王思瑩 趙修華 趙冬梅

(東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

以天然或合成的高分子材料為載體的納米給藥系統(tǒng)，將藥物包封于其中或吸附于其表面，具有降低藥物不良反應(yīng)、調(diào)節(jié)藥物釋放速率、靶向聚集于腫瘤部位等優(yōu)點，使之成為近年來抗腫瘤藥物劑型開發(fā)最為活躍的研究方向之一，具有巨大的應(yīng)用前景[1～3]。自上世紀(jì)90年代以來，以聚乳酸—羥基乙酸共聚物(poly lactic-co-glycolicacid，PLGA)為代表的生物降解性聚合物的納米給藥系統(tǒng)就開始作為治療疾病的有效手段開始研究[4]。PLGA由乳酸和羥基乙酸聚合而成，在人體內(nèi)水解生成乳酸單體，參與人體內(nèi)的三酸循環(huán)，最終降解為二氧化碳和水后排出體外。在1997年通過FDA認證并批準(zhǔn)收錄為藥用輔料[5]。PLGA作為藥物載體，因具有其良好的生物可降解性、組織相容性、優(yōu)良的成球性能及降解速率，被認為是最有發(fā)展前途的可降解高分子材料，已廣泛用于藥物傳遞系統(tǒng)的研究[6～7]。

PLGA作為藥物載體，制備納米載藥系統(tǒng)的制備方法較為多樣。乳化溶劑揮發(fā)法由于操作簡便及過程可控，是制備納米微粒最常用的方法。粒徑分布、載藥率、包封率及緩釋特性等是評價納米微粒制備工藝的重要參數(shù)。為獲得較高載藥率和包封率、粒徑分布均勻、大小合適的納米微球，乳化溶劑揮發(fā)法在制備PLGA微粒時，通常要考慮PLGA修飾的末端基團、PLGA的合適分子量、PLGA濃度、PLGA與藥物質(zhì)量比、攪拌速率以及表面活性劑的用量等相關(guān)因素[6]。乳化溶劑揮發(fā)法適用于封裝疏水性藥物。

紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)最早是從太平洋紫杉(Taxusbrevifolia)樹皮中提取出來的，具有獨特抗癌活性的二萜類化合物，是已廣泛應(yīng)用于臨床的抗腫瘤藥物。紫杉醇不溶于水，現(xiàn)有臨床應(yīng)用的紫杉醇注射液易引起過敏反應(yīng)、中性粒細胞減少、骨髓抑制及室性心律不齊等不良反應(yīng)，極大地影響了其臨床應(yīng)用。臨床對抗腫瘤藥物的需求促使提高水溶性及增加靶向性紫杉醇新制劑的開發(fā)研究。近年來紫杉醇制劑的研究進展非常迅速，已經(jīng)應(yīng)用于臨床的紫杉醇脂質(zhì)體制劑(Lip-PTX)體內(nèi)外抗腫瘤活性與紫杉醇注射液相接近[8]。紫杉醇白蛋白納米粒(abraxane，capxol)用人血白蛋白作為藥物載體，利用白蛋白結(jié)合—釋放的特征，替代有機溶劑，促進藥物進入腫瘤細胞內(nèi)[9～10]。此外，利用可生物降解的高分子聚合物制備的納米膠束[11～12]、靶向性納米粒[13～14]等藥物傳遞系統(tǒng)的研究不斷出現(xiàn)，為開發(fā)臨床新劑型及提高其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

本文實驗以PLGA為載體，PVA為乳化劑，紫杉醇為模型藥物，用乳化溶劑揮發(fā)法制備PTX-PLGA NPs納米給藥系統(tǒng)，采用正交實驗設(shè)計，以納米微球的平均粒徑和載藥率為檢測指標(biāo)，對處方工藝進行優(yōu)化篩選，采用掃描電子顯微鏡、激光粒度分析儀、紅外光譜對其表面形態(tài)和理化性質(zhì)進行表征?？疾炝薖TX-PLGA NPs凍干粉復(fù)溶后粒徑的12 h穩(wěn)定性，為進一步進行載藥納米粒的體外釋放、體內(nèi)轉(zhuǎn)運及腫瘤細胞靶向性研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

羧基封端的乳酸—羥基乙酸共聚物(PLGA-COOH，LA/GA:50∶50,分子質(zhì)量12 kDa)濟南岱罡生物工程有限公司)、紫杉醇(純度>98%西安天豐生物科技有限公司)；聚乙烯醇PVA4-88(阿拉丁試劑有限公司)，甘露醇(Man，Mannitol，分析純，阿拉丁試劑有限公司)，二氯甲烷為分析純，乙腈和甲醇為色譜純，實驗所用水均為去離子水。

