伍 豪，高利軍，黃 娟，高 菊，卿冬進，戴高興，梁海福，周維永*

(1.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室，廣西 南寧 530007；2.廣西農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球超過一半以上的人口以稻米為主食。隨著生活水平的提高，消費者對優(yōu)質(zhì)米的要求是不僅口味適合，還要粒形美觀。在水稻育種過程中，粒形也是必須選擇的性狀，因為粒形不僅影響水稻的產(chǎn)量，也影響著稻米的外觀品質(zhì)和商品價值[1]。水稻粒型已成為當前消費者與育種家的共同關(guān)注熱點之一。一般說來，水稻粒形包括粒長、粒寬、粒厚及長寬比等性狀，而粒長是最能反映粒形的指標[2]。在南方地區(qū)，由于高溫“逼熟”，谷粒越寬灌漿越難，導致米質(zhì)下降，一般細長粒稻米的堊白率較低，其外觀品質(zhì)也較好[3]。粒長負調(diào)控基因GS3在第2外顯子中編碼第55位的密碼子發(fā)生了無義突變，導致蛋白翻譯提前終止，蛋白的C-端178個氨基酸缺失，從而使得OSR結(jié)構(gòu)域功能喪失，水稻粒形變長[4]。因此，建立GS3基因的功能標記用于分子標記輔助選擇育種將對水稻粒長及品質(zhì)的改良發(fā)揮重要作用?！厩叭搜芯窟M展】Wang等[5]利用近等基因系對GS3長粒等位基因進行聚合育種，其研究結(jié)果表明GS3基因?qū)υ黾恿ｉL和粒重起到非常關(guān)鍵的作用。楊梯豐等[6]利用攜帶有GS3基因的單片段代換系進行聚合育種，證實了該基因在不同的遺傳背景下均具有谷粒增長的效應。張劍霞等[7]利用標記SF28將GS3的長粒等位基因聚合到了珍汕97B和II-32B中，獲得各自粒長得到改良的株系?！颈狙芯壳腥朦c】Fan等[8]開發(fā)的標記SF28需要使用限制性內(nèi)切酶，操作繁瑣，成本高，不利于育種應用。因此，開發(fā)出不用酶切，直接利用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物的功能標記，并將該標記運用于改良綜合性狀優(yōu)良的水稻親本粒長中，以助推利用GS3基因的分子標記輔助選擇長粒型水稻品種的育種工作?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用GS3基因與其等位基因的序列差異，開發(fā)出GS3基因的功能標記，對24個水稻親本材料進行基因分型，并結(jié)合粒長表型分析，驗證標記的有效性。同時，將GS3長粒等位基因?qū)攵塘Ｋ居H本中，利用該標記進行輔助選擇，以期獲得粒長增加的優(yōu)良水稻親本材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

含有GS3長粒等位基因的長粒水稻品種宜香B，粒長為10.1 mm，含有GS3基因的短粒水稻品種美B，粒長為7.9 mm。24個在水稻育種中廣泛使用的親本(表1)及宜香B與美B雜交、回交后的BC2F7群體。

1.2 試驗方法

1.2.1 標記設計 從 NCBI 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載水稻粒型基因GS3序列，序列號為DQ355996，利用 Primer Premier5.0軟件對GS3序列進行分析和設計引物。根據(jù)Fan[4]等報道的GS3基因中第 2 外顯子上的編碼區(qū)+165位置C-A單堿基替換，設計出含有3條引物的標記M-GS3.

1.2.2 材料種植與DNA提取 供試水稻材料全部種植于廣西農(nóng)業(yè)科學院水稻試驗田，于插秧后14 d單株取葉片，按Murray[9]等的CTAB法提取水稻DNA。

1.2.3 粒型測定 利用SC-G型自動種子拷種儀測量24個水稻品種和BC2F7群體中的入選單株。每個品種隨機取10個單株，每株隨機選取100粒飽滿籽粒測定，取平均值作為粒長的表型值。

1.2.4 PCR擴增 反應體系為20 μl：2.0 μl的 10×Buffer、2.0 μl的 dNTPs(2.5 mmol/L)、4 μmol/L 的引物gs3F、gs3In和gs3R各1.0 μl、0.2 μlTaqDNA聚合酶(5 U/ μl)，2.0 μl模板DNA，12.8 μl ddH2O。PCR反應程序為94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10min得到擴增物，將擴增產(chǎn)物在添加了5 μl Biotium公司生產(chǎn)的GelRed核酸染料的1.5 %瓊脂糖凝膠中進行電泳，紫外燈下觀察拍照。

