84K楊4CL3/4CL5基因克隆及生物信息學(xué)分析

孫曉莎 王 遂 趙曦陽(yáng) 曲冠證

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040)

木質(zhì)素由三種不同木質(zhì)素單體通過(guò)不同比例組成，分別為香豆醇(p-coumaryl alcohol，H型)，松柏醇(Coniferyl alcohol，G型)，芥子醇(Sinapyl alcohol，S型)。不同的植物品種中木質(zhì)素單體的比例大致是相近的，例如在楊樹(shù)中，S型和G型木質(zhì)素單體比值大約為2∶1[1～2]。不同單體的化學(xué)特性有所不同，例如G型單體C5位置形成C-C鍵，該鍵在化學(xué)降解作用具有高度穩(wěn)定性，而S型木質(zhì)素單體的醚鍵在化學(xué)降解過(guò)程中穩(wěn)定性則弱一些，因此在Kraft制漿工藝中，G型單體比S型單體更難去除[3]。木質(zhì)素單體的合成由三個(gè)代謝途徑共同完成。第一個(gè)代謝途徑：莽草酸代謝途徑(Shikimate pathway)；第二個(gè)代謝途徑：苯丙烷類代謝途徑(General phenylpropanoid pathway)；第三個(gè)代謝途徑：木質(zhì)素合成的特異途徑(General phenylpropanoid pathway)。在代謝途徑中有幾種重要的酶如：4-香豆酰-CoA連接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase，4CL，EC6.2.1.12)、苯丙氨酸脫氨酶(Phenylalanine Ammonia-Lyase，PAL)及肉桂酸-4羥化酶(Cinnamate 4-Hydroxylase，C4H)等，其中4CL酶主要催化4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、5-羥基阿魏酸和芥子酸等，生成相應(yīng)的?；鵆oA酯，如香豆酰-、咖啡酰-、阿魏酰-、5-羥基阿魏酰-和芥子酰-CoA等。這些CoA將進(jìn)入木質(zhì)素合成特殊途徑，經(jīng)由肉桂酰-CoA還原酶(Cinnamoyl-CoA reductase，CCR)和肉桂醇脫氫酶(Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD)的作用下，最終形成木質(zhì)素單體-香豆醇、松柏醇和芥子醇[4～5]。在1999年，首次成功地通過(guò)降低白楊(Populustremuloides)4CL基因表達(dá)促使羥基肉桂酸酯在木質(zhì)素合成途徑中無(wú)法被活化，從而降低了45%的木質(zhì)素含量，并使纖維素的含量增加了15%。此后，降低4CL表達(dá)的策略在其它樹(shù)種中也得到了驗(yàn)證[6]。吳錦程等人在枇杷中發(fā)現(xiàn)低溫(4℃)會(huì)增加果肉和木質(zhì)素含量，該過(guò)程主要是由于PAL酶升高導(dǎo)致[7]。因此推斷降低4CL酶活可能會(huì)保持果肉含量不變而降低木質(zhì)素合成含量。木質(zhì)素填充于纖維素構(gòu)架中，可起到增強(qiáng)植物體的機(jī)械強(qiáng)度、有利于根部輸導(dǎo)組織的水分運(yùn)輸及抵抗不良外界環(huán)境的侵襲。另一方面木質(zhì)素是制漿造紙業(yè)的不利因素，除去纖維素中的木質(zhì)素，需要消耗大量能源，提高了造紙成本。4CL作為重要的木質(zhì)素合成關(guān)鍵基因之一，研究4CL有助于了解木質(zhì)素合成，進(jìn)而提高木材抗壓性。此外抑制4CL基因表達(dá)可以減少木質(zhì)素積累，降低造紙成本。

楊樹(shù)是我國(guó)重要的造林和用材樹(shù)種，也是研究林木生理和基因工程的模式植物。84K楊由韓國(guó)育種學(xué)家以銀白楊(Populusalba)為母本，腺毛楊(P.glandulosa)為父本雜交培育出來(lái)的品種，為雄性無(wú)性系，1984年引入我國(guó)。84K楊抗逆性強(qiáng)，具有較強(qiáng)的抗旱、抗寒、抗病、抗風(fēng)能力，以及根系發(fā)達(dá)、造林成活率高等優(yōu)良特征[8]；同時(shí)還具有材質(zhì)好，苗期生長(zhǎng)快，樹(shù)體高大直立等優(yōu)點(diǎn)。此外，84K楊為雄性，無(wú)“飛絮”，是一種不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染的優(yōu)良品種。84K楊具備分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、遺傳轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)，是楊樹(shù)基因工程研究的絕佳材料。因此，本研究以84K楊為材料，采用同源克隆的方法獲得了Pag4CL3/4CL5基因并進(jìn)行生物系信息學(xué)分析，為楊樹(shù)木質(zhì)素合成的遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

