溫海霞　張亞楠

[摘要] 目的 觀察Genistein對(duì)雌性大鼠卵巢顆粒細(xì)胞卵泡刺激素受體（FSHR）基因表達(dá)的影響，及其與雌激素受體（ER）的關(guān)系。 方法 選取25～28日齡雌性大鼠，皮下注射孕馬血清促性腺激素，建立促卵泡發(fā)育模型，分離卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分別給予Genistein（0、0.1、1、5、10、100 μmol/L）及雌激素受體阻斷劑ICI 182，780（1 μmol/L）處理24 h后，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)芳香化酶基因上游調(diào)控因子FSHR mRNA的表達(dá)。 結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，10 μmol/L Genistein組FSHR mRNA表達(dá)顯著增加（P < 0.05）。ICI 182，780（1 μmol/L）預(yù)處理細(xì)胞30 min后加入1和10 μmol/L Genistein，其FSHR mRNA表達(dá)分別較1和10 μmol/L Genistein組顯著下降（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 10 μmol/L的Genistein可上調(diào)雌性大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中FSHR表達(dá)，且該作用可能是通過ER介導(dǎo)的。

[關(guān)鍵詞] Genistein;雌性大鼠;卵巢顆粒細(xì)胞;卵泡刺激素受體

[中圖分類號(hào)] R966 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2019）05（b）-0016-03

[Abstract] Objective To observe the effect of Genistein on the expression of follicle stimulating hormone receptor （FSHR） gene in ovarian granulosa cells of female rats and its relationship with estrogen receptor （ER）. Methods Female rats aged 25-28 days were subcutaneously injected with pregnant mare serum gonadotrophin to establish follicular development model. Ovarian granulosa cells were isolated and cultured. Genistein （0， 0.1， 1，5， 10， 100 μmol/L） and estrogen receptor blocker ICI 182，780 （1 μmol/L） were treated for 24 hours respectively. Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to detect the expression of FSHR mRNA， an upstream regulator of aromatase gene. Results Compared with the blank control group， the expression of FSHR mRNA was significantly increased in the 10 μmol/L Genistein group （P < 0.05）. After ICI 182，780 （1 μmol/L） pretreatment for 30 minutes， the expression of FSHR in ICI 182，780 pretreated cells with 1 and 10 μmol/L Genistein was significantly lower than that in the 1 and 10 μmol/L Genistein groups （P < 0.05 or P < 0.01） respectively. Conclusion 10 μmol/L of Genistein can up-regulate the expression of FSHR in ovarian granulosa cells of female rats， and this effect may be mediated by ER.

[Key words] Genistein; Female rat; Ovarian granulosa cells; Follicle stimulating hormone receptor

Genistein（也稱染料木黃酮）是植物雌激素大豆異黃酮的主要活性成分，具有強(qiáng)抗氧化性和多重腫瘤抑制效應(yīng)[1-3]，能雙向調(diào)節(jié)雌激素受體[4-6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，Genistein可通過性腺外途徑誘導(dǎo)芳香化酶基因（CYP19）轉(zhuǎn)錄，增加局部雌激素合成，對(duì)絕經(jīng)期后雌激素來源可能有重要意義。在卵巢顆粒細(xì)胞，CYP19活性主要受卵泡刺激素（FSH）調(diào)節(jié)[8]，后者通過FSHR-AC-cAMP-PKA途徑，激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），進(jìn)而始動(dòng)芳香化酶基因轉(zhuǎn)錄[9-10]。前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，一定劑量的Genistein可影響卵巢芳香化酶基因表達(dá)，但FSHR是否參與其中，作用是否通過雌激素受體介導(dǎo)，目前尚不清楚。

本研究采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），初步探討Genistein對(duì)雌性大鼠卵巢中顆粒細(xì)胞FSHR基因表達(dá)的影響，并利用雌激素受體阻斷劑ICI 182，780進(jìn)一步觀察Genistein上述作用與雌激素受體的關(guān)系，初步揭示Genistein對(duì)卵巢局部雌激素分泌功能影響的分子機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

25～28日齡健康雌性SD大鼠，體重60～80 g，由哈醫(yī)大附屬二院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用許可證號(hào)為（黑）2013-002。

1.2 主要儀器及試劑

PCR擴(kuò)增儀（PTC-100型，美國MJ.Research）;GIS凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。Genistein、17β-雌二醇（17β-E2）及ICI 182，780（美國Sigma）;Trizol（美國Invitrogen）;BcaBESTTM RNA PCR Kit（大連Takara）;引物（上海英駿生物公司合成）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

