付璐璐， 李思琦， 甄 毓， 米鐵柱

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071；3. 海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100；4. 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100)

近期研究中，厭氧氨氧化細(xì)菌16S rRNA(Amx-16SrRNA)基因的兩對(duì)特異性引物(Amx368F/Amx820R和Brod541F/Amx820R)在研究海洋、河口等生態(tài)環(huán)境中厭氧氨氧化細(xì)菌的豐度分布以及群落結(jié)構(gòu)時(shí)應(yīng)用較為廣泛[23-26]。據(jù)報(bào)道，Amx368F是定向擴(kuò)增厭氧氨氧化細(xì)菌所有屬的前引物，之前的研究發(fā)現(xiàn)，Amx368F可以十分高效地覆蓋厭氧氨氧化細(xì)菌[22, 27]，而B(niǎo)rod541F更專(zhuān)注于Ca. Scalindua屬，同時(shí)，后引物Amx820R側(cè)重于Ca. Scalindua屬、Ca. Brocadia屬和Ca. Kuenenia屬[3, 5](見(jiàn)表1)。Hong等[23]用Amx368F/Amx820R、Brod541F/Amx820R兩對(duì)引物在南海遠(yuǎn)海沉積物中檢測(cè)到的厭氧氨氧化細(xì)菌均為Ca. Scalindua屬。Hou等[24]用引物Amx368F/Amx820R在長(zhǎng)江口潮浸淺灘地沉積物中檢測(cè)到Ca. Scalindua,Ca. Brocadia,Ca. Kuenenia三個(gè)屬的厭氧氨氧化細(xì)菌。Zheng等[25]以引物Amx368F/Amx820R在長(zhǎng)江口及鄰近東黃海海域沉積物中檢測(cè)到Ca. Scalindua、Ca. Brocadia、Ca. Kuenenia和Ca.Anammoxoglobus四個(gè)屬。Chen等[26]以引物Brod541F/Amx820R在德國(guó)Scheld-Rhine Meuse三角洲鹽湖Grevelingen湖泊沉積物中檢測(cè)到厭氧氨氧化細(xì)菌優(yōu)勢(shì)類(lèi)群為Ca. Scalindua屬。

表1 引物名稱(chēng)、序列及覆蓋范圍

針對(duì)以上常用于研究海洋環(huán)境中厭氧氨氧化細(xì)菌的兩對(duì)特異性引物擴(kuò)增所得的群落結(jié)構(gòu)差異較大這一現(xiàn)狀，選擇這兩對(duì)引物對(duì)同一樣品檢測(cè)到的厭氧氨氧化細(xì)菌群落特征進(jìn)行比較分析。本研究基于高通量測(cè)序結(jié)果對(duì)長(zhǎng)江口及鄰近海域沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌的群落豐度、多樣性信息進(jìn)行分析，著重分析2對(duì)Amx-16S rRNA基因特異性引物對(duì)研究海域沉積物中的厭氧氨氧化細(xì)菌的覆蓋情況，比較2對(duì)引物在研究厭氧氨氧化細(xì)菌群落多樣性、豐度分布等群落特征的差異和優(yōu)劣，以期為后期實(shí)驗(yàn)中基因以及引物的選擇提供依據(jù)，為長(zhǎng)江口及鄰近海域沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌的分子生態(tài)學(xué)研究提供指導(dǎo)性參考，從而提高對(duì)海洋沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌研究的準(zhǔn)確性，促進(jìn)對(duì)河口生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過(guò)程的全面了解。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2011年7月29日—8月4日在長(zhǎng)江口鄰近海域(122°E～123.5°E，28°N～32°N)20個(gè)站位(見(jiàn)圖1)，采集樣品是深度為0～3 cm的表層沉積物。沉積物樣品放置在無(wú)菌封口袋中，用錫箔紙包裹后立即置于液氮中保存，到實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)于-80℃冰箱中保存。

1.2 DNA提取與引物特異性驗(yàn)證

用Power Soil DNA Isolation Kit(MO Bio，美國(guó))提取沉積物微生物基因組DNA，于-80℃保存，用于分子生態(tài)學(xué)研究。用下列引物(見(jiàn)表2)分別擴(kuò)增Amx-16S rRNA基因、功能基因hzo片段，并進(jìn)行回收純化。