1.2.5 育種應用 利用含有GS3長粒等位基因的水稻保持系宜香B為供體親本，保持系美B為受體親本進行雜交，在后用美B為輪回親本，后代用標記M-GS3選擇含粒長等位基因GS3存在的單株連續(xù)回交到BC2F1，然后連續(xù)自交，并結(jié)合標記選擇與粒長表型測定，最后從BC2F7群體中選擇農(nóng)藝性狀與美B一致且粒長顯著超過美B的株系。

2 結(jié)果與分析

2.1 GS3基因功能標記的建立

根據(jù)粒型基因GS3的序列中第2外顯子上的編碼區(qū)+165位置的1個由堿基C到堿基 A的單核苷酸替換，首先設計了一條能匹配長粒等位基因GS3的引物gs3In：GCAGGCTGGCTTACTtTCTT，在其3′端引入了一個錯配堿基T，并在其上游設計一條引物gS3F：ATTGGCTTGATTTCCTGTGC，下游設計一條引物gs3R：TTGCTCTTACGGGAGGACAC。3條引物同時在PCR體系中進行擴增，GS3長?；虻男蛄信cgs3In只有一個堿基錯配，可以擴增出720和308 bp的兩條帶；而GS3短粒等位基因與引物gs3In有2個堿基錯配，不能擴增出308 bp的條帶來，只有1條720 bp的條帶。這樣擴增產(chǎn)物不需要進行酶切，直接電泳檢測是否含有兩條帶，就能檢測出樣品中是否含GS3長粒等位基因。

2.2 GS3的功能標記在育種親本中的驗證

利用引物M-GS3對24份不同粒長的水稻親本材料進行檢測(圖1)。檢測結(jié)果顯示，在泰豐B，內(nèi)香B，協(xié)青早B等11份材料中含有長粒等位基因GS3，而其他材料中不含有該基因(表1)。對24份材料的粒長測定顯示，含有GS3長粒等位基因的品種粒長為8.7～13.1 mm，明顯大于粒長位于6.7～8.5 mm的含有短粒等位基因GS3的品種。這一結(jié)果表明，引物M-GS3可以準確的檢測出不同水稻材料中是否含有GS3長粒等位基因，這將有助于發(fā)掘含有GS3長粒等位基因的水稻材料，為水稻粒型改良的育種工作提供材料基礎。

表1 24個水稻品種及其粒長表型和基因性Table 1 Phenotype and genotype of grain length of 24 rice varieties

2.3 GS3的功能標記對水稻粒型的改良

利用標記M-GS3對美B與宜香B的BC2F7群體進行檢測(圖2)，并對其農(nóng)藝性狀進行調(diào)查，根據(jù)基因型及粒長表型，篩選到10株農(nóng)藝性狀與美B接近，粒長大于9.5 mm的株系。將這些株系與其親本美B和宜香B的農(nóng)藝性狀進行比較(表2)，發(fā)現(xiàn)改良后的美B材料82B其長寬比為4.14，遠超過兩親本的長寬比，其千粒重，粒長，粒寬，長寬比，等與產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)的性狀相對于親本美B來說都得到了提高，經(jīng)t檢驗表明，這幾個性狀與美B相比都達到了極顯著；而82B的株高、穗長、有效穗和結(jié)實率等性狀與美B接近，t檢驗表明這些性狀與美B無顯著差異(圖3)。這充分說明了利用宜香B為GS3長粒等位基因的供體親本，并利用M-GS3為標記的分子標記輔助選擇對美B粒長和產(chǎn)量的提高的有效性。

M：Marker200；1： II-32B；2： BX-16；3：崗46B；4：特B；5：良豐B；6：112B；7：西菲B；8：龍豐B；9：博IIB；10：158B；11：地谷B；12：福伊B；13：谷梅4號；14：02428；15：南粳46；16：BL122；17：博IIIB；18：協(xié)青早B；19-B5；20：IRBB7；21：L427；22：金23B；23：內(nèi)香B；24：泰豐BM:Marker200；1:II-32B；2:BX-16；3:Gang 46B；4:Te B；5:Liangfeng B；6:112B；7:XifeiB；8:Longfeng B；9:Bo IIB；10:158B；11:Digu B；12:Fuyi B；13:Gumei 4；14:02428；15:Nanjing 46；16:BL122；17:Bo IIIB；18:Xieqing:zao B；19:B5；20:IRBB7；21:L427；22:jin 23B；23:Neixiang B；24:Taifeng B圖1 24個水稻品種分子標記的電泳圖Fig.1 Detection of 24 rice varieties by marker M-GS3

M:Marker200；1～5、7～24：含有GS3長粒等位基因的材料；6：含有GS3短粒等位基因的材料M:Marker200;1-5,7-24:Materials containing GS3 long grain allele；6:Materials containing GS3 short grain allele圖2 標記M-GS3對BC2F7群體進行檢測Fig.2 Detection of BC2F7 population by marker M-GS3

表2 親本和入選單株的農(nóng)藝性狀比較Table 2 Comparison of agronomic characters between parents and selected individuals

注：*代表與美B相比的t檢驗值達到極顯著性差異(P<0.05)。
Notes：* indicate significant difference with t-test by comparing with MeiB(P<0.05).

