賀雯茜 楊金玉 徐艷嬌 蘭露露 張程亮 劉東

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是全球廣泛流行的慢性疾病，嚴重危害人類的生命健康，其發(fā)病過程包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化和肝硬化[1]。目前，常用油酸、軟脂酸或其不同比例的混合物誘導(dǎo)體外肝細胞脂肪變性模型[2, 3]。亦有研究使用高濃度胎牛血清、醫(yī)用脂肪乳或胰島素培養(yǎng)細胞，以誘導(dǎo)肝細胞內(nèi)三酰甘油(TG)沉積[4]。但以上干預(yù)方式皆為模擬油脂類飲食過量攝入而引發(fā)的NAFLD。而現(xiàn)實生活中，隨著高脂飲食危害意識的普及和高果糖玉米糖漿作為甜味劑在食品工業(yè)中的廣泛使用，人們的飲食模式逐漸由多油多脂轉(zhuǎn)變?yōu)樯儆投嗵牵貏e是多果糖。已有研究表明，軟飲料消費量的逐年增長與城市人口NAFLD發(fā)病率增加密切相關(guān)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，果糖水飼養(yǎng)C57BL/6小鼠8周即出現(xiàn)明顯的肝臟脂質(zhì)沉積,說明生活中NAFLD的發(fā)生不僅是由油脂導(dǎo)致，果糖也是主要誘因之一[6]。而高脂誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性的細胞模型已不能契合新飲食模式導(dǎo)致的NAFLD研究需要。因此，本研究采用果糖誘導(dǎo)L02人正常肝細胞系建立新型脂肪變性細胞模型，評價該模型與傳統(tǒng)游離脂肪酸(FFA)誘導(dǎo)的NAFLD細胞模型對脂質(zhì)合成的影響,以期為NAFLD體外研究提供新的策略與途徑。

資料與方法

一、細胞系

人正常肝細胞系 L02為華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院肝病研究所饋贈。

二、主要試劑

果糖(F3510)、油酸(OA，01383)和軟脂酸(PA，P5585)購自美國Sigma公司；Cell Counting Kit-8試劑盒(HY-K0301-500T， MedChem Express)；油紅O干粉(13071275422，科瑞生物)；DMEM高糖培養(yǎng)基(C11995500BT，Gibco)；胎牛血清(S601P-500，Sera Pro)；胰酶(25200-056，Gibco)；兔抗人多克隆抗體：碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP，85570S，CST)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c，abs111730，absin)、乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1，4190S，CST)和硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1，2794S，CST)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(P0012S，碧云天)；ALT測試盒(C009-2)、AST測試盒(C0010-2)和TG測試盒(A110-1)均購自中國南京建成生物工程研究所。

三、溶液配制

果糖溶液配制：取11.53 g果糖溶解于10 mL DMEM高糖培養(yǎng)液，配成6.4 mol/L母液。根據(jù)實驗需要稀釋使用。FFA溶液配制： 取38.08 μL OA和0.0308 g PA分別溶于12 mL 10%無脂牛血清白蛋白溶液中，配成10 mmol/L OA母液和10 mmol/L PA母液。按照OA∶PA = 2∶1的比例配成1 mmol/L FFA溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

四、細胞活性檢測

將L02肝細胞接種于96 孔板中(每孔1.3×104個細胞)，待細胞貼壁后，將培養(yǎng)液換成總體積為200 μL的含果糖完全培養(yǎng)基，其中果糖濃度依次為0、0.5、1、2、4、8、16、32 mmol/L。培養(yǎng)24 h后向每孔加入20 μL的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。

五、轉(zhuǎn)氨酶的檢測

將L02肝細胞接種于24孔板內(nèi)(每孔7×104個細胞)，細胞貼壁后換含不同濃度果糖的培養(yǎng)液干預(yù)24 h。收集培養(yǎng)液，400×g離心5 min，取上清，按照檢測試劑盒說明書檢測ALT和AST。

六、細胞內(nèi)TG含量測定

將L02肝細胞接種于6孔板內(nèi)(每孔3.8×105個細胞)，細胞貼壁后分別換含不同濃度果糖(0、1、2、4、8、6、32 mmol/L)和FFA(1 mmol/L)的完全培養(yǎng)液干預(yù)24 h。PBS 清洗3次后收集細胞，加入2% TritonX-100冰上裂解細胞40 min，12 000×g離心20 min，取上清，按TG試劑盒說明檢測孔樣本TG含量，按BCA 蛋白定量試劑盒說明檢測各孔樣本蛋白含量，計算每克蛋白所對應(yīng)的TG含量(mmol/gprot)。

七、細胞油紅O染色

24孔板中放入細胞爬片，用明膠37 ℃包被30 min，種入L02肝細胞。細胞貼壁后加入含不同濃度果糖和FFA的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，后用60%異丙醇潤洗，3 g/L油紅O溶液染色15 min，60%異丙醇洗去浮色。蘇木精染色1 min以內(nèi)，雙蒸水沖洗4～5次至染核清晰背景干凈。于顯微鏡下觀察并采集圖像。