1.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品與標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備以及樣品測(cè)定

將目的基因片段連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序后制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立qPCR體系，使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)試劑盒(Roche, Germany)進(jìn)行熒光定量PCR(qPCR)反應(yīng)(ABI7500, USA)，并于反應(yīng)體系中加入0.2 μg·μL-1牛血清蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

用引物Amx368F/Amx820R和Brod541F/Amx820R分別定量Amx-16S rRNA基因的拷貝數(shù)，引物hzo-hzo5F/hzo5R定量hzo基因的拷貝數(shù)，反應(yīng)體系為：質(zhì)粒DNA 2 μL，引物各0.6 μL，ROX 10 μL，BSA 0.2 μL，ddH2O 6.6 μL，反應(yīng)程序如表2。取2 μL樣品DNA按上述條件進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，每個(gè)DNA樣品設(shè)置3個(gè)平行，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品中Amx-16S rRNA基因2對(duì)引物以及功能基因hzo的拷貝數(shù)。

表2 熒光定量PCR引物與反應(yīng)程序

注：Amx-16S rRNA基因的兩對(duì)引物均采用兩步法，hzo基因采用三步法，分別進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。

Note:Two primers of Amx-16s rRNA gene were used in the two-step method andhzogene was used in the three-step method to condact qPCR experiments,respectively.

(圖中陰影部分分別為長(zhǎng)江口泥質(zhì)區(qū)、浙閩沿岸泥質(zhì)區(qū)(重繪自秦蘊(yùn)珊等，1987)。The shaded area means the muddy area in the Changjiang Estuary and Zhejiang-Fujian offshore (repainted by Qin et al., 1987).)

圖1 長(zhǎng)江口臨近海域采樣站位示意

Fig.1 Sampling sites in the Changjiang Estuaryandits adjacent area

1.4 454、IlluminaMiseq高通量測(cè)序及相關(guān)生物信息分析

用上述兩對(duì)引物分別擴(kuò)增Amx-16S rRNA基因，擴(kuò)增時(shí)在引物5’端加入barcode以區(qū)分不同樣品的序列，構(gòu)建擴(kuò)增子克隆文庫(kù)。由于測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增子目的基因片段長(zhǎng)度的要求，針對(duì)引物Amx368F/Amx820R采用454測(cè)序平臺(tái)對(duì)沉積物DNA進(jìn)行雙端(Paired-end)測(cè)序，同時(shí)對(duì)引物Brod541F/Amx820R采用Illumina Miseq PE250測(cè)序平臺(tái)對(duì)沉積物DNA進(jìn)行雙端測(cè)序。將原始下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換后，利用QIIME(Version 1.9.0, http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)篩選原始下機(jī)序列得到高質(zhì)量序列，用于后續(xù)分析。

在中產(chǎn)階層執(zhí)政的城邦中，中產(chǎn)階層的力量必須要么強(qiáng)大到超過(guò)另外兩個(gè)階層的力量之和，至少要強(qiáng)大到超出其中一個(gè)，這樣中產(chǎn)階級(jí)就可以聯(lián)合其他任一階層，而牢牢掌握住政權(quán)，使之表現(xiàn)出中產(chǎn)階層的公民政體的特點(diǎn)，而防止它滑向純粹的平民政體或純粹的寡頭政體這樣兩個(gè)極端。所以，中產(chǎn)階層執(zhí)政的政體是一個(gè)適中的政體，是“最優(yōu)秀的政體”[2](P146)。

使用Uparse軟件[29]對(duì)高質(zhì)量序列按97%序列相似度進(jìn)行OTU聚類(lèi)，選擇每個(gè)OTU的一條序列作為該OTU的代表序列，對(duì)代表序列進(jìn)行物種注釋后，分析物種的相對(duì)豐度。利用QIIME軟件分析各個(gè)高通量測(cè)序樣品的Alpha多樣性，繪制稀釋曲線。將每個(gè)OTU代表序列用Mega5.0軟件以鄰接法(Neighbour Joining, NJ)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。

1.5 基因序列登錄號(hào)

基于2對(duì)特異性引物(Amx368F/Amx820R和Brod541F/Amx820R)的高通量測(cè)序委托上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行。本研究獲得的Amx-16S rRNA基因序列在SRA上的登錄號(hào)分別為SRP112655:PRJNA394772(Amx368F/Amx820R)和SRP131428:PRJNA431658(Brod541F/Amx820R)。

