馬鵬宇 張紅光 昝 鵬 顧偉平 溫璐寧 張子嘉 翁海龍 孫 濤 毛子軍*

(1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040； 2.東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)，尚志 150611； 3.中國(guó)科學(xué)院森林生態(tài)與管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所)，沈陽 110016； 4.黑龍江豐林國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，五營(yíng) 153033)

氮元素作為物質(zhì)循環(huán)中的一個(gè)重要組成部分，影響著森林生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)。氮沉降問題開始于工業(yè)化較早的歐洲和北美地區(qū)，自兩次工業(yè)革命后，人類發(fā)現(xiàn)化石燃料并大量使用，向大氣中排放氮化物的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于工業(yè)革命前[1]，形成“氮飽和”[2]。大氣氮沉降量上升，已成為許多森林生態(tài)系統(tǒng)的重要生態(tài)因子[3]。顧峰雪[4]的研究結(jié)果表明，隨著中國(guó)工業(yè)化水平的提高，氮沉降量由20世紀(jì)60年代的0.31 g·N·m-2·a-1增加到21世紀(jì)初的1.71 g·N·m-2·a-1，年增長(zhǎng)率為0.04 g·N·m-2·a-1。日益嚴(yán)重的氮沉降影響著陸地生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)生產(chǎn)和分解間的動(dòng)態(tài)平衡關(guān)系[5]。分解過程是生態(tài)系統(tǒng)中的關(guān)鍵性過程，在諸多控制因素中土壤分解酶起著關(guān)鍵性作用[6]。長(zhǎng)期氮沉降下的土壤酶活性變化相關(guān)研究集中于華南和華西地區(qū)，關(guān)于東北地區(qū)的相關(guān)研究甚少，在一定程度上制約了我國(guó)土壤酶的研究進(jìn)展。

土壤酶作為土壤的重要組成成分，其活性可以表示土壤管理系統(tǒng)的效果。土壤酶在植物根系和微生物殘?bào)w上產(chǎn)生，與土壤有機(jī)、無機(jī)成分結(jié)合在一起，作為催化劑參與土壤的生物化學(xué)反應(yīng)與物質(zhì)循環(huán)[7]。近年來，眾多研究表明大氣氮沉降引起土壤中氮化合物的積累，導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)變換，對(duì)土壤酶活性產(chǎn)生顯著影響[8]。但在不同的生態(tài)系統(tǒng)中，土壤酶活性對(duì)氮沉降的響應(yīng)有所不同，例如Sinsabaugh R L.等研究發(fā)現(xiàn)糖槭林中添加無機(jī)氮氧化酶活性增強(qiáng)，但在紅櫟林中卻降低[9]。國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究結(jié)果也有差異，涂利華等在華西雨屏區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)在苦竹林中添加無機(jī)氮土壤氧化酶活性增強(qiáng)[10]，但在光皮樺林中降低[11]。因此氮沉降對(duì)森林土壤酶活性的影響有必要結(jié)合具體環(huán)境進(jìn)行研究。

本研究以東北地區(qū)造林最多的興安落葉松(Larixgmelinii(Rupr.) Rupr.)人工林為研究對(duì)象，研究土壤中與碳、氮和磷元素循環(huán)相關(guān)的水解酶，包括β-1,4-糖苷酶(BG)、纖維素二糖水解酶(CBH)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)和酸性磷酸酶(AP)；與腐殖質(zhì)形成相關(guān)的氧化酶，包括過氧化物酶(PER)和多酚氧化酶(POX)對(duì)氮沉降量增加的響應(yīng)，旨在探討長(zhǎng)期氮沉降增加對(duì)興安落葉松人工林土壤酶系統(tǒng)的影響方式及其機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)地區(qū)與研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣地點(diǎn)自然概況

樣地位于東北林業(yè)大學(xué)帽兒山林場(chǎng)老山生態(tài)定位站(45°20′N，127°34′E)。該地處長(zhǎng)白山系張廣才嶺西北部小嶺余脈，代表著東北東部山區(qū)天然次生林的典型生態(tài)系統(tǒng)類型，廣泛分布著天然次生林和紅松人工林及興安落葉松人工林。該區(qū)域有明顯的四季交替，年平均氣溫2.8℃，年相對(duì)濕度70%，年降水量723.8 mm，降雨主要集中在7～8月，年蒸發(fā)量1 093.9 mm，年平均日照數(shù)總時(shí)數(shù)2 471.3 h，早霜一般在8月末出現(xiàn)，晚霜截止到5月末，無霜期120～140 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣地設(shè)置和處理