1.2 儀器

JSM-7500F冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM，日本電子公司)；激光粒度儀(LLS,美國布魯克海文)；HPLC色譜儀(日本島津公司)；FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(常州市國旺儀器制造有限公司)；Scientz-18N型冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 PTX-PLGA NPs制備方法

PTX-PLGA NPs納米微球的制備采用的是改良一次乳化法。精密稱取一定量的紫杉醇和PLGA，用定量二氯甲烷溶解，將其勻速滴加到定量的含乳化劑PVA水相中，滴加完畢后繼續(xù)高速剪切5 min，形成納米乳，在室溫下磁力低速攪拌使二氯甲烷完全揮發(fā)，于12 000 r·min-1高速離心15 min，收集沉淀，以去離子水反復(fù)洗滌后，加入2.5%甘露醇冷凍干燥即得PTX-PLGA NPs凍干粉。

1.4 正交設(shè)計優(yōu)化PTX-PLGA NPs的制備工藝

1.4.1 因素與水平

在前期單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取對紫杉醇PLGA納米粒制備影響較大的4個因素:PLGA與紫杉醇質(zhì)量比(A)、乳化劑質(zhì)量濃度(B)、油相用量(C)、剪切速度(D)。每個因素選擇5個水平，以粒徑和載藥率為評價指標(biāo)，按照正交表L25(56)設(shè)計實驗進行處方工藝優(yōu)化。

1.4.2 正交試驗

采用多指標(biāo)試驗綜合加權(quán)評分法處理數(shù)據(jù)。將最大粒徑及載藥率定為100分，權(quán)重系數(shù)均為0.5，以下面公式計算綜合評分:綜合評分=0.5×100×(粒徑/最大粒徑)+0.5×100×(載藥率/最大載藥率)通過正交試驗的直觀分析和方差分析優(yōu)化處方及最佳制備工藝[15]。

1.5 納米粒的表征

1.5.1 粒徑和zeta電位測定

取PTX-PLGA NPs溶液，以去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，于25℃下以激光粒度儀測定納米粒的粒徑。用zeta電位儀測定納米粒的zeta電位。

1.5.2 形態(tài)學(xué)考察(掃描電子顯微鏡)

取PTX-PLGA NPs凍干粉，掃描電子顯微鏡下觀察納米粒的形態(tài)并拍照。

1.5.3 載藥率測定

載藥率是納米粒質(zhì)量評價的重要指標(biāo)，采用HPLC測定納米粒的載藥量。取1 mg PTX-PLGA NPs凍干粉用甲醇溶解后過濾，用HPLC測定樣品中紫杉醇含量。紫杉醇的測定波長為227 nm，流動相為水∶乙腈∶甲醇(體積比250∶255∶525)，流速為1.0 mL·min-1。按公式計算載藥納米粒的載藥率(DL)：

載藥率(DL)=m包/m總×100%

(1)

式中：m包為納米粒中包裹的藥物質(zhì)量(mg)；m總為載藥納米粒的總質(zhì)量(mg)。

1.5.4 紅外光譜檢測

采用傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer,FT-IR spectrometer)掃描空白KBr為背景，分別掃描PLGA、PTX-PLGA NPs凍干粉兩個樣品的FT-IR圖譜。

樣品的制備采用溴化鉀壓片法，取200 mg溴化鉀置于瑪瑙研缽中，加入2 mg樣品，研磨混勻，移置壓模。掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.6 PTX-PLGANPs溶液12 h穩(wěn)定性考察

為了評價復(fù)溶后含凍干保護劑的樣品穩(wěn)定性，借助激光粒度儀來完成對樣品粒徑的檢測。采用激光粒度儀每隔1 h，監(jiān)測復(fù)溶后PTX-PLGA NPs的連續(xù)12 h內(nèi)在室溫下粒徑變化。

表1 正交試驗結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 PTX-PLGA NPs正交試驗設(shè)計處方及制備工藝的篩選優(yōu)化

以紫杉醇為模型藥物，PLGA為載體，采用改良乳化—溶劑揮發(fā)法制備25批納米粒，以載藥納米粒的粒徑和載藥率為評價指標(biāo)，采用綜合加權(quán)評分法對測定結(jié)果進行分析。從直觀分析結(jié)果表1可知，影響PTX-PLGA NPs制備的因素主次順序A>B>D>C，即對載藥率影響最大的是PLGA與紫杉醇的質(zhì)量比，其次是PVA用量，接著是均質(zhì)速度和DCM用量。經(jīng)計算分析之后，得出復(fù)合微球最佳制備工藝是A3B1C3D5，即PLGA∶紫杉醇=4∶1，PVA用量0.1%，DCM用量3 mL，均質(zhì)速度為16 000 r·min-1。

