關(guān)性越高，以p<0.001為顯著性相關(guān)的篩選標(biāo)準(zhǔn)，分析得到了與鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長(zhǎng)(EG)顯著性相關(guān)的6個(gè)模塊，分別是blue4(0.79，p=8e-05)、blue(0.74，p=4e-04)、darkseagreen3(0.7，p=0.001)、firbrick3(0.79，p=8e-05)、black(0.92，p=5e-08)、darkgrey(0.82，p=3e-05)(見圖6)。

圖3 15個(gè)樣品聚類結(jié)果及樣品特征Fig.3 The phylogenetic tree and the information of the 15 samples

(Dynamic Tree Cut代表初步識(shí)別的基因模塊；Merged Dynamic為融合相似模塊后的基因表達(dá)模塊。Dynamic Tree Cut represent the initial identification of the gene module，merged dynamic represent merged similar modules. )

圖4 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)聚類樹
Fig.4 WGCNA cluster tree for the samples

3.5 與鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長(zhǎng)相關(guān)的共表達(dá)模塊

基于基因模塊的特征向量基因與樣品特征關(guān)聯(lián)分析結(jié)果，對(duì)在高磷高錳誘導(dǎo)、高光誘導(dǎo)條件下6個(gè)顯著性相關(guān)模塊(P<0.001)的基因數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(見表2)。由表2可見，模塊blue4中包含的基因最多有2 812個(gè)，而darkgrey模塊最少有360個(gè)。對(duì)這6個(gè)模塊的基因及特征向量基因在表達(dá)譜15個(gè)處理?xiàng)l件下的相對(duì)表達(dá)量分別進(jìn)行熱圖層次聚類和柱狀圖分析，結(jié)果顯示這六個(gè)模塊在高磷高錳誘導(dǎo)以及高光誘導(dǎo)條件下均上調(diào)表達(dá)(見圖7)。

圖5 各模塊基因數(shù)分布Fig.5 Number of genes in the 35 modules

圖6 各模塊特征向量與樣品特征間的相關(guān)性分析Fig.6 Diagram of correlation between modules and sample treatment information

表 2 6個(gè)顯著性相關(guān)模塊的基因數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 The numbers of genes in 6 modules

對(duì)6個(gè)模塊的基因分別進(jìn)行KEGG富集分析，其中模塊blue4中的基因顯著富集到核糖體的生物合成、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)途徑(q<0.05)，而模塊black顯著富集到了光合作用中的碳固定途徑、磷酸戊糖途徑(q<0.05)(見圖8)。

以基因與性狀的相關(guān)性q值為基礎(chǔ)對(duì)各個(gè)模塊中的基因進(jìn)行排序，每個(gè)模塊中選取排序后前10%的基因作為樞紐基因，以6個(gè)顯著性相關(guān)模塊中的樞紐基因?yàn)檠芯繉?duì)象，進(jìn)行GO富集分析(見圖9)，圖中黃色越深代表富集越顯著，圓圈大小表示GO條目的層級(jí)關(guān)系(p<0.05)。在分子功能方面，樞紐基因顯著性富集在了結(jié)合活性(p=2.70e-6)，電子轉(zhuǎn)運(yùn)活性(p=5.20e-6)以及催化活性(p=3.20e-5)；在生物過程方面，樞紐基因富集在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(p=6.10e-6)，蛋白質(zhì)代謝(p=6.60e-6)，碳水化合物代謝(p=7.30e-6)以及大分子物質(zhì)的合成過程(p=8.20e-6)；在細(xì)胞組分方面，樞紐基因主要富集在核糖體(p=4.70e-5)、蛋白復(fù)合體(p=6.20e-5)以及核糖核蛋白復(fù)合體(p=8.20e-5)等。

(15個(gè)處理?xiàng)l件為低氮(N1、N2、N3)，低磷(P1、P2、P3)，正常培養(yǎng)(C1、C2、C3)，高磷高錳誘導(dǎo)(M1、M2、M3)和高光誘導(dǎo)(G1、G2、G3)。15 treatments contain low nitrogen(N1、N2、N3)，low phosphorus(P1、P2、P3)，normal condition(C1、C2、C3)，high phosphorus(M1、M2、M3)and hight light(G1、G2、G3).)