2 結(jié)果與分析

選取2011年7—8月在東海所采集的4個(gè)站位(S13、S20、S31、S33)的表層沉積物樣品作為代表站位，其中S13站位于長(zhǎng)江口外泥質(zhì)區(qū)；S20站位于長(zhǎng)江口外非泥質(zhì)區(qū)；S31站位于浙閩沿岸泥質(zhì)區(qū)；S33站位于浙閩沿岸泥質(zhì)區(qū)外的外海，厭氧氨氧化細(xì)菌的豐度在考察站位中最高。通過(guò)厭氧氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因的454、Illumina高通量測(cè)序?qū)|海表層沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌群落特征進(jìn)行描述。

2.1 厭氧氨氧化細(xì)菌群落多樣性比較

將每個(gè)沉積物樣品(S13、S20、S31、S33)得到的高質(zhì)量序列，使用QIIME、Uparse等生物信息軟件對(duì)序列進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制，對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按序列相似度97%進(jìn)行OTU聚類(lèi)，選取每個(gè)OTU中的最長(zhǎng)序列為代表序列。通過(guò)GenBank序列比對(duì)，結(jié)果表明，質(zhì)控后的序列均為厭氧氨氧化細(xì)菌的序列。質(zhì)控后的高質(zhì)量序列條數(shù)和在相似度為97%下進(jìn)行聚類(lèi)，得到OTUs數(shù)及覆蓋度分布情況(見(jiàn)表3)。

表3 厭氧氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因的兩對(duì)引物的多樣性和豐富度參數(shù)

對(duì)于同一沉積物樣品，基于2對(duì)引物檢測(cè)到的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)的比較可以看出，引物Brod541F/Amx820R明顯高于引物Amx368F/Amx820R，從整體趨勢(shì)來(lái)說(shuō)，引物Brod541F/Amx820R檢測(cè)到的群落豐富度和多樣性都明顯高于引物Amx368F/Amx820R。

在4個(gè)表層沉積物樣品中，兩對(duì)引物Amx368F/Amx820R(引物1)、Brod541F/Amx820R(引物2)分別獲得92 007、156 931條優(yōu)質(zhì)序列，每個(gè)樣品對(duì)應(yīng)獲得的序列條數(shù)區(qū)間為(見(jiàn)表3)。以97%序列相似性對(duì)上述高質(zhì)量序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)，并采用RDP Classifier方法將OTU代表序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)、物種注釋?zhuān)瑒h除出現(xiàn)頻數(shù)為1(singletons)、無(wú)法聚類(lèi)到OTU的序列。經(jīng)隨機(jī)抽樣將測(cè)序深度均一化后，每個(gè)樣品兩對(duì)引物所得的OTUs個(gè)數(shù)分別介于54～73、349～2 199之間(見(jiàn)表3)。

Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)分別用于表征群落的多樣性和豐富度情況。Chao1指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高；Shannon和Simpson指數(shù)綜合考慮了群落的豐富度和均勻度，其指數(shù)值越高，表明群落的多樣性越高，一般而言，Shannon指數(shù)對(duì)群落豐富度以及稀有OTU較為敏感，而Simpson指數(shù)對(duì)均勻度和群落中的優(yōu)勢(shì)OTU更為敏感。由表3可知，兩對(duì)引物的Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)有較大差別，Brod541F/Amx820R引物的Chao1指數(shù)較大，說(shuō)明檢測(cè)到的厭氧氨氧化細(xì)菌菌群的豐富度較高；Brod541F/Amx820R引物的Simpson指數(shù)較大，說(shuō)明該引物檢測(cè)到的細(xì)菌菌群的多樣性較高且均勻度較好。在4個(gè)樣品每個(gè)基因測(cè)得序列的覆蓋度均在99%以上，說(shuō)明本研究所獲得的序列條數(shù)足以覆蓋樣品中厭氧氨氧化細(xì)菌的絕大多數(shù)物種信息，而不同站位采用不同引物測(cè)得的多樣性和豐富度不同。