3 討 論

谷粒長度不僅影響水稻的產(chǎn)量性狀——千粒重，也影響稻米的外觀品質(zhì)和商品價值[10]。因此，廣大育種工作者都十分關(guān)注對水稻粒長的改良。在水稻粒型改良的育種工作中，GS3是少數(shù)在常規(guī)品種中已經(jīng)廣泛受到人工正向選擇，并在生產(chǎn)中發(fā)揮作用的粒長基因[11]。在對GS3長粒等位基因的利用中，前人多采用CAPS標記及連鎖標記進行選擇。Fan等[8]基于GS3基因第2外顯子的C-A突變，開發(fā)了一個酶切擴增多態(tài)性序列(CAPS)標記SF28，并用與育種實踐。李揚等[12]用含有GS3長粒等位基因的長粒品種三粒寸、IAC1246、JAPPENI、TUNGKUNGO和MIGA作為供體親本，SAGC4為受體親本，采用標記SF28，對GS3長粒等位基因進行選擇，從BC2F2代分離群體中直接篩選出長粒且綜合農(nóng)藝性狀好的優(yōu)良單株，證實了不同供體親本對受體親本SAGC4粒長增加的貢獻基本相同，都可以達到快速改良SAGC4粒長和長寬比性狀的目的。方珊茹等[13]將GS3長粒等位基因及其他外觀品質(zhì)性狀基因?qū)胨静牧螴I-32B中，在利用連鎖標記MR5881和GS09對GS3長粒等位基因進行選擇，獲得了粒長、谷粒長寬比和粒重均得到改良的株系。本研究利用GS3基因與其等位基因的序列差異，設計出了標記M-GS3，該標記是位于基因內(nèi)的功能標記，產(chǎn)物不用酶切，相較于連鎖標記及CAPS標記有著準確度高，操作簡便，成本低等特點。利用標記M-GS3對含有不同粒型基因的24份水稻親本材料及育種群體材料進行檢測，發(fā)現(xiàn)該標記能夠在不同遺傳背景的水稻材料中準確的鑒定出GS3基因及其等位基因，說明了該標記可以用于對GS3基因的分子標記輔助育種及對水稻種質(zhì)資源中的GS3基因進行鑒定。這將有利于推進GS3基因在水稻粒型改良中的更廣泛使用，并為培育出長粒型優(yōu)質(zhì)水稻提供材料基礎。

本研究利用美B和宜香B進行雜交，將宜香B中的GS3長粒等位基因?qū)朊繠中，在以美B為輪回親本，經(jīng)連續(xù)回交和自交，并結(jié)合M-GS3標記的檢測及粒長表型鑒定，選育出了粒長改良后的美B材料82B，其平均粒長為9.87 mm。通過t檢驗表明，82B的粒長，千粒重，長寬比等與產(chǎn)量和米質(zhì)相關(guān)的性狀都得極顯著提高，而株高，穗長，有效穗數(shù)和結(jié)實率等性狀與美B接近，變化不顯著。這一結(jié)果與Wang等[5]的研究結(jié)果GS3基因?qū)υ黾恿ｉL和粒重起到非常關(guān)鍵的作用一致，也進一步驗證了標記M-GS3對GS3基因選擇的有效性及GS3基因?qū)λ玖ｉL和粒重影響的主效性。

圖3 親本與改良后代的粒長表型Fig.3 Grain length phenotype of parents and improved progenies

4 結(jié) 論

通過對GS3基因的序列進行分析，開發(fā)出了GS3基因的功能標記M-GS3。通過對不同水稻親本材料及育種改良群體材料的檢查并結(jié)合粒長測量，發(fā)現(xiàn)該標記可有效的對水稻中的GS3基因進行選擇。利用該標記對導入了GS3長粒等位基因的美B材料進行輔助選擇，獲得了粒長，千粒重和長寬比都顯著高于美B，而其他農(nóng)藝性狀與美B接近的材料，這些材料可進一步運用到優(yōu)質(zhì)稻育種中。