84K楊(Populusalba×P.glandulosa)由東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1Pag4CL3/4CL5基因克隆

將84K楊野生型植株草炭土培養(yǎng)28天，培養(yǎng)室溫度為22±2℃，光照強(qiáng)度為200～300 μmol·m-2·s-1，光周期為16 h/8 h。相對(duì)濕度為40%。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的植株分別取葉、莖、根以及頂芽四個(gè)部分用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取RNA，并利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)已公布的毛果楊(PopulustrichocarpaTorr.&A.Gray)基因組信息，設(shè)計(jì)Pag4CL3基因和Pag4CL5基因特異性引物見(jiàn)表1，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，通過(guò)PCR方法，克隆出Pag4CL3/4CL5兩個(gè)基因。PCR反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min 45 s，30個(gè)循環(huán);最后72℃ 7 min。用Biospin Gel Extraction Kit試劑盒回收PCR產(chǎn)物，回收產(chǎn)物與pEASY連接載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(Trans1-T1)，涂于LB固體培養(yǎng)基(含50 mg·mL-1卡那霉素)，37℃培養(yǎng)12 h后，隨機(jī)挑取單克隆，用液體LB培養(yǎng)基(含卡那霉素)進(jìn)行37℃振蕩培養(yǎng)，6 h后，用全式金的Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒提取質(zhì)粒DNA并進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性單克隆菌液送往哈爾濱擎科生物公司測(cè)序。

表1Pag4CL3/4CL5基因克隆及定量引物

Table 1Pag4CL3/4CL5 gene cloning and quantitative primers

引物名稱Primer name引物序列Primer sequence4CL3-FTCTAGATCTGCATCTTTAGCCCGCAATG4CL3-RGGTACCTGTTCAGTAACGTCTTCAGTTA4CL5-FTCTAGACCCTCTGCAACTTTAGCCCACAATG4CL5-RGGTACCATATGCCCTTTACAATCTTCATTTA4CL3-RT-FGGCAGACGAAAATGAAGCGCCT4CL3-RT-RACCGACTCTCAGCCCGCAGA4CL5-RT-FACACAGGCTGATGATGATGATATGCC4CL5-RT-RGCAGCACCAGCTCTCAACCCAActin-FTACAACGAGCTTCGTGTTGCActin-RACAAGGAAAGGACAGCCTGA

1.2.2Pag4CL3/4CL5基因的生物信息學(xué)分析

通過(guò)在線軟件DNAMAN和BioEdit進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析；利用在線軟件MEME(http://meme.Nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)進(jìn)行4CL蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析；利用在線網(wǎng)站ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行蛋白的理化性質(zhì)分析；利用SOPM(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.ht ml)預(yù)測(cè)4CL蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)4CL蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)及預(yù)測(cè)4CL基因編碼蛋白的功能；利用ProtScale軟件(http://web.Expasy.org/protscale/)進(jìn)行疏水性進(jìn)行分析；利用TMpred軟件(https://embnet.vital-it.ch/cgi-bin/TMPRED_form_parser)進(jìn)行4CL蛋白序列跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)。利用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3Pag4CL3/4CL5基因在84K楊不同組織中的表達(dá)模式分析

利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)定量引物，由哈爾濱市擎科生物公司合成。qRT-PCR通過(guò)SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒，以不同組織部位cDNA為模板，并重復(fù)3次，進(jìn)行定量檢測(cè)。反應(yīng)體系為：SYBR Mixture 10 μL、模板2 μL、水6.4 μL、上游引物0.8 μL、下游引物0.8 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 5 s,60℃ 35 s,40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s；60℃ 1 min;95℃ 15 s。數(shù)據(jù)分析采用ΔΔCt法，得到Pag4CL3/4CL5基因在不同組織部位的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pag4CL3/4CL5基因全長(zhǎng)克隆及其編碼的氨基酸序列分析