八、蛋白質(zhì)印跡

果糖和FFA處理L02肝細胞24 h后棄去上清，PBS緩沖液漂洗細胞3次。加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min。收集裂解液于12 000×g，4℃離心10 min，取上清加入5×蛋白上樣緩沖液，95℃下變性10 min。分別取 10 μL 樣本于100 V電壓下行SDS-PAGE電泳約2 h，于200 mA電流下行電轉(zhuǎn)2.5 h。5%牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃搖床孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。條帶使用ECL液顯影，于暗室中曝光，Image J軟件分析吸光度值。

九、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、果糖對L02肝細胞活性無顯著影響

隨著培養(yǎng)液中果糖濃度的升高，L02肝細胞活性無顯著差異(表1)。說明該范圍濃度內(nèi)的果糖(32 mmol/L及以內(nèi))對L02肝細胞活性無顯著影響。

表1 果糖對L02肝細胞增殖活性的影響(±s, n= 6)

二、細胞培養(yǎng)上清液中ALT及AST含量變化

與未加果糖的對照組相比，果糖濃度在 0.5、1、2、4、8、16、32 mmol/L時，細胞培養(yǎng)液中ALT和AST含量均無顯著性差異(表2)。說明該范圍濃度內(nèi)的果糖(32 mmol/L及以內(nèi))未導(dǎo)致顯著的L02肝細胞損傷。

表2 不同濃度果糖培養(yǎng)基上清中ALT、 AST含量變化(±s, n= 6)

三、果糖誘導(dǎo)L02肝細胞脂肪變性/果糖促進L02肝細胞脂肪沉積

不同果糖濃度(0、1、2、4、8、16、32 mmol/L)和FFA處理24 h后，L02肝細胞內(nèi)TG含量分別為無具體數(shù)據(jù)。油紅O染色觀察結(jié)果和細胞內(nèi)TG含量測定結(jié)果一致(圖1)。隨著果糖濃度升高，細胞內(nèi)紅色脂滴增多，且主要分布在細胞質(zhì)靠近細胞膜部位。尤其4 mmol/L果糖組，紅色變深，范圍變大。然而FFA組脂滴大量聚集，且連成片狀。說明4 mmol/L果糖即可導(dǎo)致脂肪在細胞內(nèi)大量累積，但其脂質(zhì)累積效應(yīng)弱于FFA。

圖1果糖和游離脂肪酸對L02肝細胞內(nèi)TG含量的影響(油紅O染色，×200) A.果糖濃度為0 B.果糖濃度為1 mmol/L C.果糖濃度為4 mmol/L D.FFA組

四、果糖誘導(dǎo)L02肝細胞脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白表達量增加

使用濃度梯度的果糖干預(yù)L02肝細胞后，結(jié)果4 mmol/L果糖時，在L02細胞中ChREBP、SREBP-1c和ACC1的表達量顯著升高(P<0.05)。而果糖濃度達到8 mmol/L時，SCD1蛋白才顯著升高(P<0.05)，但當果糖濃度升高至32 mmol/L時，SCD1蛋白表達又回到正常水平。說明果糖可能通過上調(diào)細胞中脂質(zhì)合成蛋白表達從而導(dǎo)致肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，但當果糖濃度超過一定范圍時，其促脂質(zhì)合成效果可能會有所減弱(圖2)。

五、果糖和FFA對L02肝細胞脂質(zhì)合成蛋白表達影響

為比較果糖和FFA導(dǎo)致L02細胞脂質(zhì)沉積不同，選用4 mmol/L果糖處理L02肝細胞，結(jié)果L02肝細胞中SCD1蛋白表達量比無果糖處理組(對照組)顯著升高(P<0.05)，ACC1蛋白表達量相對于對照組有增加趨勢(圖3)。

SCD1在FFA組蛋白表達量相對于對照組無顯著性差異。而經(jīng)FFA處理后，L02肝細胞中ACC1蛋白表達量相對于對照組有下降的趨勢。除此之外，果糖相對于FFA更顯著提高了L02細胞內(nèi)ACC1的表達(P<0.05)。這些結(jié)果說明果糖相對于FFA，對肝細胞內(nèi)脂質(zhì)合成源頭的影響更顯著。

注：與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

圖2果糖對L02肝細胞中ChREBP、SREBP-1c、ACC1和SCD1蛋白表達的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與果糖組比較，#P<0.05

圖3果糖和游離脂肪酸對L02肝細胞中ACC1和SCD1蛋白表達的影響

討 論

NAFLD是與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷，以肝細胞脂質(zhì)沉積為主要特征。常用的飲食干預(yù)誘導(dǎo)NAFLD的動物模型造模周期較長，轉(zhuǎn)基因動物模型成本昂貴。體外細胞模型能為動物模型提供補充，為探討發(fā)病機制和藥物治療提供有效補充手段。

