李春紅　王婕　吳愛明　陳慧洋　張婷　馬喆　高永紅　婁利霞

[摘要] 目的 探討磷酸川芎嗪對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞肥大的影響及可能機制。 方法 以AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞肥大為模型，將細(xì)胞隨機分為對照組、模型組、磷酸川芎嗪組、磷酸川芎嗪+NE-100組、NE-100組。采用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色，觀察細(xì)胞面積的變化;Fura-2 AM法測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化;Western blot法檢測Sigma-1受體（Sig-1R）、三磷酸肌醇受體（IP3R）與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）的蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果 給予磷酸川芎嗪干預(yù)可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞面積增加（P < 0.05），這種抑制作用可以被Sig-1R抑制劑NE-100阻斷（P < 0.05）;同時，磷酸川芎嗪干預(yù)可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的BNP mRNA表達(dá)水平的增高（P < 0.05）。AngⅡ孵育降低Sig-1R的蛋白表達(dá)水平（P < 0.05），磷酸川芎嗪有恢復(fù)Sig-1R蛋白表達(dá)水平的趨勢（P > 0.05）;磷酸川芎嗪干預(yù)可明顯降低AngⅡ誘導(dǎo)的IP3R蛋白水平的增加（P < 0.05），NE-100阻斷了這種作用（P < 0.05）;但磷酸川芎嗪干預(yù)對AngⅡ誘導(dǎo)的CaN蛋白表達(dá)水平的增加無明顯抑制作用（P > 0.05）。此外，磷酸川芎嗪可以抑制AngⅡ引起的H9c2細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的增加，NE-100阻斷了這種作用（P < 0.05）。 結(jié)論 磷酸川芎嗪對心肌細(xì)胞肥大有抑制作用，其機制可能與其通過Sig-1R干預(yù)IP3R的表達(dá)，影響細(xì)胞內(nèi)鈣平衡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 心肌細(xì)胞肥大;磷酸川芎嗪;Sigma-1受體;鈣調(diào)節(jié)

[中圖分類號] R285.5 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）05（b）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the effects of ligustrazine phosphate （ligu） on hypertrophy of H9c2 cells induced by angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ） and its possible mechanism. Methods H9c2 cells hypertrophy induced by Ang Ⅱ was used as a model. The cells were randomly divided into control group， model group， ligustrazine phosphate group， ligustrazine phosphate + NE-100 group and NE-100 group. Rhodamine-Phalloidin staining was used to observe the changes of cell area; Fura-2 AM was used to determine the changes of intracellular Ca2+ concentration; Western blot was used to detect the expression of Sigma-1 receptor （Sig-1R）， calcineurin （CaN） and inositol 1， 4， 5-trisphosphate receptor （IP3R）. Results Ligustrazine phosphate could inhibit the increase of cell area induced by Ang Ⅱ （P < 0.05）， which could be blocked by NE-100， a Sig-1R inhibitor （P < 0.05）， and Ligustrazine phosphate could inhibit the increase of BNP mRNA level induced by Ang Ⅱ （P < 0.05）. Ang Ⅱ incubation decreased the expression level of Sig-1R protein （P < 0.05）， ligustrazine phosphate had a tendency to restore the expression level of Sig-1R protein （P > 0.05）; ligustrazine phosphate intervention could significantly reduce the increase of IP3R protein level induced by Ang II （P < 0.05）， NE-100 blocked the effect （P < 0.05）; but ligustrazine phosphate intervention had no effect on the increase of CaN induced by Ang Ⅱ （P > 0.05）. In addition， ligustrazine phosphate inhibited the increase of intracellular Ca2+ in H9c2 cells induced by Ang Ⅱ， which was blocked by NE-100 （P < 0.05）. Conclusion Ligustrazine phosphate inhibits cardiomyocyte hypertrophy by interfering with the expression of IP3R through Sig-1R and affecting intracellular calcium balance.