圖7 顯著性相關(guān)模塊的基因在表達(dá)譜15個(gè)處理?xiàng)l件下的聚類分析
Fig.7 Cluster analysis of the genes in 6 modules under 15 different treatments of DGE analysis

(Rich factor 是該模塊樞紐基因中位于該通路的基因數(shù)目與所有該通路的基因數(shù)的比值。a. Blue4模塊；b. Black模塊。Rich factor represent the ratio of the hub genes in this pathway and all the genes of this pathway. a. Blue4 module；b. Black module.)

圖8 模塊blue4和black的KEGG富集分析
Fig.8 KEGG enrichment analysis of module black

(a. 分子功能；b. 生物過程；c. 細(xì)胞組分。a. Molecular function; b. Biological process; c. Cellular component.)圖9 樞紐基因GO富集分析圖 Fig.9 GO enrichment analysis of hub genes

對(duì)富集到的GO條目中顯著性p<5e-4的基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(見表3)，在生物過程基因包括涉及蛋白代謝的伴侶蛋白和預(yù)測(cè)蛋白，涉及碳水化合物代謝的6磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶，涉及信號(hào)傳導(dǎo)的磷酸二酯酶(PDE)(同時(shí)富集在分子功能的催化活性)、鈣離子依賴性激酶(同時(shí)富集在分子功能鈣離子結(jié)合活性)，以及涉及翻譯過程的40s及60s核糖體蛋白(同時(shí)富集在細(xì)胞組分的核糖體上)；在分子功能方面基因涉及電子轉(zhuǎn)運(yùn)活性的光系統(tǒng)1的鐵硫中心，鐵氧還蛋白還原酶和紅素氧還蛋白，涉及蛋白結(jié)合活性的類泛素蛋白。

表3 爆發(fā)性生長(zhǎng)條件下樞紐基因GO富集結(jié)果(部分)Table 3 GO enrichment of hub genes in response to explosive growth of A. pacificum

續(xù)表3

GO編號(hào)及過程GO ID and process基因IDGene ID功能Functionp值p-value分子功能Molecular Function細(xì)胞組成CellularComponentElectron carrier activity (GO:0009055)Catalytic activity (GO:0003824)Protein binding (GO:0005515)Calcium ion binding (GO:0005509)Ribosome (GO:0005840)Algae_064-3_Unigene_BMK.26288photosystem I iron-sulfur center1.40e-8Algae_064-1_Unigene_BMK.49816ferredoxin oxidoreductase4.10e-7Algae_064-1_Unigene_BMK.42171Rubredoxin-22.70e-6Algae_064-1_Unigene_BMK.1603Calcium/calmodulin-dependent 3′,5′-cyclic nucleotide phosphodiesterase6.60e-8Algae_064-3_Unigene_BMK.29372hypothetical protein6.10e-6Algae_064-3_Unigene_BMK.44168small ubiquitin-like protein1.70e-5Algae_064-2_Unigene_BMK.30688protein kinase6.12e-6Algae_064-1_Unigene_BMK.10610calcium-dependent protein kinase7.50e-6Algae_064-3_Unigene_BMK.2010660S ribosomal protein4.10e-9Algae_064-3_Unigene_BMK.1520540S ribosomal protein4.90e-9Algae_064-3_Unigene_BMK.174060S ribosomal protein4.60e-5Algae_064-3_Unigene_BMK.1400240S ribosomal protein7.70e-5Algae_064-3_Unigene_BMK.1356940S ribosomal protein9.50e-5

對(duì)6個(gè)顯著相關(guān)模塊中q值排序前3的hub基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(見表4)，模塊blue4中包括60s核糖體蛋白亞基、核糖體蛋白，說明該模塊可能與核糖體相關(guān)。模塊Firebrick3中包括類形成蛋白、端錨聚合酶等。Darkgrey模塊中基因包括轉(zhuǎn)錄起始因子、泛素激活酶以及粘蛋白。Darkseagreen3模塊可能與蛋白質(zhì)的合成加工相關(guān)，基因包括多聚泛素、熱激蛋白(HSP)。Blue模塊包含光捕獲蛋白、細(xì)胞色素復(fù)合體b6f等，該模塊可能與電子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。模塊Black中的基因包括轉(zhuǎn)酮醇酶、甘油醛3磷酸脫氫酶以及輔酶A轉(zhuǎn)移酶蛋白家族。

