謝 輝，王 仙，張 雯，伍國紅，王 敏，韓守安，瑪爾哈巴·毛拉洪，依扎提·吐爾達洪，鐘海霞，潘明啟，陸勝祖，李 疆

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，烏魯木齊，830091；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，烏魯木齊 830091；4.新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，新疆鄯善 838200；5.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】葡萄產(chǎn)業(yè)是新疆林果業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一，近年來新疆葡萄干的產(chǎn)量和制干品種栽培面積持續(xù)發(fā)展[1，2]。目前新疆葡萄干品種主要有無核白、無核白雞心(香妃)、無核紫、索索葡萄干、馬奶子及其他品種的葡萄干[2，3]。多酚具有抗癌、抗老化等抗氧化作用，對人體健康具有積極的意義[4,5]。葡萄干含有黃酮、多糖、多酚等多種生物活性物質(zhì)，具有較高的活性及營養(yǎng)保健功能，是日常膳食中重要的保健食品[6-9]。研究葡萄干中多酚的提取工藝及檢測方法，對新疆葡萄干產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。【前人研究進展】關(guān)于植物中多酚提取工藝的研究在桑葉[10]、葡萄皮渣[11]、藍莓葉[12]、石榴[13]、蘋果[14]、無花果[15]等果樹上已進行了大量的研究，采用超聲波輔助工藝提取植物中的多酚物質(zhì)可以有效提高提取率[16]。對于不同物料的提取條件具有較大的差異，例如桑葉的多酚提取時間為16 min，料液比為1∶87(g/mL)，而藍莓葉則是2.06 h和1∶23.65(g/mL)；采用超聲輔助提取后可顯著縮短提取時間和提取溫度，對于加快提取效率，節(jié)約能耗具有重要的作用[16]，采用超聲輔助方法對不同果實多酚提取工藝優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，不同物料之間的提取條件也具有較大的差異，葡萄皮渣中的料液比為1:16(g/mL)，而無花果干則為1:45(g/mL)，乙醇體積分數(shù)分別為40%和60%?！颈狙芯壳腥朦c】葡萄干加工過程損耗較少關(guān)于高糖材料中多酚物質(zhì)提取工藝研究較少。研究葡萄干中多酚含量的方法進行優(yōu)化研究以新疆干果產(chǎn)業(yè)中的葡萄干產(chǎn)業(yè)為研究對象，研究葡萄干中多酚物質(zhì)的提取工藝，為測定葡萄干中多酚含量提供技術(shù)支撐?！緮M解決的關(guān)鍵問題】測定不同工藝條件下葡萄干中多酚物質(zhì)含量，為制干工藝的改進奠定理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

材料為馬奶子葡萄干，2016年鮮樣采集于鄯善瓜果研究中心品種資源圃內(nèi)，并在晾房中晾制成干。無核白雞心、無核紫、無核白、SP522、皇家秋天、巨玫瑰、紫玉、紅寶石、紅玉、茉莉莎等品種由鄯善葡萄研究所提供。

試劑：無水乙醇(分析純)、福林酚試劑(分析純)、碳酸鈉(分析純)、沒食子酸(優(yōu)級純)。

儀器：德國IKA/艾卡 A11 基本型分析研磨機、721型紫外分光光度計、超聲儀(功率150W)、萬分之一電子天平、高速冷凍離心機。

1.2 方 法

1.2.1 樣品處理

將葡萄干樣品帶回實驗室內(nèi)，除去雜質(zhì)，隨機稱取3份100 g葡萄干，采用液氮速凍，研磨成粉，迅速稱取1.00 g樣品多份，保存于﹣40℃冰箱中待測。