根據(jù)毛果楊4CL基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增，克隆得到兩個(gè)84K楊4CL基因(Pag4CL3和Pag4CL5)(圖1)，Pag4CL3基因cDS全長(zhǎng)1 623 bp，編碼一個(gè)由540個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白序列(圖2)；Pag4CL5基因cDS全長(zhǎng)1 632 bp，編碼一個(gè)由543個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白序列(圖3)。GenBank登錄號(hào)分別為MK183033(Pag4CL3)和MK183034(Pag4CL5)。對(duì)84K楊4CL基因編碼的蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示Pag4CL3蛋白的氨基酸中共含有70個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基，58個(gè)帶正電荷氨基酸殘基，蛋白的分子質(zhì)量為58 987.28 Da，等電點(diǎn)為5.52，不穩(wěn)定系數(shù)為36.50，該值小于40，為穩(wěn)定蛋白；脂肪族指數(shù)為98.44，蛋白疏水性平均值為-0.027，為親水性蛋白。Pag4CL5蛋白的氨基酸中共含有67個(gè)帶負(fù)電荷氨基酸殘基，59個(gè)帶正電荷氨基酸殘基，蛋白的分子質(zhì)量為59 268.57 Da，等電點(diǎn)為5.72，不穩(wěn)定系數(shù)為35.66，為穩(wěn)定蛋白；脂肪族指數(shù)為96.10，蛋白疏水性平均值為-0.060，為親水性蛋白。

圖1 Pag4CL3/4CL5基因PCR產(chǎn)物 M.DL5000 marker；1.Pag4CL3基因的PCR產(chǎn)物；2.Pag4CL5基因的PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR product of Pag4CL3/4CL5 gene M.DL5000 marker;1.PCR product of Pag4CL3 gene;2.PCR product of Pag4CL5 gene

2.2 84K楊4CL蛋白結(jié)構(gòu)域及二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圖2 Pag4CL3基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and its deduced amino acid sequence of Pag4CL3

我們與毛果楊、青楊及毛白楊三種楊樹(shù)的4CL蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pag4CL3與Pt4CL3蛋白相似性高達(dá)97%；Pag4CL5與Pt4CL5蛋白相似性也達(dá)到97%。此外，這四種楊樹(shù)4CL蛋白均包含SSGTTGLPKGV和GEICIRG兩個(gè)基序(圖4)，這兩個(gè)基序構(gòu)成了4CL家族標(biāo)志性的保守結(jié)構(gòu)域。SSGTTGLPKGV被認(rèn)為是4CL催化反應(yīng)中結(jié)合AMP保守積序[9]；GEICIRG催化活動(dòng)中心[10]。

圖4 Pag4CL3、Pag4CL5與Pt4CL3、Pt4CL5、PtC4CL、Pc4CL蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 Structural domain analysis of Pag4CL3,Pag4CL5 with Pt4CL3,Pt4CL5,PtC4CL and Pc4CL

圖5 Pag4CL3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析Fig.5 Secondary structure prediction and analysis of Pag4CL3 protein

圖6 Pag4CL5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析Fig.6 Secondary structure prediction and analysis of Pag4CL5 protein

圖7 4CL蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) A.Pag4CL3編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；B.Pag4CL5編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 The encoding protein tertiary structure prediction of 4CL A.Pag4CL3 encoded protein tertiary structure; B.Pag4CL5 encoded protein tertiary structure

應(yīng)用SOPMA在線軟件對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。84K楊4CL3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由32.04%的α螺旋(α helix)、20.0%的延伸鏈(extended strand)、7.41%的β轉(zhuǎn)角(β turn)和40.56%無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)組成(圖5)；84K楊4CL5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由32.60%的α螺旋(α helix)、18.60%的延伸鏈(extended strand)、7.00%的β轉(zhuǎn)角(β turn)和41.80%無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)組成(圖6)。

運(yùn)用在線軟件SWISS-MODEL得到蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果：4CL蛋白質(zhì)的多肽鏈在各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上再進(jìn)一步盤曲或折疊形成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)。Pag4CL3蛋白三維結(jié)構(gòu)由一個(gè)PDB號(hào)為3a9u.1.A的結(jié)構(gòu)為模板建立，3a9u.1.A屬于4-coumarate—CoA ligase，序列的相似性為0.6，范圍為9～536 aa，平均值為0.99(圖7A)；Pag4CL5蛋白三維結(jié)構(gòu)由一個(gè)PDB號(hào)為3a9v.1.A的結(jié)構(gòu)為模板建立，3a9v.1.A屬于4-coumarate—CoA ligase，序列的相似性為0.57，范圍為9～536 aa，平均值為0.98(圖7B)。