表4 與爆發(fā)生長(zhǎng)顯著相關(guān)模塊前3個(gè)樞紐基因信息Table 4 The top 3 hub genes of modules significant correlate to explosive growth

續(xù)表4

分子Module基因Gene ID注釋Annotation藍(lán)色模塊Blue moduleAlgae_064-3_Unigene_BMK.26938Light-harvesting proteinAlgae_064-3_Unigene_BMK.88955Light-harvesting proteinAlgae_064-2_Unigene_BMK.6496cytochrome b6f complex黑色模塊Black moduleAlgae_064-2_Unigene_BMK.37578TransketolaseAlgae_064-3_Unigene_BMK.73675Ribulose-1,5-biphosphate carboxylaseAlgae_064-2_Unigene_BMK.61673Phosphoribulokinase

4 討論

在鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長(zhǎng)條件下，樞紐基因中的光捕獲蛋白以及細(xì)胞色素復(fù)合體b6f參與到了光合作用的電子傳遞過程，光捕獲蛋白捕獲光能并將其轉(zhuǎn)移到光系統(tǒng)中以開始光合作用的光反應(yīng)，同時(shí)光捕獲蛋白可以維持類囊體膜的結(jié)構(gòu)[17]?；贕O富集分析(見表3)，紅素氧還蛋白和鐵氧還蛋白氧化還原酶顯著富集在電子轉(zhuǎn)運(yùn)活性。紅素氧還蛋白屬于鐵硫蛋白家族，在光合作用和非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用，最初植物中的紅素氧還蛋白由擬南芥類囊體上分離得到[18]，隨后在聚球藻的研究中發(fā)現(xiàn)該蛋白可能參與光系統(tǒng)I的組裝，它的缺失將導(dǎo)致光系統(tǒng)I功能喪失[19]。在植物光合作用中，鐵氧還蛋白還原酶接受鐵氧還蛋白傳遞的電子使NADP+還原為NADPH，同時(shí)基于KEGG富集分析，顯著相關(guān)模塊的基因富集在光合作用碳固定途徑，而光合電子傳遞為其提供了所需的NADPH和ATP，保證了碳固定途徑的順利進(jìn)行?；趯?duì)模塊基因的GO及KEGG富集分析，以及對(duì)樞紐基因的分析，說明光合作用在鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長(zhǎng)方面起到重要作用。

樞紐基因中的40s以及60s核糖體蛋白亞基，在GO富集分析(見圖9)中顯著富集在生物過程中的翻譯過程以及細(xì)胞組分的核糖體中，基于KEGG分析(見圖8)參與了核糖體的生物合成，說明了核糖體的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)息息相關(guān)。

通過GO富集分析(見表3)，發(fā)現(xiàn)了與鈣離子結(jié)合活性相關(guān)的基因鈣離子依賴性激酶(CaMK)以及與信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的PDE，這兩個(gè)基因均受到鈣離子/鈣調(diào)蛋白信號(hào)通路的調(diào)控，從而參與到細(xì)胞周期調(diào)控中。PDE是一類催化水解環(huán)核苷酸(cAMP)的關(guān)鍵酶，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平，影響細(xì)胞的生理功能[20]，研究發(fā)現(xiàn)cAMP的含量隨著細(xì)胞周期的進(jìn)行而改變，在S期之前，其含量的變化與DNA的合成相關(guān)，在纖細(xì)裸藻中，cAMP含量的增加會(huì)抑制DNA的合成，使細(xì)胞分裂停在G2期，而其含量下降，細(xì)胞周期也會(huì)隨之恢復(fù)。鈣離子及鈣調(diào)蛋白信號(hào)通路參與了細(xì)胞內(nèi)眾多的生理過程，同時(shí)在細(xì)胞周期調(diào)控方面也起到了重要作用，受其調(diào)控的與細(xì)胞周期相關(guān)的CaMK和PDE的發(fā)現(xiàn)，說明了相關(guān)的信號(hào)通路在鏈狀亞歷山大藻細(xì)胞周期調(diào)控方面也有重要作用。