1.2.2 標準曲線的制作及提取液多酚含量測定

多酚得率的測定方法參照令博等[11]測定葡萄皮渣多酚含量的方法略作修改，取試管，分別加入5 mL蒸餾水，1 mL FC試劑和3 mL 7.5% Na2CO3溶液，室溫避光放置90 min后，在波長760 nm處測吸光度，得到?jīng)]食子酸質(zhì)量濃度ρ(μg/mL)與吸光度A的回歸方程：ρ=333.33A+0.045(R2=0.999 6)，用同樣的方法測定樣品中多酚含量。多酚得率的計算公式如下Y(%)=(cxv)/m(c為提取液多酚質(zhì)量濃度(以沒食子酸計)，mg/m；V為提取液定容體積，m；m為葡萄干粉末質(zhì)量，g；Y為提取液中多酚得率，mg/g。)

標準曲線：Y=69.105 1C(標準液濃度)-0.021 0；R2=0.999 5。

1.2.3 多酚提取優(yōu)化

準確稱取1.00 g樣品置于容積為100 mL的燒瓶內(nèi)，加入一定比例及體積分數(shù)的乙醇溶液，在一定溫度下回流提取一定時間后過濾。濾渣以同樣條件提取、過濾，合并濾液，測定吸光度。

最佳乙醇提取濃度：分別設(shè)置了20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇濃度提取試驗，進而得出最佳的乙醇提取濃度試驗結(jié)果。

最佳料液比：選用最佳的乙醇提取濃度，分別設(shè)置了20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1的料液比提取試驗，在此基礎(chǔ)上得到最佳的料液比提取方案。

最佳提取時間：根據(jù)最佳乙醇濃度、最佳料液比的試驗結(jié)果，分別設(shè)置了15、30、45、60、75、90 min的提取時間梯度試驗，得到最佳的提取時間試驗。

最佳提取溫度：根據(jù)乙醇濃度、料液比和提取時間的試驗結(jié)果，對超聲提取的溫度進行優(yōu)化，分別設(shè)置了30、40、50、60、70℃的溫度試驗梯度，最終得出最佳的提取溫度。

1.2.4 響應(yīng)面分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken軟件設(shè)計試驗方案，以乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、溫度(D)為自變量，以多酚得率y設(shè)計響應(yīng)面因素水平表。表1

表1 Box-Behnken的中心組合因素水平表
Table 1 The central combination factor level table of Box-Behnken

水平level乙醇濃度ethanol concentration(%)料液比solid-liquid ratio(mL/g)溫度Temperature(℃)時間Time(min)-140505540050606550160707560

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和Design-Expert 8.0軟件對結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 葡萄干多酚最佳提取工藝的乙醇濃度篩選

不同乙醇濃度影響葡萄干樣品中的多酚提取率，不同乙醇濃度多酚提取量分別為20%時提取率為1.11 mg/g、30%時提取率為1.13 mg/g、40%時提取率為1.19 mg/g、50%時提取率為1.23 mg/g、60%時提取率為1.20 mg/g、70%時提取率為0.99 mg/g、80%時提取率為0.75 mg/g、90%時提取率為0.46 mg/g。無核白雞心葡萄干中的多酚隨著乙醇濃度的增加而逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度為50%時，多酚得率最大，當(dāng)乙醇濃度大于50%時，得率反而下降。最佳的乙醇濃度選取為50%。圖1

圖1 不同乙醇濃度下葡萄干多酚提取率變化
Fig. 1 Effect of Ethanol Concentration on Extraction Rate of Polyphenols from Raisins

2.1.2 葡萄干多酚最佳提取工藝料液比篩選

多酚的提取率與提取液的體積密切相關(guān)，不同料液比多酚提取量分別為1∶220時提取率為0.88 mg/g、1∶230時多酚含量提取率為0.92 mg/g、1∶240時多酚提取率為0.94 mg/g、1∶250時多酚提取率為0.99 mg/g、1∶260時多酚提取率為1.01 mg/g、1∶270時多酚提取率為0.98 mg/g。料液比在1∶20(g/m)～1∶260(g/m)，隨料液比增加得率增加，料液比在1∶260(g/mL)時，多酚得率達到最高值，料液比大于1∶260(g/m)時，當(dāng)料液比為1∶270(g/m)、多酚提取率沒有明顯的增加。分析原因可能是隨著料液比的增大，使葡萄干樣品顆粒與乙醇試劑之間的接觸面積逐漸增大，提高了酚類物質(zhì)向溶劑溶解的比例，使得多酚的提取率增大；然而當(dāng)料液比超過一定比例后，多酚提取率已經(jīng)達到飽和，當(dāng)料液比超過1∶260(g/m)時，葡萄干樣品中的多酚提取率沒有明顯變化。最適料液比選擇為1∶260(g/m)。圖2