目前，NAFLD細胞模型廣泛使用原代肝細胞和永生化肝細胞系，通過培養(yǎng)液中添加高濃度營養(yǎng)物質(zhì)誘導(dǎo)肝細胞脂質(zhì)沉積，這些物質(zhì)包括飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、葡萄糖、血清和醫(yī)用脂肪乳等。其中人體肝臟樣本數(shù)量有限，原代細胞培養(yǎng)極其復(fù)雜，同時礙于倫理問題常限制其使用[7]。嚙齒動物的原代肝細胞能部分模仿人類的疾病狀況，但培養(yǎng)較長時間時，細胞會丟失其組織特異性功能。永生化肝細胞系是原代細胞培養(yǎng)的優(yōu)良替代物，其表型穩(wěn)定，培養(yǎng)便捷，更容易標準化[2]。為了更好模擬人體NAFLD疾病狀態(tài)，獲得可重復(fù)性穩(wěn)定實驗結(jié)果，本研究選擇人正常肝細胞系L02作為NAFLD體外模型的生物材料。

同樣，誘導(dǎo)肝細胞脂質(zhì)性變的方法也有很多。將肝細胞暴露于高脂培養(yǎng)基是最直接且常用的方法。根據(jù)NAFLD的疾病特點添加的多為FFA，依據(jù)不同類型肝細胞FFA濃度也有所不同[8, 9]。部分研究在建造NAFLD細胞模型時未使用含有脂肪酸的高脂培養(yǎng)基，如在培養(yǎng)基中添加高濃度胎牛血清，但此方法費用高[10]。Iwasaki等[11]嘗試使用高葡萄糖誘導(dǎo)HuH7細胞發(fā)現(xiàn)，高葡萄糖對NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄具有促進作用，促進細胞凋亡。隨著人們生活習慣變化，果糖成為NAFLD的新誘因。果糖可誘導(dǎo)肥胖、高脂血癥、IR和高血壓等代謝綜合征的表現(xiàn)已在動物及人群研究中得到廣泛證實[12]。而目前果糖誘導(dǎo)的NAFLD細胞模型有待進一步開發(fā)。

本研究采用梯度濃度的果糖進行實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以4 mmol/L 果糖誘導(dǎo)L02肝細胞24 h后，即可顯著增加細胞內(nèi)TG含量。同時，該濃度果糖對細胞活性無顯著性影響，細胞未出現(xiàn)顯著性損傷。ChREBP、SREBP-1c、ACC1和SCD1是脂質(zhì)合成中的關(guān)鍵蛋白，在NAFLD形成中其發(fā)揮關(guān)鍵性作用。研究發(fā)現(xiàn)，高糖飼喂肝臟特異性ChREBP敲除小鼠肝臟脂質(zhì)沉積相對于野生型小鼠顯著減少，而肝臟特異性ChREBP敲除不能減少高脂飼誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)累積[13]。SREBP-1c和ChREBP 在激活脂肪生成中發(fā)揮協(xié)同作用[14]。此外，ChREBP通過調(diào)節(jié)SREBP2蛋白穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)肝臟膽固醇生物合成的新作用，這種機制似乎對肝細胞保護免受果糖誘導(dǎo)的細胞凋亡至關(guān)重要[15]。FAS、ACC1和SCD1是轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1c和ChREBP的下游靶基因，這三個脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶的上調(diào)會顯著促進肝臟脂質(zhì)從頭合成[16-17]。果糖在4～32 mmol/L時即可顯著上調(diào)ChREBP、SREBP-1c和ACC1蛋白表達。果糖濃度達到8～16 mmol/L時SCD1蛋白表達也顯著上調(diào)。這些結(jié)果說明4 mmol/L 果糖作用于L02細胞24 h后，即可上調(diào)肝細胞脂肪合成基因，從而誘導(dǎo)肝細胞脂肪變性。

果糖誘導(dǎo)模型和經(jīng)典的FFA誘導(dǎo)模型結(jié)果顯示，與FFA處理組相比，盡管果糖誘導(dǎo)的肝細胞脂質(zhì)沉積不如其顯著，但果糖可以顯著增加L02細胞內(nèi)ACC1和SCD1蛋白的表達，其中對SCD1蛋白的增加更為顯著。說明果糖可能主要影響脂質(zhì)合成源頭從而導(dǎo)致肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。果糖通過誘導(dǎo)脂質(zhì)從頭合成而促使TG累積效率較PA和OA作為原料直接促進胞內(nèi)TG沉積更低，這也可能是果糖誘導(dǎo)的肝細胞脂質(zhì)沉積弱于FFA的原因。

綜上所述，4 mmol/L 果糖作用于L02細胞24 h后，即可上調(diào)肝細胞脂肪合成基因，從而誘導(dǎo)肝細胞脂肪變，構(gòu)建NAFLD細胞模型。此方法不僅造模周期短、費用低，且方法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，能較好地模擬高果糖飲食誘發(fā)的NAFLD，為高果糖飲食誘導(dǎo)肝臟脂肪變性進展的分子機制研究提供一種有效可行的新工具。