如圖2所示，4個(gè)樣品的兩對(duì)引物的稀釋曲線除引物1的S31站外，均趨于平緩，說(shuō)明本研究測(cè)序條數(shù)足夠，測(cè)序深度選取合理。引物1的稀釋曲線是S13站首先趨于平緩，S31站是最后出現(xiàn)平緩趨勢(shì)；而對(duì)于引物2的情況是，S20站首先趨于平緩，S13站最后出現(xiàn)平緩趨勢(shì)，這與表2中的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)的高低變化相一致。

2.2 厭氧氨氧化細(xì)菌群落組成比較

將引物1通過(guò)454平臺(tái)和引物2通過(guò)Illumina Miseq平臺(tái)高通量測(cè)序所得OTU代表序列分別與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)并進(jìn)行物種注釋?zhuān)Y(jié)果表明，在門(mén)分類(lèi)水平上，引物1測(cè)得序列均屬浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)(見(jiàn)表4)。引物2可以檢測(cè)到浮霉菌門(mén)(Planctomycetacia)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、硝化螺旋菌門(mén)(Nitrospirae)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)等近40個(gè)門(mén)類(lèi)的細(xì)菌，而不僅僅是浮霉菌門(mén)(Planctomycetacia)(見(jiàn)表4)，厭氧氨氧化細(xì)菌所在的浮霉菌門(mén)(Planctomycetacia)的序列條數(shù)僅占總序列條數(shù)的44.1%。為便于分析，選取豐度最高的前30個(gè)OTUs進(jìn)行后續(xù)的相對(duì)豐度與系統(tǒng)發(fā)育分析。

(a、b分別對(duì)應(yīng)引物Amx368F/Amx820R、Brod541F/Amx820R的稀釋曲線。a and b represent the rarefaction curves of Primer Amx368F/Amx820R and Brod541F/Amx820R, respectively.)

圖2 不同引物所得厭氧氨氧化細(xì)菌群落的稀釋曲線

在綱分類(lèi)水平上，浮霉菌綱(Planctomycetacia)在引物1測(cè)序所得序列中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(>99%)，其他序列約占0～1%，分別屬于α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)、Pla3、Pla4和MD2896-B258等(見(jiàn)表4、圖3a)。引物2可以覆蓋到浮霉菌綱(Planctomycetacia)、放線菌綱(Actinobacteria)、α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)、硝化螺旋菌綱(Nitrospira)、黃桿菌綱(Flavobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、酸桿菌綱(Acidobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、Pla3、OM190等(見(jiàn)表4、圖3b)。

在屬分類(lèi)水平，引物1可以檢測(cè)到Ca.Scalindua、Ca.Brocadia兩個(gè)已知厭氧氨氧化細(xì)菌屬，和Oceanicella、W4以及浮霉菌綱的其它未培養(yǎng)厭氧氨氧化細(xì)菌(見(jiàn)表4、圖4a)。Ca.Scalindua在每個(gè)站位的相對(duì)豐度都在90%以上，為測(cè)序站位的優(yōu)勢(shì)屬，其他屬的厭氧氨氧化細(xì)菌相對(duì)豐度很低(見(jiàn)表4、圖4b)。

從排名前30的OTUs屬水平上看，引物2可以檢測(cè)到的優(yōu)勢(shì)菌群中，仍有較多非厭氧氨氧化細(xì)菌的菌群。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，已經(jīng)檢測(cè)到的厭氧氨氧化細(xì)菌有3個(gè)已知屬，分別為Ca.Scalindua、Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia以及一些未知的厭氧氨氧化細(xì)菌，但該對(duì)引物還檢測(cè)到了許多非厭氧氨氧化菌群的其他微生物類(lèi)群(見(jiàn)圖5、 6)，通過(guò)引物1檢測(cè)到的厭氧氨氧化細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬Ca.Scalindua僅占引物2測(cè)序所得總序列條數(shù)的43.7%，Ca.Brocadia、Ca.Kuenenia的相對(duì)豐度約為0.4%。在引物2覆蓋的豐度排名前30的OTUs中，存在大量非厭氧氨氧化細(xì)菌類(lèi)群。因而認(rèn)為，引物1較適合厭氧氨氧化細(xì)菌的分子生態(tài)學(xué)研究，而引物2不適合。