圖2 不同料液比下葡萄干多酚提取率變化
Fig. 2 Effect of liquid-to-liquid ratio on extraction rate of raisin polyphenols

2.1.3 葡萄干多酚最佳提取工藝的提取時間篩選

提取時間與多酚的提取率密切相關(guān)，不同提取時間條件下多酚提取量分別為15 min時提取率為0.769 mg/g、30 min時提取率為0.70 mg/g、45 min時提取率為0.76 mg/g、60 min時提取率為0.80 mg/g、75 min時提取率為0.86 mg/g、90 min時提取率為0.83 mg/g。在15～90 min時，隨提取時間的增加，得率也逐漸增大，在75 min時達到最大，隨著提取時間的增加，葡萄干樣品被溶劑充分浸透，同時由于超聲波的作用，加速葡萄干樣品中的酚向溶劑溶出；當(dāng)提取時間大于75 min時，葡萄干樣品中的多酚得率反而下降提取時間過長，超聲產(chǎn)生的空化作用和機械震動可能對多酚有一定的分解作用，也會加大部分雜質(zhì)的溶出，使得提取率降低。試驗選取的多酚最佳選擇提取時間為75 min。圖3

圖3 不同提取時間下葡萄干多酚提取率變化
Fig. 3 Effect of extraction time on extraction rate of raisin polyphenols

圖4 不同提取溫度下葡萄干多酚提取率變化
Fig. 4 Effect of extraction temperature on extraction rate of raisin polyphenols

2.1.4 葡萄干多酚最佳提取工藝的提取溫度篩選

提取溫度對葡萄干樣品中多酚的提取影響較大，不同溫度條件下多酚提取量分別為30℃時提取率為0.73 mg/g、40℃時提取率為0.81 mg/g、50℃時提取率為0.85 mg/g、60℃時提取率為0.96 mg/g、70℃時提取率為1.02 mg/g、80℃時提取率為0.98 mg/g。提取溫度在30～70℃，隨溫度的升高，得率隨之增大，當(dāng)提取溫度為70℃時得率達到最大。隨著溫度的升高，提取液黏度下降，擴散系數(shù)增加，加快了分子熱運動的速度，促進物質(zhì)的溶出。但當(dāng)溫度大于70℃時，多酚得率反而下降可能是因為溫度過高，導(dǎo)致多酚的組織結(jié)構(gòu)被破壞，氧化分解，溫度過高會導(dǎo)致溶劑損失，并且雜質(zhì)大量溶出，影響多酚的提取效果。最佳提取溫度選取為70℃。圖4

2.1.5 葡萄干多酚最佳提取工藝的暗反應(yīng)時間篩選

隨著暗反應(yīng)時間的延長多酚提取率測定值下降，10 min測定值為1.93 mg/g，15 min測定值為1.86 mg/g，暗反應(yīng)為25 min時測定值為1.84 mg/g，暗反應(yīng)40和120 min時的測定值與25 min時測定值一致，確定多酚暗反應(yīng)時間為40 min。圖5

圖5 不同暗反應(yīng)時間下葡萄干多酚提取率變化
Fig. 5 Effect of dark reaction time on extraction rate of raisin polyphenols

2.1.6 葡萄干多酚最佳提取工藝的超聲波功率

研究表明,隨著超聲波功率的增加提取效率逐漸增高，不使用超聲波提取率為0.62 mg/g，超聲波功率為30%提取率0.79 mg/g，超聲波功率為60%提取率0.86 mg/g，超聲波功率為100%提取率0.96 mg/g，超聲波震動致使細胞壁破解并加速了多酚的提取，且隨著提取功率的增加提取也更加穩(wěn)定，確定使用最大功率。圖6