2010年4月在興安落葉松人工林內(nèi)設(shè)立6個(gè)10 m×20 m的標(biāo)準(zhǔn)樣地，樣方之間留有15 m左右的緩沖帶以防止相互干擾。試驗(yàn)分為2個(gè)處理組，對(duì)照處理(CK：0 kg·N·hm-2·a-1)和無機(jī)氮處理(IN：10 kg·N·hm-2·a-1)，每個(gè)處理組含3個(gè)重復(fù)，同一處理由隨機(jī)選擇的3個(gè)樣方組成。從2010～2017年，每年5～10月，每月底噴灑硝酸銨(NH4NO3)溶液，每個(gè)樣方每次將定量的NH4NO3溶解在50 L自來水中，采用背式噴霧器均勻噴灑在無機(jī)氮處理樣方內(nèi)，對(duì)照樣方噴施等量的自來水。

1.3 樣品采集與處理

2017年10月14日，在每個(gè)樣地內(nèi)隨機(jī)選取五個(gè)地點(diǎn)，每個(gè)地點(diǎn)收集土壤酶活性較高的表層土(0～10 cm)[12]，不包括表層凋落物，混勻過2 mm孔徑篩網(wǎng)，裝入自封袋內(nèi)立即帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，每個(gè)土樣分別取100 g，放入65℃烘箱內(nèi)，烘干至恒重，測(cè)定其含水率。將剩余的各袋土樣每袋均分成兩份，一份放于室內(nèi)自然風(fēng)干，用于測(cè)定土壤元素；另一份放置于-20℃恒溫冰箱內(nèi)，用于測(cè)定土壤酶活性。

1.4 酶的測(cè)定方法

本研究中所涉及的土壤酶包括土壤中與碳(BG和CBH)、氮(LAP)和磷(AP)元素有關(guān)的酶類，和促進(jìn)腐殖質(zhì)形成的最重要的兩類酶(POX和PER)[13]。BG的主要功能是將纖維二糖和低聚糖水解為葡萄糖[14]，分解纖維素、甲殼素和碳水化合物等[15]。CBH水解纖維素分子非還原端的二聚體，將其水解為單糖[16]。LAP水解多肽鏈N段的疏水氨基酸，以及其他種類的氨基肽酶[17]。AP的作用是水解磷酸單酯，磷酸二酯，釋放磷酸鹽[18]。PER和POX通過排泄或裂解進(jìn)入環(huán)境，參與丹寧和木質(zhì)素降解、腐殖化、碳礦化和溶解有機(jī)碳輸出等關(guān)鍵生態(tài)系統(tǒng)功能[19]。以上6種酶的測(cè)定方法和底物見表1，所得結(jié)果統(tǒng)一單位為nmol·h-1·g·SOM-1，即每小時(shí)每克鮮土分解相應(yīng)底物產(chǎn)生特定產(chǎn)物的物質(zhì)的量。

表1 土壤酶名稱、縮寫、國(guó)際分類號(hào)(EC)、活性測(cè)定方法及其底物

土壤有機(jī)碳采用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定，全氮采用半微量凱氏定氮法測(cè)定，全磷采用鉬銻抗比色法測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理與分析采用Microsoft Excel2007和SPSS20.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)期添加氮各土壤酶活性變化

經(jīng)過8年連續(xù)添加無機(jī)氮，興安落葉松人工林土壤中BG和AP活性分別上升5.56%和8.66%，且差異顯著(P<0.05)。PER活性上升0.61%，但差異不顯著。而CBH、POX和LAP活性分別下降10.71%、3.85%和12.30%，均差異顯著(P<0.05)。土壤中有機(jī)碳上升0.8%，全氮上升12.66%，全磷下降2.38%。土壤的pH值下降，含水率下降(表2)。

圖1 長(zhǎng)期添加無機(jī)氮后不同種類酶活性變化 BG.β-1,4-糖苷酶；CBH.纖維素二糖水解酶；LAP.亮氨酸氨基肽酶；AP.酸性磷酸酶；POX.多酚氧化酶；PER.過氧化物酶Fig.1 Changes of enzyme activities in different kinds of enzymes after adding inorganic nitrogen for a long-term BG.β-1,4-glucosidase；CBH.Cellobiohydrolase；LAP.Leucine aminopeptidase；AP.Acid phosphatase；POX.Phenol oxidases；PER.Peroxidase

2.2 長(zhǎng)期添加氮各土壤酶之間相關(guān)性變化

相關(guān)性分析表明，長(zhǎng)期添加無機(jī)氮后，LAP與BG相關(guān)性增強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)上升至0.999。AP與POX相關(guān)性增強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)上升至0.821,；AP與PER相關(guān)性也有增強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)上升至-0.966。POX與PER由正相關(guān)變?yōu)榱素?fù)相關(guān)。這些具有代表性的相關(guān)系數(shù)的變化，說明參與土壤物質(zhì)循環(huán)的水解酶和參與腐殖質(zhì)形成的氧化酶之間的相關(guān)性在氮沉降的影響下發(fā)生了變化(表3～4)。

表2 樣地0～10 cm土壤基本理化性質(zhì)

表3 未施氮樣地土壤各酶相關(guān)性

注：*代表P<0.05水平顯著；**代表P<0.01水平顯著 下同。

Note：*represent significance atP<0.05 level；**represent significance atP<0.01 level The same as below.