2.3 4CL基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

在NCBI網(wǎng)站下載4CL蛋白序列包括：毛果楊4CL3(Populustrichocarpa，XP_002297699)、毛果楊4CL5(Populustrichocarpa，XP_002304825)毛白楊4CL(Populustomentosa，AAL56850)、青楊4CL(Populuscathayana，AJA91785)、白花泡桐4CL(Paulowniafortunei，ACL31667)、赤桉4CL(Eucalyptuscamaldulensis，ACX68559)、擬南芥4CL1(Arabidopsisthaliana，AAQ86588)、擬南芥4CL2(Arabidopsisthaliana，AAQ86587)、擬南芥4CL3(Arabidopsisthaliana，AAQ86589)、擬南芥4CL5(Arabidopsisthaliana，AAQ86591)、葡萄4CL(Wine grape，XP_002274994)、白桑4CL(Morusalbavar.multicaulis，AHL83551)、陸地棉4CL(Gossypiumhirsutum，ADU15550)、山葡萄4CL(Vitisamurensis，AWY10751)、珊瑚菜4CL(Glehnialittoralis，ATG32161)、棗4CL(Ziziphusjujuba，ALM23512)、石榴4CL(Punicagranatum，AFU90743)、蘋果4CL(Malushybridcultivar，AFG30056)、大麻槿4CL(Hibiscuscannabinus，ADK24217)、辣椒4CL(Capsicum annuum，AAG43823)以及芝麻4CL(Sesamumindicum，ALA55541)，并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖8)。依照進(jìn)化樹(shù)的推斷得知Pag4CL3/4CL5與毛果楊4CL、毛白楊4CL及青楊4CL被分為同一個(gè)分支上，說(shuō)明它們?cè)谶M(jìn)化的過(guò)程中親緣關(guān)系最為密切。

圖8 4CL蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.8 The clustering analysis of 4CL protein family

圖9 4CL保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.9 The conservative structure domain analysis of 4CL

利用在線軟件MEME對(duì)Pag4CL3/4CL5進(jìn)行蛋白序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pag4CL3/4CL5蛋白與其它楊樹(shù)中4CL蛋白一致，基序種類、排序方式及基序位置都非常保守。這一結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)相吻合(圖9)。

2.4 84K楊Pag4CL3/4CL5功能預(yù)測(cè)

利用GenScript在線預(yù)測(cè)Pag4CL3/4CL5蛋白序列亞細(xì)胞定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表2)，Pag4CL3/4CL5蛋白可能是一種膜蛋白，主要在質(zhì)膜上行使功能。

表2 Pag4CL3/4CL5蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

Table 2 Subcellular localization prediction of Pag4CL3/4CL5 protein

細(xì)胞結(jié)構(gòu)Cell structure4CL3(%)4CL5(%)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Endoplasmic reticulum55.6043.50線粒體Mitochondrion33.3334.80細(xì)胞核Nucleus11.1017.40囊泡Vesicles04.30

利用ProtScale軟件對(duì)蛋白疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果表明：在Pag4CL3蛋白的81～85區(qū)域、92～96區(qū)域、230～238區(qū)域、243～246區(qū)域、248～258區(qū)域、266～268區(qū)域、278～286區(qū)域、342～348區(qū)域、454～457區(qū)域、480～483區(qū)域以及515～518區(qū)域具有很強(qiáng)的疏水性，其中疏水性最強(qiáng)的在233，高達(dá)2.9(圖10)；在Pag4CL5蛋白的81～85區(qū)域、92～96區(qū)域、231～238區(qū)域、243～246區(qū)域、248～260區(qū)域、266～268區(qū)域、278～289區(qū)域、342～348區(qū)域、465～467區(qū)域、480～483區(qū)域以及517～518區(qū)域具有很強(qiáng)的疏水性，其中疏水性最強(qiáng)的在233，高達(dá)2.9(圖11)。

圖10 Pag4CL3疏水性分析Fig.10 Hydrophobicity analysis of Pag4CL3

圖11 Pag4CL5疏水性分析Fig.11 Hydrophobicity analysis of Pag4CL5

圖12 Pag4CL3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.12 Transmembrane domain prediction of Pag4CL3 protein

圖13 Pag4CL5蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.13 Transmembrane domain prediction of Pag4CL5 protein

圖14 Pag4CL3基因在不同組織中的表達(dá)分析Fig.14 Relative expression levels of Pag4CL3 in different organs

圖15 Pag4CL5基因在不同組織中的表達(dá)分析Fig.15 Relative expression levels of Pag4CL5 in different organs