[Key words] Cardiomyocyte hypertrophy; Ligustrazine phosphate; Sigma-1 receptor; Calcium regulation

近年來，我國心力衰竭的患病率持續(xù)增加，病死率居高不下[1-3]，而臨床上對心力衰竭的治療并無大的突破。心肌肥大是啟動心力衰竭的病理過程及心力衰竭的重要促進(jìn)因素。心肌肥大的早期，心室壁增厚、心肌收縮功能改善，為代償性過程。在持久病理性應(yīng)激情況下，心肌肥大伴隨著間質(zhì)纖維化、收縮功能失調(diào)以及基因表達(dá)、能量代謝和電生理特征的異常，最終導(dǎo)致了失代償性心力衰竭[4]。AngⅡ是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要活性成分，其在心肌肥大中發(fā)揮重要作用。抑制AngⅡ相關(guān)的心肌肥大對防治心力衰竭具有重要意義[5]。

中醫(yī)認(rèn)為，氣虛血瘀為心力衰竭的基本證候[6]，因此益氣活血法作為中醫(yī)治療心力衰竭的主要治法，貫穿心力衰竭治療的始終。從益氣活血方的活血藥川芎中提取的主要活性成分川芎嗪，研究顯示具有擴張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善腦缺血等作用[7]。同時，體外實驗研究[8-9]表明，川芎嗪抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，并認(rèn)為其機制可能與其保護線粒體結(jié)構(gòu)和功能及抑制心肌細(xì)胞內(nèi)NF-κB途徑有關(guān)。集中分布于線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（mitochondrion-as-sociated ER membrane，MAM）的Sig-1R是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的分子伴侶[10-11]，在心臟中有相對較高的表達(dá)[12-13]。研究[14]顯示，Sig-1R具有心肌細(xì)胞保護作用，能夠改善心臟肥大和心力衰竭。本研究旨在探討磷酸川芎嗪是否能通過干預(yù)Sig-1R信號通路抑制AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞肥大。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠H9c2心肌細(xì)胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所國家實驗細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺。DMEM、胎牛血清以及胰蛋白酶購自美國Gibco公司。AngⅡ（ANGT-003）購自中國杭州中肽生化有限公司，磷酸川芎嗪購自中國藥品生物制品檢定所，NE-100（SML6031）購自美國Sigma公司。Trizol購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（K1622）購自美國Thermo公司，定量PCR試劑盒購自ABI公司，所用引物由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染液（CA1610）購自北京索萊寶科技有限公司。Sig-1R一抗（15168-1-AP）與GAPDH一抗（10149-1-AP）購自美國Proteintech公司，β-actin一抗（ab8227）購自英國Abcam公司，IP3R一抗（11217）購自美國Santa Cruz公司，CaN一抗（2614S）購自美國CST公司。全蛋白提取試劑盒（KGP250）與BCA蛋白含量檢測試劑盒（KGP902）購自江蘇凱基技術(shù)生物有限公司。Fura-2AM試劑盒（S1052）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。其他試劑為市售分析純試劑。

1.2 儀器

千分之一電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司，JA1003N型）;4℃離心機（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司，TGL-16G）;Gene Quant紫外分光光度計（Phar-macia Biotech公司）;基因擴增儀GeneAmp PCR System 9700（美國ABI公司，Applied Biosystems）;實時熒光定量PCR儀Mx3000P（美國安捷倫科技公司）;激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司，F(xiàn)V1000）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 ?大鼠H9c2心肌細(xì)胞系在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中置于37℃ CO2孵育箱培養(yǎng)。長至80%～90%時去上清，加入無血清的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞分為5組：①對照組：常規(guī)培養(yǎng);②模型組：AngⅡ孵育，濃度為1 μmol/L;③磷酸川芎嗪組：AngⅡ孵育濃度為1 μmol/L，磷酸川芎嗪濃度為100 μmol/L;④磷酸川芎嗪+NE-100組：AngⅡ孵育濃度為1 μmol/L，磷酸川芎嗪濃度為100 μmol/L，Sig-1R抑制劑NE-100濃度為10 μmol/L;⑤NE-100組：NE-100濃度為10 μmol/L。不同處理組細(xì)胞孵育48 h后進(jìn)行檢測。

1.3.2 羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色測定細(xì)胞面積 ?根據(jù)試劑說明書操作。不同組細(xì)胞去上清，37℃預(yù)熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞2次，4%甲醛溶液室溫固定10 min，PBS清洗細(xì)胞2次，每次10 min。0.5%Triton X-100溶液透化處理5 min，PBS清洗細(xì)胞3次，每次10 min。取配制好的100 nm的TRITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住細(xì)胞，室溫避光孵育30 min，PBS清洗細(xì)胞3次，每次10 min。DAPI溶液（濃度：100 nmol/L）對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染約30 s，PBS清洗細(xì)胞3次，每次10 min。選擇TRITC激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=540/570 nm）和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454 nm），共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察。