2.3 厭氧氨氧化細(xì)菌豐度比較

通過(guò)上述3對(duì)引物研究表層沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌豐度分布趨勢(shì)，對(duì)采樣站位的amx-16S rRNA基因和功能基因hzo進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，3對(duì)引物的分布趨勢(shì)一致，厭氧氨氧化細(xì)菌豐度分布趨勢(shì)大致表現(xiàn)為南部海域大于北部海域，近海海域大于遠(yuǎn)海海域(見(jiàn)圖7)。

圖3 引物1(a)、引物2(b)擴(kuò)增序列在綱分類(lèi)水平上的相對(duì)豐度

圖4 引物1(a)、引物2(b)擴(kuò)增序列在屬分類(lèi)水平上的相對(duì)豐度

Amx-16S rRNA基因引物1檢測(cè)的厭氧氨氧化細(xì)菌的豐度最高出現(xiàn)在S33站和最低是S22站；Amx-16S rRNA基因引物2檢測(cè)的厭氧氨氧化細(xì)菌的豐度最高出現(xiàn)在S31站和最低是S9站；功能基因hzo的豐度結(jié)果是S33站厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)最高，S1站最低。由qPCR結(jié)果可知，通過(guò)功能基因hzo定量厭氧氨氧化細(xì)菌的平均豐度明顯高于Amx-16S rRNA基因2對(duì)引物的結(jié)果，且由hzo基因量化的厭氧氨氧化細(xì)菌是Amx-16S rRNA基因引物1的2倍(P=0.000< 0.01,r= 0.969)(見(jiàn)圖8)，而與Amx-16S rRNA基因引物2的量化結(jié)果無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系(P=0.052 > 0.05)。Shimamura等[30]通過(guò)富集培養(yǎng)后宏基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，厭氧氨氧化細(xì)菌功能基因hzo有2個(gè)基因編碼hzoA和hzoB，厭氧氨氧化細(xì)菌基因組中功能基因hzo與16SrRNA基因數(shù)量上的2倍關(guān)系。引物1符合厭氧氨氧化細(xì)菌本身的基因數(shù)量關(guān)系。因而引物1更適合應(yīng)用于相關(guān)分子生態(tài)學(xué)研究。

圖5 長(zhǎng)江口及鄰近海域表層沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因(引物1)的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖6 長(zhǎng)江口及鄰近海域表層沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因(引物2)的系統(tǒng)發(fā)育分析

(圖a、b、c分別對(duì)應(yīng)引物Amx368F/Amx820R、Brod541F/ Amx820R、hzo5F/hzo5R覆蓋的厭氧氨氧化細(xì)菌的水平分布趨勢(shì)。a, b and c represent the horizontal distribution of Anammox bacterial abundance covered by Primer Amx368F/Amx820R, Brod541F/Amx820R and hzo5F/hzo5R, respectively.)

圖7 表層沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌豐度(cells/g(濕重))的水平分布
Fig.7 Horizontal distribution of Anammox bacterial abundance (cells/g(Wet weight)) in surface sediments

圖8 Amx-16S rRNA基因(引物1)和hzo基因

3 討論

自上1990年代厭氧氨氧化過(guò)程被發(fā)現(xiàn)[1, 31]以來(lái)，研究者在多種海洋低氧環(huán)境中[2, 13-14]均發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化細(xì)菌。以PCR為基礎(chǔ)的克隆文庫(kù)技術(shù)為主流的分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于厭氧氨氧化細(xì)菌群落信息的研究，從一定程度上揭示了厭氧氨氧化菌群的多樣性及其在各種生態(tài)環(huán)境中分布的廣泛性。但由于克隆文庫(kù)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作時(shí)挑選克隆數(shù)量的限制其測(cè)序深度，此種技術(shù)手段所得有效目的片段的序列條數(shù)通常在幾百條，對(duì)于環(huán)境樣品中菌群的覆蓋度較低，難以全面闡述菌群的群落多樣性信息。同時(shí)，克隆文庫(kù)技術(shù)自身的限制可能會(huì)使實(shí)驗(yàn)反映的群落信息存在一定的偏向性和偶然性，使獲得的厭氧氨氧化菌群多樣性信息的真實(shí)性降低。Dang等[19]、Hou等[24]、Zheng等[25]采用克隆文庫(kù)的技術(shù)手段先后對(duì)遼東灣及渤海表層沉積物、長(zhǎng)江口潮浸淺灘、長(zhǎng)江口及鄰近區(qū)域沉積物中厭氧氨氧化菌群分布及多樣性的研究表明，Amx-16S rRNA基因的有效序列條數(shù)在100條以下，覆蓋度在90%左右；Li等[32]研究南海紅樹(shù)林沉積物中厭氧氨氧化群落結(jié)構(gòu)多樣性信息時(shí)，應(yīng)用克隆文庫(kù)技術(shù)檢測(cè)到的hzo基因序列的有效條數(shù)在20～60條之間，覆蓋度在80%～100%之間不等，由此可能導(dǎo)致對(duì)厭氧氨氧化菌群群落結(jié)構(gòu)信息的分析產(chǎn)生一定的偶然性。