從方差分析結(jié)果(表2)可知，A因素對納米粒的制備影響顯著，其他因素均對納米粒的制備無顯著性影響。

表2 方差分析

F0.05=6.390

2.2 PTX-PLGA NPs的表征

2.2.1 形態(tài)學(xué)表征

SEM是研究納米微球形貌的有效方法。由圖1可見，制得的PTX-PLGA NPs呈球形，粒徑均勻，表面光滑圓整，粒子之間無粘連現(xiàn)象，分散性良好。PLGA對紫杉醇的包覆較好，微球沒有破裂，因此該微球的制備工藝可以較好地包埋紫杉醇，進而實現(xiàn)減小紫杉醇毒性的目的。

圖1 PTX-PLGA NPs掃描電鏡圖Fig.1 SEM images of PTX-PLGA NPs

圖2 PTX-PLGA NPs的粒徑分布Fig.2 The size distribution of paclitaxel loaded PLGA nanoparticles

圖3 PTX-PLGA NPs表面電位測量結(jié)果Fig.3 Zeta potential measurement result of PTX-PLGA NPs

2.2.2 PTX-PLGA NPs粒徑和電位表征

根據(jù)優(yōu)化方案重復(fù)制備3批PTX-PLGA NPs納米粒樣品，激光粒度測定儀測定其粒徑分布為(207.1±20.5)nm，多分散指數(shù)(PDI)為0.006±0.001結(jié)果見圖2。通過HPLC檢測PTX-PLGA NPs凍干粉中紫杉醇含量，并計算得出載藥率平均為(14.45±0.04)%。

表面電位是納米給藥系統(tǒng)穩(wěn)定性的一個重要標(biāo)志，帶同種電荷的納米粒之間存在排斥力，能為系統(tǒng)提供一定穩(wěn)定性。本實驗中檢測到的Zeta電位為(-23.8±2.5)mV，結(jié)果見圖3。由圖3中可以看出，所測電位與模型所做標(biāo)準(zhǔn)曲線高度擬合，說明PTX-PLGA NPs溶液系統(tǒng)比較穩(wěn)定。

2.3 PTX-PLGA NPs紅外光譜檢測

分別掃描各樣品的FT-IR譜圖如圖4所示。對比可知，PTX-PLGA NPs凍干粉(無甘露醇)的特征吸收峰與PLGA聚合物的吸收峰基本重疊，PTX-PLGA NPs是多個PLGA組合而成的球體，導(dǎo)致某些特征峰伸縮加強或減弱。

圖4 A.PLGA紅外光譜圖；B.PTX-PLGA NPs凍干粉(無甘露醇) 紅外光譜圖Fig.4 A.PLGA infrared spectrogram; B.Freeze- dried PTX-PLGA NPs without Man infrared spectrogram

2.4 PTX-PLGA NPs凍干粉復(fù)溶后穩(wěn)定性試驗

冷凍干燥后，無甘露醇保護的PTX-PLGA NPs凍干粉分布在凍干瓶底，散開粉狀(圖5A)。有甘露醇保護的PTX-PLGA NPs凍干粉在凍干瓶中分布均勻，呈疏松狀冰塊樣，乳白色，無分層現(xiàn)象(圖5B)。

凍干前后PTX-PLGA NPs溶液都呈現(xiàn)乳白色懸浮液狀態(tài)(圖5:C-D)。

圖5 A.未加甘露醇的PTX-PLGA NPs凍干粉；B.加甘露醇的PTX-PLGA NPs凍干粉；C.凍干前PTX-PLGA NPs溶液；D.凍干粉復(fù)溶后PTX-PLGA NPs溶液Fig.5 A.Freeze-dried PTX-PLGA NPs without Man; B.Freeze-dried PTX-PLGA NPs with 2.5%Man; C.PTX-PLGA NPs before freeze-drying; D.PTX-PLGA NPs with 2.5%Man after reconstitution of the samples in water

圖6 2.5%甘露醇保護PTX-PLGA NPs凍干粉復(fù)溶后，粒徑隨時間變化的相關(guān)曲線Fig.6 The 12-h stability of freeze-dried PTX-PLGA NPs with 2.5% Man