1.3.3 RNA提取和RT-PCR ?細(xì)胞去上清，PBS洗3次，吸干所有液體，加Trizol裂解細(xì)胞。加氯仿室溫震蕩3 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清加異丙醇冰上放置5 min后4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清加75%乙醇洗沉淀，4℃ 12 000 r/min離心5 min棄上清，室溫晾干，加入DEPC處理H2O冰上溶解，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。取1 μg總RNA，在oligo（dT）15和M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶作用下反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系為25 μL∶5 μL cDNA，5 μmol/L上下游引物各1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，H2O 5.5 μL。反應(yīng)條件：94℃變性5 min，然后進(jìn)行30次擴增反應(yīng)：94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃延伸40 s，最后72℃延伸10 min?；蛞镄蛄袨椋築NP上游引物5′-CAGAAGCTGCTGGAGCTGATA-3′，下游引物5′-TCCGGTCTATCTTCTGCCCA-3′;內(nèi)參GAPDH上游引物5′-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3′，下游引物5′-TA-CTCAGCACCAGCATCACC-3′。

1.3.4 蛋白提取和Western blot檢測目標(biāo)分子蛋白表達(dá)水平的變化 ?收集細(xì)胞于1.5 mL EP管中，PBS清洗2遍。每管細(xì)胞（106個）加100 μL裂解液，用超聲破碎儀裂解。4℃ 12 000 r/min離心15 min。收集上清，BCA法測蛋白定量。

配制10%聚丙烯酰胺凝膠。電泳至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)預(yù)制膠底部，停止電泳。蛋白轉(zhuǎn)膜至NC膜，5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。一抗（GAPDH：1∶5000;β-actin：1∶5000;GAPDH：1∶5000;Sig-1R：1∶200;CaN：1∶200;IP3R：1∶500）4℃孵育過夜;TBST洗膜10 min，連續(xù)3次;二抗（1∶8000）室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min，連續(xù)3次。ECL化學(xué)發(fā)光，凝膠成像儀進(jìn)行掃膜成像，image J軟件進(jìn)行圖像分析，分析蛋白灰度值，以GAPDH為內(nèi)參。

1.3.5 Furu-2 AM法測定不同處理組H9c2細(xì)胞的Ca2+含量 ?大鼠H9c2心肌細(xì)胞系細(xì)胞經(jīng)不同處理分組培養(yǎng)48 h后，依據(jù)試劑盒說明操作。用D-Hank′s溶液洗滌細(xì)胞3次，加入Fura-2AM工作液，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育60 min。除去Fura-2AM工作液，用D-Hank′s溶液洗滌，并37℃培養(yǎng)箱孵育20～30 min，用酶標(biāo)儀檢測吸光值。激發(fā)波長340 nm和380 nm，發(fā)射波長510 nm。以340 nm和380 nm下的吸光度比值作為細(xì)胞內(nèi)Ca2+相對含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 磷酸川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞面積的影響

不同處理組細(xì)胞孵育48 h后，采用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色，共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞面積的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組細(xì)胞面積顯著增加（P < 0.05）;給予磷酸川芎嗪干預(yù)后，與模型組比較，細(xì)胞面積顯著降低（P < 0.05）;加用Sig-1R抑制劑NE-100后，與磷酸川芎嗪組比較，細(xì)胞面積顯著增加（P < 0.05）。由結(jié)果可知，AngⅡ孵育可以增加細(xì)胞面積，給予磷酸川芎嗪干預(yù)可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞面積的增加，同時這種抑制作用可以被NE-100阻斷。見圖1（封四）。

2.2 磷酸川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞肥大中BNPmRNA表達(dá)的影響

大鼠H9c2心肌細(xì)胞系經(jīng)不同處理分組培養(yǎng)48 h后，提取總RNA，然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，經(jīng)熒光定量PCR檢測目的基因的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AngⅡ孵育48 h后可以導(dǎo)致BNPmRNA表達(dá)顯著升高，磷酸川芎嗪能對此產(chǎn)生明顯的抑制作用（P < 0.05），給予NE-100可以部分阻斷這種抑制作用（P > 0.05）。見圖2。