圖6 不同超聲波功率下葡萄干多酚提取率變化
Fig. 6 Effect of ultrasonic power on extraction rate of raisin polyphenols

2.2 響應(yīng)面

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken軟件設(shè)計，對葡萄干中多酚提取進行四因素三水平優(yōu)化試驗設(shè)計，結(jié)果。表2

通過Design-Expert 8.0.6.1軟件進行二次響應(yīng)面回歸分析，以多酚得率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后得到回歸方程為Y=3.535 8+0.145 83×X1+0.168×X2+0.032×X3-0.004 92×X4+0.163×X1X2-0.028 75×X1X3+0.009×X1X4+0.311×X2X3+0.011×X2X4-0.160 75×X3X4-0.259 53×X12-0.409 65×X22-0.177 4×X32-0.074 53×X42

表2 超聲波輔助提取葡萄干中多酚的響應(yīng)面試驗
Table 2 Experimental design and results for the response surface analysis to optimize the ultrasonic assisted extraction of polyphennols from raisin

試驗號Test number乙醇濃度Ethanol concentration(%)料液比Solid- liquid ratio(mL/g)溫度Temperature(℃)提取時間Extraction time(min)多酚提取量Extraction rate of polyphenols(mg/g)100113.1222001-13.459301103.4394-1-1002.69551-1002.649600003.4957-100-13.103801-102.791911003.3171010-103.24411010-13.232

續(xù)表2 超聲波輔助提取葡萄干中多酚的響應(yīng)面試驗
Table 2 Experimental design and results for the response surface analysis to optimize the ultrasonic assisted extraction of polyphennols from raisin

試驗號Test number乙醇濃度Ethanol concentration(%)料液比Solid- liquid ratio(mL/g)溫度Temperature(℃)提取時間Extraction time(min)多酚提取量Extraction rate of polyphenols(mg/g)120-1012.8741300003.4991400003.51715100-13.3351600003.626170-10-12.8981800003.5421910103.29220-10013.073210-1-103.1032200-1-13.0772300-113.38324-10103.03625-11002.711260-1102.50727-10-102.8732810013.3412901013.252

該模型效應(yīng)極顯著(P<0.000 1)，失擬項P=0.858>0.05，表明差異不顯著，獲得回歸模型線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.990 4，說明99.04%響應(yīng)值的變化是由獨立變量決定的。此外模型變異系數(shù)CV=1.33%，證明該試驗值精密度及可靠性符合要求。因此，該模型擬合符合統(tǒng)計學(xué)需求，葡萄干中多酚提取最佳工藝可用此模型預(yù)測。根據(jù)F值可知，影響多酚提取的幾個因素重要性依次為料液比>乙醇濃度>溫度>提取時間。表3

用Design-Expert8.0.6軟件繪制與多酚相關(guān)的響應(yīng)面圖，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)料液比與乙醇濃度、溫度與料液比、溫度與乙醇濃度、提取時間與料液比四組交互性較強，經(jīng)過對圖7中各因素交互性進行分析發(fā)現(xiàn)料液比與乙醇濃度對試驗的影響最為顯著，因此，其曲線最為陡峭，其次為溫度與料液比。由此可見，料液比與乙醇濃度的交互作用最為顯著。圖7

2.3 最佳工藝及驗證

分析回歸模型，得出最佳提取條件為：乙醇濃度為54.2%，料液比68.3 m/g，提取溫度為79.9℃，提取時間為34.4 min，模型預(yù)測總黃酮提取率為3.663 4 mg/g。對模擬結(jié)果進行優(yōu)化，得到提取工藝為乙醇濃度54%，料液比68∶1(m/g)，提取溫度75℃，提取時間35 min，進行3次平行試驗，得到多酚提取率平均值為3.599 2 mg/g，與模型預(yù)測值基本一致，說明該模型可以用來預(yù)測葡萄干中多酚提取率。