為研究凍干后PTX-PLGA NPs的穩(wěn)定性，采用激光粒度分析儀檢測加入凍干保護劑的PTX-PLGA NPs樣品復(fù)溶后12 h內(nèi)的粒徑變化。樣品重復(fù)測定3次，采用其平均值。

由PTX-PLGA NPs溶液的穩(wěn)定性實驗結(jié)果(圖6)可知，室溫條件下，甘露醇保護PTX-PLGA NPs復(fù)溶溶液在12 h內(nèi)粒徑變化不大。由此得出，本研究所制備的PLGA納米粒穩(wěn)定性良好。

3 討論

乳化溶劑揮發(fā)法是制備微球最常用的方法，使用最為廣泛，其原理是根據(jù)聚合物與藥物的性質(zhì)通過機械攪拌或超聲乳化方式等制成乳劑，適用于包載疏水性藥物。本實驗中PLGA包載抗癌藥物紫杉醇，紫杉醇不溶于水，所以選用乳化溶劑揮發(fā)法制備納米微球。

微球粒徑和載藥率都是評價納米微球制備工藝的重要參數(shù)。本研究采用微球粒徑和載藥率作為納米微球的檢測指標(biāo)，選用多指標(biāo)試驗綜合加權(quán)評分法處理后為評價指標(biāo)，進行優(yōu)化實驗數(shù)據(jù)分析。

在制備聚合物納米微球時，首先要考慮選用的PLGA修飾的末端基團及合適分子量，其次考慮制備工藝中PLGA濃度、PLGA與藥物質(zhì)量比、納米乳形成的攪拌速率以及表面活性劑的用量等相關(guān)因素[6]。

本研究通過正交實驗對處方工藝進行篩選優(yōu)化，在PLGA∶紫杉醇=4∶1，PVA用量0.1%，DCM用量3 mL，均質(zhì)速度為16 000 r·min-1條件下，得到的PTX-PLGA NPs平均粒徑為(207.1±20.5)nm、Zeta電位為(-23.8±2.5)mV、載藥率可達到(14.45±0.04)%。納米粒外觀圓整，理化性質(zhì)穩(wěn)定，凍干粉復(fù)溶溶液12 h內(nèi)粒徑差異不大，具有優(yōu)良的載藥納米微球穩(wěn)定性能。

相較于寇龍發(fā)等[16]采用乳化揮發(fā)法得到的粒徑為(211.3±1.4) nm和載藥量為(4.35±0.15)%的PTX-PLGANPs，本實驗中得到的PTX-PLGA NPs表現(xiàn)出更小的平均粒徑及更高的載藥率。這兩個實驗都采用了乳化溶劑揮發(fā)法制備納米微球，寇龍發(fā)等[16]采用超聲乳化(強度300 W)獲得初乳，本實驗采用高速剪切(16 000 r·min-1)的方式獲得初乳。采用超聲乳化儀或高速乳化機形成乳劑的過程中，攪拌速度應(yīng)在10 000 r·min-1以上。在使用高速乳化機的乳化過程中，剪切力的大小直接影響納米微球粒徑的大小。通過優(yōu)化乳化過程中的剪切速度，可以得到理想的納米微球粒徑。

本實驗選用分子量較低(12 000)、羧基封端的PLGA作為載體材料，制備得到了載藥率比較高、粒徑較小的納米微球。研究發(fā)現(xiàn)制備PLGA納米微球時，納米微球載藥率隨PLGA分子量的降低而升高[17]，微球粒徑隨著PLGA分子量的降低而減小[18]。Sirsi等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在PLGA末端有羧基修飾時，制備得到的PLGA微球載藥率和包封率都比較高，這可能是末端的親水集團羧基增強了聚合物極性，從而提高了納米微球的藥物載藥率及包封率。

在乳化揮發(fā)法制備PLGA納米微球的工藝中，表面活性劑的用量也是影響因素之一。研究發(fā)現(xiàn)納米微球粒徑隨著表面活性劑濃度的升高而增大[20]。在本實驗中表面活性劑濃度較低(0.1%)，這也影響獲得粒徑較小的PTX-PLGA NPs微球。

本實驗在通過優(yōu)化制備工藝獲得粒徑較小、分布均勻、外貌呈球形及載藥量較高的納米微球的基礎(chǔ)上，對PTX-PLGA NPs凍干粉的穩(wěn)定性進行了初步研究，為以后進行PTX-PLGA NPs的體內(nèi)藥動學(xué)規(guī)律及藥效學(xué)的研究打下基礎(chǔ)，為其盡早應(yīng)用于臨床提供一定的理論依據(jù)。