利用TMpred軟件對(duì)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果為Pag4CL3蛋白從內(nèi)到外共有1個(gè)跨膜區(qū)域在229～254 aa。從外到內(nèi)有2個(gè)跨膜區(qū)域，在73～96 aa以及330～350 aa(圖12)；Pag4CL5蛋白從內(nèi)到外共有1個(gè)跨膜區(qū)域，241～259 aa，從外到內(nèi)有2個(gè)跨膜區(qū)域，在73～96 aa以及330～350 aa(圖13)。

2.5 Pag4CL3/4CL5基因組織表達(dá)特異性分析

為了研究Pag4CL3/4CL5基因在不同組織部位中的表達(dá)特異性，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，分析其在不同部位的表達(dá)差異。如圖14～15所示：Pag4CL3主要在葉及莖中表達(dá)，根和頂芽中表達(dá)量較低；與葉組織相比，頂芽中4CL3轉(zhuǎn)錄本低10倍左右。Pag4CL5主要在葉及根中表達(dá)，莖和頂芽葉中表達(dá)量較低；與根組織相比，頂芽中4CL5轉(zhuǎn)錄本低6.5倍左右。綜上所述，兩種同源基因的表達(dá)具有一定的組織部位差異性。

3 討論

4CL是苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶，也是木質(zhì)素合成中重要的限速酶之一[11]。已被證實(shí)，大多數(shù)維管植中存在多種4CL同工酶。在模式植物擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)了14個(gè)4CL基因或類似基因[12]。其中只有4CL1、4CL2、4CL3及4CL5編碼的蛋白具有催化活性，剩余的4CL基因及蛋白功能仍不清楚[13]。此外，擬南芥中4CL1、4CL2及4CL5與木質(zhì)素合成相關(guān)，4CL3與黃酮素合成有關(guān)[14]。在白洋麻中也克隆出一個(gè)4CL基因，該基因被認(rèn)為與木質(zhì)素合成有關(guān)[15]。山楊中已被鑒定出兩個(gè)結(jié)構(gòu)和功能不同的4CL基因Pt4CL1和Pt4CL2，其中Pt4CL1被認(rèn)為與莖中木質(zhì)素生物合成有關(guān)，Pt4CL2被認(rèn)為參與黃酮類物質(zhì)的生物合成[16]。本實(shí)驗(yàn)首次克隆出84K楊中的Pag4CL3基因和Pag4CL5基因，通過(guò)對(duì)Pag4CL3/4CL5編碼的蛋白與其他楊樹(shù)4CL蛋白比較發(fā)現(xiàn)，均含有SSGTTGLPKGV保守結(jié)構(gòu)域及GEICIRG催化活動(dòng)中心。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)Pag4CL3/4CL5蛋白與毛果楊4CL、毛白楊4CL及青楊4CL蛋白分為同一個(gè)分支，親緣關(guān)系較近。已有報(bào)道稱毛白楊4CL蛋白能催化咖啡酸(caffeic acid)和阿魏酸(ferulic acid)生成相應(yīng)的大CoA硫酯，不能催化芥子酸[17]。擬南芥中只有4CL5能催化芥子酸形成相應(yīng)的CoA硫酯，以用于合成木質(zhì)素單體。推測(cè)Pag4CL3/4CL5同毛白楊4CL蛋白一樣不具有催化芥子酸的能力。

4CL基因在植物不同組織中的表達(dá)存在差異。美洲山楊Pt4CL1在木質(zhì)化的組織中特異性表達(dá)；Pt4CL2的mRNA豐度在莖及葉的表皮層中得到積累。歐芹花莖中4CL基因的表達(dá)量遠(yuǎn)高于非生殖莖中4CL基因的表達(dá)量[18]。在擬南芥中At4CL1主要在幼根及抽薹莖中表達(dá)；At4CL2主要在幼根中表達(dá)；At4CL3在花和果莢中表達(dá)，在花中表達(dá)量最高[19]。本實(shí)驗(yàn)克隆的Pag4CL3/4CL5在序列上具有極高的相似性，可能執(zhí)行近似的功能，但組織部位的表達(dá)差異性又導(dǎo)致了其在空間上的分工差異。Pag4CL3在葉及莖中表達(dá)較高，根和頂芽葉中表達(dá)量較低；Pag4CL5在葉及根中表達(dá)較高，莖和頂芽中表達(dá)量較低。推測(cè)Pag4CL3可能主要在葉和莖中行使功能，Pag4CL5主要在葉和根中行使功能。楊樹(shù)作為重要的經(jīng)濟(jì)樹(shù)種，是造紙工業(yè)的重要原材料。上述結(jié)果為今后研究楊樹(shù)4CL基因的功能及改良木質(zhì)素生物合成奠定了理論基礎(chǔ)。