表3 響應(yīng)面模型方差
Table 3 Analysis of variance for thetted response surface model

來源Source自由度Degree of freedom平方和Sum ofsquares均方Mean squareF值F valueP值P value模型model142.547 4260.181 959103.317 1< 0.000 1??乙醇濃度Ethanol concentration10.237 1640.237 164134.662 8< 0.0001??料液比Solid-liquid ratio10.338 6880.338 688192.308 5< 0.000 1??溫度Temperature10.012 2880.012 2886.977 1790.019 3?提取時間Extraction time10.000 290.000 290.164 7110.691NAB10.106 2760.106 27660.343 97< 0.000 1??AC10.003 3060.003 3061.877 3030.192 2NAD10.000 3240.000 3240.183 9690.674 5NBC10.386 8840.386 884219.674 4< 0.000 1??BD10.000 4840.000 4840.274 8170.608 3NCD10.103 3620.103 36258.689 53< 0.000 1??A210.436 8860.436 886248.065 6< 0.000 1??B211.088 5181.088 518618.064 9< 0.000 1??C210.204 1350.204 135115.908 5< 0.000 1??D210.036 0260.036 02620.455 60.000 5??殘差Residual140.024 6560.001 761失擬項Lack of fit100.013 110.001 3110.454 1370.858N純誤差Pure error40.011 5470.002 887總和Sum total282.572 083R2=0.990 4CV=1.33%

2.4 葡萄干品種中多酚含量的比較

對新疆主要的制干葡萄品種無核白、無核紫、無核白雞心及其他制干葡萄品種中的多酚類物質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)鄯善葡萄瓜果研究所的葡萄干品種中SP522的多酚含量最高，其次為巨玫瑰、皇家秋天兩個有核品種，無核紫多酚含量排在第四位，新疆主要的制干葡萄品種中無核紫葡萄干無核紫多酚含量最高，無核白雞心次之，無核白多酚含量最低，分別為2.08、0.96和0.82 mg/g,其他品種中SP522葡萄干多酚含量最高，達到3.94 mg/g。

3 討 論

葡萄干最佳提取工藝與其他鮮果[11、13、14]、鮮葉等樣[10、12]品的最佳提取工藝相比，料液比顯著升高，與鮮果相比提取液乙醇濃度升高，提取溫度、提取時間相比較一致。葡萄干中的高糖物質(zhì)是影響葡萄干中多酚提取的關(guān)鍵因素，主要體現(xiàn)在以下兩個方面：(1)由于葡萄干高糖的特性，不易研磨，容易凝結(jié)成團，不利于提取有效物質(zhì)成分；(2)在提取過程中提取物質(zhì)容易粘到試管壁上，需要不斷的攪拌混勻。經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，將乙醇濃度提升到54%后，樣品結(jié)團、掛壁的現(xiàn)象顯著改善；采用超聲提取后避免了重復(fù)之間系統(tǒng)性誤差較大、數(shù)據(jù)不準確的現(xiàn)象。

對新疆不同品種葡萄干多酚含量測定結(jié)果顯示，SP522多酚含量最高，SP522是一個無核品種，成熟期較早，制干特性也較好，是一個具有較高價值的葡萄干品種。目前主流葡萄干品種中無核紫含量高于其他兩個品種可能與無核紫是黑色，其他兩個品種是綠色葡萄干品種。

圖7 各因素交互作用影響多酚提取量的響應(yīng)面
Fig. 7 Response surface graphs showing the interactive effects of various factors on the yield of polyphenols

圖8 新疆主要葡萄干品種多酚含量對比
Fig. 8 Comparison of polyphenol content in main raisin varieties in Xinjiang

4 結(jié) 論

超聲波輔助條件下葡萄干中多酚物質(zhì)的最佳提取工藝是：乙醇濃度54%，料液比68∶1(m/g)，提取溫度75℃，提取時間35 min，此工藝條件下葡萄干多酚提取率平均值為3.359 2 mg/g，暗反應(yīng)時間40 min。新疆主要的制干葡萄品種中無核紫葡萄干多酚含量最高，無核白雞心次之，無核白多酚含量最低，分別為2.08、0.96和0.82 mg/g,其他品種中SP522葡萄干多酚含量最高，達到3.94 mg/g。