于實(shí)驗(yàn)大鼠頸部皮下注射孕馬血清促性腺激素（PMSG，60 U/只），48 h后急性斷頭處死，立刻剝離出雙側(cè)卵巢，小號(hào)針頭反復(fù)刺破卵泡并反復(fù)吹打，充分釋放出顆粒細(xì)胞，200 μm濾網(wǎng)去除多余殘?jiān)?，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，1100 r/min離心5 min，棄上清液。向細(xì)胞沉淀中加入2 mL新鮮配制的DMEM/F12培養(yǎng)液（含青、鏈霉素），混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度至（3×105～5×105）/mL。將細(xì)胞懸液分裝至6孔培養(yǎng)板上，置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入一定濃度Genistein、17β-E2及ICI 182，780處理。

1.4 細(xì)胞分組及處理

實(shí)驗(yàn)共分9組：0 μmol/L Genistein組（空白對(duì)照組，A組）;10 nmol/L 17β-E2組（B組）;0.1 μmol/L Genistein組（C組）;1 μmol/L Genistein組（D組）;5 μmol/L Genistein組（E組）;10 μmol/L Genistein組（F組）;100 μmol/L Genistein組（G組）;1 μmol/L ICI預(yù)處理30 min后加1 μmol/L Genistein組（H組）;1 μmol/L ICI 182，780預(yù)處理30 min后加10 μmol/L Genistein組（I組）。上述因素繼續(xù)處理細(xì)胞24 h后，收集至1.5 mL Eppendorf管中，-70℃保存，用于總RNA提取和RT-PCR。上述實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

采用RT-PCR法檢測(cè)FSHR基因mRNA表達(dá)。采用Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄按BcaBESTTM RNA PCR Kit說明書操作。通過Gene Runner軟件設(shè)計(jì)引物，以β-actin作為內(nèi)參。引物的序列和產(chǎn)物長度見表1。PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性1 min，94℃變性4 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)次數(shù)為35次，72℃充分延伸10 min。產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描后進(jìn)行條帶灰度分析，以FSHR基因與β-actin灰度比值代表前者相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠卵巢中顆粒細(xì)胞FSHR mRNA的表達(dá)情況

RT-PCR電泳結(jié)果顯示，各組細(xì)胞均擴(kuò)增出一條清晰的、大小約為481 bp的FSHR特異片段。見圖1。

2.2 Genistein對(duì)顆粒細(xì)胞FSHR mRNA表達(dá)的影響

掃描的條帶分析結(jié)果顯示，與空白對(duì)照（A組）比較，10 μmol/L Genistein組（F組）FSHR mRNA表達(dá)明顯增加（P < 0.05），10 nmol/L 17β-E2組（B組）FSHR mRNA表達(dá)降低（P < 0.05），100 μmol/L Genistein組（G組）FSHR mRNA表達(dá)也明顯降低（P < 0.01）。用ICI 182，780（1 μmol/L）預(yù)先處理細(xì)胞30 min后，分別加1 μmol/L Genistein（H組）和10 μmol/L Genistein（I組）繼續(xù)處理細(xì)胞24 h，發(fā)現(xiàn)H組FSHR mRNA表達(dá)較D組明顯降低（P < 0.05），I組FSHR mRNA表達(dá)較F組明顯降低（P < 0.01）。見圖2。

3 討論

近年研究證實(shí)，植物雌激素Genistein可增加女性卵巢癌細(xì)胞對(duì)常規(guī)性化療藥物的敏感性[10]，調(diào)節(jié)女性內(nèi)分泌活動(dòng)，改善圍絕經(jīng)期綜合征臨床癥狀[12-14]。前期在體實(shí)驗(yàn)[15-17]也發(fā)現(xiàn)，Genistein上調(diào)雌性衰老大鼠的ER-α表達(dá)，并促進(jìn)雌激素生成關(guān)鍵酶芳香化酶基因表達(dá)，但具體的分子機(jī)制尚不十分清楚。

Genistein可調(diào)節(jié)男性生殖系統(tǒng)FSHR表達(dá)[18]，并且Genistein能通過激活PKC和p38而促使DNA結(jié)合FSHR下游因子CREB，并促進(jìn)芳香化酶基因CYP轉(zhuǎn)錄[19-20]。本研究觀察了Genistein對(duì)雌性大鼠卵巢中顆粒細(xì)胞FSHR mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 μmol/L Genistein作用細(xì)胞24 h，可增加FSHR mRNA的表達(dá)（P < 0.05），并且ER阻斷劑ICI 182，780可明顯抑制1 μmol/L和10 μmol/L Genistein對(duì)FSHR 基因表達(dá)的上調(diào)作用（P < 0.05或P < 0.01），提示Genistein對(duì)FSHR表達(dá)的這種促進(jìn)作用可能與調(diào)節(jié)ER有關(guān)[21]。

Genistein對(duì)子宮內(nèi)膜CYP19的啟動(dòng)子Ⅰ的影響可能通過一種新型膜性ER（G蛋白偶聯(lián)雌激素受體，GPER）介導(dǎo)[22]。然而，GPER是否也介導(dǎo)了Genistein對(duì)卵巢CYP19及上游FSHR表達(dá)的影響，還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2018-09-29 ?本文編輯：王 ? 蕾）