與對照組比較，*P < 0.05;與模型組比較，#P < 0.05。BNP：腦鈉肽

圖2 ? H9c2不同處理組熒光定量PCR檢測BNPmRNA的表達(dá)（n = 4）

2.3 磷酸川芎嗪對AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中各目的蛋白表達(dá)的影響

大鼠H9c2心肌細(xì)胞系經(jīng)不同處理分組培養(yǎng)48 h后，提取總蛋白。進(jìn)行免疫雜交，檢測目的蛋白表達(dá)水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AngⅡ孵育降低Sig-1R的蛋白表達(dá)水平（P < 0.05），磷酸川芎嗪有恢復(fù)其表達(dá)的趨勢（P > 0.05）;鈣離子通道蛋白IP3R在AngⅡ誘導(dǎo)后表達(dá)增加，給予磷酸川芎嗪顯著抑制其表達(dá)的增加（P < 0.05），NE-100可以阻斷這種抑制作用（P < 0.05）;同時心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志性蛋白CaN在AngⅡ誘導(dǎo)后增高（P < 0.05），磷酸川芎嗪對CaN蛋白表達(dá)的抑制作用不明顯（P > 0.05）。見圖3。

2.4 Furu-2 AM法測定不同處理組H9c2細(xì)胞的Ca2+含量

大鼠H9c2心肌細(xì)胞系經(jīng)不同處理分組培養(yǎng)48 h后，依據(jù)Furu-2 AM試劑盒說明操作，檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+相對含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組細(xì)胞Ca2+含量顯著增加（P < 0.05）;磷酸川芎嗪可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的增加，NE-100阻斷了這種作用（P < 0.05）。見圖4。

3 討論

在心臟中，持續(xù)的病理應(yīng)激導(dǎo)致收縮期心肌細(xì)胞Ca2+增加[15]，產(chǎn)生病理性心肌細(xì)胞肥大。研究表明，Sig-1R是應(yīng)激損傷時細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞器間信號調(diào)節(jié)的重要分子伴侶，是細(xì)胞維持存活體系的關(guān)鍵[16]。近年來研究證實，Sig-1R作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重要的分子伴侶[10]，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+轉(zhuǎn)運通路，改善心肌細(xì)胞功能障礙，從而抑制心肌肥大的發(fā)生發(fā)展[17]，促進(jìn)細(xì)胞存活[18]。Sig-1R可介導(dǎo)快速Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+動員，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加[19]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+損失可以將Sig-1R從與GRP78的相互作用中釋放出來，使其與其他蛋白質(zhì)產(chǎn)生相互作用[18]。Sig-1R通過IP3R調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+過載，減輕心肌肥大和功能障礙[17，20-21]。已有研究[22]發(fā)現(xiàn)，在心力衰竭的人心肌細(xì)胞中，IP3R表達(dá)增加，而IP3R介導(dǎo)的Ca2+釋放可部分通過CaN依賴性機制調(diào)節(jié)心臟肥大[23]。

我們的前期在體動物研究表明，益氣活血方藥可顯著改善心肌梗死后心力衰竭大鼠心臟重構(gòu)和心臟功能，其機制與調(diào)節(jié)心肌梗死后心肌組織Sig-1R及相關(guān)分子的表達(dá)有關(guān)[24]。故本研究以體外培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞為研究對象，應(yīng)用AngⅡ刺激，建立細(xì)胞肥大模型，應(yīng)用益氣活血方藥中有效成分川芎嗪干預(yù)，探討其對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的保護作用及與Sig-1R相關(guān)的機制。結(jié)果表明，磷酸川芎嗪能減輕AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞肥大，抑制心肌肥厚分子標(biāo)志物BNP的mRNA表達(dá)增加，而NE-100可部分阻斷其抑制作用。證實磷酸川芎嗪減輕AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞肥大的部分機制與磷酸川芎嗪增加了心肌細(xì)胞中Sig-1R的表達(dá)有關(guān)。其次，本研究證實，磷酸川芎嗪可以通過Sig-1R干預(yù)IP3R的表達(dá)影響細(xì)胞內(nèi)鈣平衡，抑制心肌細(xì)胞肥大，這種保護作用可能與CaN依賴的信號通路密切相關(guān)。

總之，本研究利用AngⅡ誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞肥大模型，通過給予磷酸川芎嗪及NE-100，檢測細(xì)胞面積及細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化，以及Sig-1R、IP3R和CaN蛋白的表達(dá)，證實磷酸川芎嗪對心肌細(xì)胞肥大的抑制作用，其機制可能與其通過Sig-1R干預(yù)IP3R的表達(dá)，影響細(xì)胞內(nèi)鈣平衡有關(guān)。

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（收稿日期：2019-01-22 ?本文編輯：金 ? 虹）