通過(guò)不同引物對(duì)研究海域沉積物中的厭氧氨氧化細(xì)菌豐度分布進(jìn)行檢測(cè)，將所得結(jié)果對(duì)數(shù)處理后用單樣本k-s檢驗(yàn)驗(yàn)證了3對(duì)引物檢測(cè)的厭氧氨氧化細(xì)菌豐度數(shù)值的正態(tài)性，結(jié)果表明Amx-16S rRNA基因引物1(P=0.958>0.05)、Amx-16S rRNA基因引物2(P=0.718>0.05)和功能基因hzo引物(P=0.299>0.05)檢測(cè)到的厭氧氨氧化細(xì)菌在研究海域的豐度分布趨勢(shì)具有空間異質(zhì)性。用皮爾森(Pearson)相關(guān)性檢驗(yàn)驗(yàn)證了不同引物覆蓋厭氧氨氧化細(xì)菌豐度分布的相關(guān)性，結(jié)果表明3對(duì)引物拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值具有顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.01,r1-2=0.613,r1-hzo=0.842,r2-hzo=0.566)，3對(duì)引物覆蓋的厭氧氨氧化細(xì)菌在研究區(qū)域的分布趨勢(shì)大體一致。One-Way ANOVA檢驗(yàn)結(jié)果也表明厭氧氨氧化細(xì)菌的豐度趨勢(shì)是一致的(P>0.05)。在所考察區(qū)域，整體表現(xiàn)為長(zhǎng)江口處豐度較低，長(zhǎng)江口外較遠(yuǎn)區(qū)域較高；近岸較低，遠(yuǎn)岸較高(見(jiàn)圖7)。對(duì)于個(gè)別站位，如位于外海非泥質(zhì)區(qū)的S33站位的厭氧氨氧化菌群豐度，Amx-16S rRNA基因引物1和功能基因hzo引物hzo5F/hzo5R表現(xiàn)為所有站位中厭氧氨氧化細(xì)菌的豐度最高，Amx-16S rRNA基因引物2則表現(xiàn)為S33站位較泥質(zhì)區(qū)略有降低，引物2檢測(cè)到的厭氧氨氧化細(xì)菌的分布趨勢(shì)與其它2對(duì)引物略有不同。且由于Amx-16S rRNA基因引物2擴(kuò)增的占總量50%左右的序列不是厭氧氨氧化細(xì)菌，該對(duì)引物較其他2對(duì)引物來(lái)說(shuō)不適合用于研究厭氧氨氧化菌群的豐度分布趨勢(shì)。

以往研究者大多采用克隆文庫(kù)技術(shù)對(duì)環(huán)境樣品中的厭氧氨氧化菌群多樣性信息進(jìn)行分析，覆蓋度之間的不均性，存在一定的不完整性與偶然性。本研究采用454、Illumina高通量測(cè)序技術(shù)研究中國(guó)邊緣海沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌的群落分布情況，高通量測(cè)序可獲得的序列條數(shù)在幾萬(wàn)條。Yang等[33]通過(guò)Illumina高通量測(cè)序技術(shù)以Amx-16S rRNA基因?yàn)槟繕?biāo)對(duì)淡水湖沉積物進(jìn)行厭氧氨氧化細(xì)菌群落多樣性分析，獲得10 000～30 000條序列，覆蓋度在99.9%～100%之間。Qin等[34]通過(guò)Illumina高通量測(cè)序技術(shù)以hzsβ基因?yàn)槟康幕驅(qū)闯练e物中厭氧氨氧化細(xì)菌進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)研究，獲得18 000～35 000條序列，較為全面地揭示了湖泊生態(tài)系統(tǒng)中厭氧氨氧化細(xì)菌的組成及其對(duì)生態(tài)環(huán)境的作用。結(jié)合本研究可知，高通量測(cè)序所得序列條數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于克隆文庫(kù)技術(shù)所得數(shù)值，覆蓋度都能到99%以上，較克隆文庫(kù)而言，高通量測(cè)序更能全面真實(shí)地反映厭氧氨氧化細(xì)菌群落的多樣性信息。