熱激蛋白常以分子伴侶的形式存在，作為保護(hù)蛋白與其他蛋白結(jié)合從而穩(wěn)定結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞中參與蛋白的合成、蛋白的翻譯后修飾以及蛋白質(zhì)的跨膜運(yùn)輸?shù)冗^程。其中Hsp90是真核生物中含量最豐富的蛋白之一，在真核生物中普遍存在，其活性受到ATP酶的調(diào)控，參與蛋白折疊、降解過程，與植物發(fā)育過程中參與多種酶以及激素受體的蛋白成熟過程，能促進(jìn)信號(hào)肽的成熟，促進(jìn)肽鏈的正確折疊，維持和穩(wěn)定蛋白構(gòu)象[21]。目前研究發(fā)現(xiàn)Hsp90參與到細(xì)胞周期調(diào)控，并受到鈣調(diào)蛋白的作用參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[22]。Hsp70參與新生肽鏈的合成，調(diào)控新生蛋白質(zhì)的折疊以及蛋白的跨膜運(yùn)輸?shù)冗^程[23]，在細(xì)胞快速生長(zhǎng)階段，需要大量蛋白質(zhì)的合成，而Hsp90和Hsp70在蛋白質(zhì)的合成加工方面的作用有助于保證蛋白質(zhì)的正確折疊。

通過對(duì)hub基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，大量的hub基因未被注釋功能或注釋為預(yù)測(cè)蛋白(Hypothetical protein)，如在blue4模塊中，對(duì)q值前20的hub基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并分析后發(fā)現(xiàn)，其中有11個(gè)基因未被注釋。雖然有未注釋蛋白存在，但同屬于一個(gè)模塊的基因在表達(dá)量上存在相關(guān)性，意味著這些基因在功能方面有相似性，可以由此來推測(cè)未注釋基因的功能。

通過分析比較表達(dá)譜數(shù)據(jù)，基于WGCNA分析，核糖體的合成、磷酸戊糖途徑、光合作用的碳固定途徑起到了重要的調(diào)控作用，同時(shí)在表達(dá)譜測(cè)序篩選得到的差異基因外，樞紐基因中與蛋白質(zhì)合成加工相關(guān)的熱激蛋白以及參與光合作用光反應(yīng)的熒光素結(jié)合蛋白以及電子傳遞蛋白的發(fā)現(xiàn)，更有助于完善鏈狀亞歷山大藻光合作用以及蛋白質(zhì)代謝的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步闡明這些調(diào)控機(jī)制對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響提供基礎(chǔ)。

5 結(jié)語(yǔ)

本研究以鏈狀亞歷山大藻模擬赤潮爆發(fā)條件下的表達(dá)譜數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，首次將WGCNA分析用于赤潮爆發(fā)的機(jī)制的研究中。依據(jù)WGCNA分析的流程構(gòu)建了基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，共得到了35個(gè)基因共表達(dá)模塊。將基因模塊與鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長(zhǎng)特征相關(guān)聯(lián)。通過功能富集分析以及對(duì)模塊中樞紐基因的功能分析，與爆發(fā)性生長(zhǎng)相關(guān)的樞紐基因涉及核糖體的生物合成、碳水化合物代謝(碳固定途徑、磷酸戊糖途徑)、光合作用光反應(yīng)的電子傳遞過程以及蛋白質(zhì)的合成和加工等，這些途徑為細(xì)胞的快速增殖提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)，樞紐基因中包含了大量的未知功能的基因，雖功能未知，但通過分析基因共表達(dá)模塊，這些基因在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)方面同樣存在重要作用，對(duì)這些基因的進(jìn)一步研究將有助于挖掘鏈狀亞歷山大藻爆發(fā)性生長(zhǎng)的潛在的分子機(jī)制。