目前，已知的厭氧氨氧化細(xì)菌都屬于浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)，共有6個(gè)屬，分別是Ca. Scalindua、Ca. Kuenenia、Ca. Brocadia、Ca. Anammoxoglobus、Ca. Jettenia[27]以及Ca. Anammoximicrobiummoscowii[10]。海洋環(huán)境中最常見(jiàn)的屬是Ca. Scalindua。常用于檢測(cè)環(huán)境中厭氧氨氧化菌群群落結(jié)構(gòu)的基因是16S rRNA基因，本研究采用Amx-16S rRNA基因的2對(duì)引物過(guò)去廣泛被克隆文庫(kù)技術(shù)利用。引物Amx368F/Amx820R廣泛應(yīng)用于檢測(cè)淡水[35]和濱海濕地[36]，水稻田[37-38]以及河口、海洋沉積物[24, 40]中的厭氧氨氧化細(xì)菌。就以上研究成果可知，該引物可以覆蓋不同環(huán)境中的Ca. Scalindua、Ca. Brocadia和Ca. Kuenenia三個(gè)屬。厭氧氨氧化細(xì)菌在不同生態(tài)環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)屬隨外界環(huán)境因素變化而改變。Dale等[39]應(yīng)用該對(duì)引物對(duì)Cape Fear河口沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)研究表明，河口沉積物中厭氧氨氧化菌群優(yōu)勢(shì)屬隨鹽度升高由Ca. Brocadia過(guò)渡為Ca. Kuenenia，繼續(xù)向外延伸的海洋沉積物中則主要以Ca. Scalindua屬為主。引物Brod541F/Amx820R在過(guò)去研究中，更多地應(yīng)用于濱海[40]、海洋[41]沉積物中厭氧氨氧化菌群的研究，可以覆蓋Ca. Scalindua、Ca. Brocadia和Ca. Kuenenia屬。本章通過(guò)3對(duì)不同引物檢測(cè)到的厭氧氨氧化細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬也均為Ca. Scalindua，通過(guò)Amx-16S rRNA基因引物1檢測(cè)到的序列全都是浮霉菌門(mén)，覆蓋到厭氧氨氧化細(xì)菌的3個(gè)已知屬，Amx-16S rRNA基因引物2檢測(cè)到浮霉菌門(mén)序列所占比例不到50%，有一半以上是其他門(mén)類(lèi)菌群，覆蓋到厭氧氨氧化細(xì)菌的3個(gè)已知屬。

總體而言，兩對(duì)引物檢測(cè)到的厭氧氨氧化菌群優(yōu)勢(shì)屬均為Ca. Scalindua，能較完整的覆蓋研究區(qū)域的厭氧氨氧化菌群，引物1擴(kuò)增的序列均為厭氧氨氧化菌群，而引物2擴(kuò)增結(jié)果中有50%以上的序列不是厭氧氨氧化菌群，因此，Amx-16S rRNA基因引物Amx368F/Amx820R更適合該研究海域的厭氧氨氧化細(xì)菌的豐度分布和多樣性特征的分析。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究采用454、Illumina高通量測(cè)序和qPCR技術(shù)，利用厭氧氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因的兩對(duì)特異性引物(Amx368F/Amx820R、Brod541F/Amx820R)對(duì)長(zhǎng)江口及鄰近海域沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌的群落組成、多樣性及豐度進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，雖然兩對(duì)特異性引物均覆蓋到研究海域中厭氧氨氧化細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)屬Ca. Scalindua，但引物Amx368F/Amx820R的特異性優(yōu)于引物Brod541F/Amx820R，該引物更適用于海洋沉積物中厭氧氨氧化細(xì)菌的分子生態(tài)學(xué)研究。

致謝:感謝中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院張玉博士在軟件使用中提供的幫助！