表4 施氮樣地土壤各酶相關(guān)性(n=6)

3 討論

3.1 添加無機(jī)氮對(duì)有機(jī)碳循環(huán)相關(guān)土壤酶(BG、CBH)活性的影響

由于大量的氮化合物進(jìn)入大氣，過量的氮輸入造成了森林衰退和土壤酸化等現(xiàn)象，可能對(duì)土壤酶的活性產(chǎn)生了影響[9～11]。本研究基于我國(guó)東北地區(qū)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期添加無機(jī)氮的興安落葉松人工林樣地土壤BG活性增強(qiáng)，有機(jī)碳含量上升，LAP與BG相關(guān)性增強(qiáng)。這可能是由于長(zhǎng)期添加無機(jī)氮后，氮元素利用性增強(qiáng)，導(dǎo)致與碳循環(huán)的相關(guān)的BG活性增強(qiáng)，微生物對(duì)有效碳源即容易被分解利用的有機(jī)碳需求相應(yīng)增加。且與深層土壤相比，表層土壤受凋落物分解的影響明顯，野外采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)根系分布較多，這些因素都有利于表層土壤中微生物的活動(dòng)[20]，加之其具有良好的理化性質(zhì)，所以氮沉降量增加使BG活性增強(qiáng)，促進(jìn)了土壤中的碳循環(huán)，土壤中有機(jī)碳含量上升也證明了這一點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外對(duì)不同類型生態(tài)系統(tǒng)的研究也得到類似的結(jié)論[21～22]。另一個(gè)與碳循環(huán)相關(guān)的CBH活性降低可能是因?yàn)镃BH本身活性不高，加之降水量較低，所以導(dǎo)致CBH活性不升反降。Robert對(duì)糖槭——紅橡木和黑橡木——白橡木混合林地的研究中，也發(fā)現(xiàn)CBH活性與降水量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系[9]，本試驗(yàn)樣地降水量(723.8 mm)明顯低于Robert研究樣地降水量(838 mm)。

3.2 添加無機(jī)氮對(duì)氮循環(huán)相關(guān)土壤酶(LAP)活性的影響

研究結(jié)果顯示LAP活性下降。一方面，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)期添加無機(jī)氮導(dǎo)致微生物對(duì)于氮元素的需求達(dá)到飽和，不再需要LAP水解產(chǎn)生更多的氮元素，外源施加的氮元素已經(jīng)滿足正常的氮循環(huán)需要，甚至已經(jīng)“供大于需”；另一方面，LAP活性與土壤pH值呈正相關(guān)[15]，長(zhǎng)期添加無機(jī)氮導(dǎo)致土壤pH值下降，而土壤酸化也導(dǎo)致LAP活性下降。LAP活性下降說明長(zhǎng)期添加無機(jī)氮后，土壤中微生物對(duì)于氮的需求量越來越少，繼續(xù)添加無機(jī)氮并沒有促進(jìn)微生物對(duì)含氮化合物的分解，所以參與水解多肽鏈N段的疏水氨基酸的LAP活性下降。

3.3 添加無機(jī)氮對(duì)磷循環(huán)相關(guān)土壤酶(AP)活性的影響

研究結(jié)果顯示土壤AP活性增強(qiáng)。這可能是因?yàn)樵趯?duì)氮元素的需求量達(dá)到飽和的情況下，對(duì)磷元素的需求相應(yīng)的增加，所以參與水解磷酸單酯，磷酸二酯，釋放磷酸鹽的AP活性增強(qiáng)；而土壤pH值的下降也會(huì)促進(jìn)AP活性增強(qiáng)。這與國(guó)際上諸多研究結(jié)果相似[9,15,18]。而AP與PER和POX之間的相關(guān)性增強(qiáng)證明在腐殖質(zhì)形成的過程中對(duì)磷元素利用性增強(qiáng)。

3.4 添加無機(jī)氮對(duì)腐殖質(zhì)形成相關(guān)土壤酶(PER、POX)活性的影響

研究結(jié)果顯示外源無機(jī)氮添加后，POX活性下降，PER活性增強(qiáng)，POX與PER間由正相關(guān)變?yōu)樨?fù)相關(guān)。這可能是因?yàn)橥寥赖可撸恍枰猱a(chǎn)生新的氮元素，其他元素依舊需要，但總體呈現(xiàn)出凋落物分解受到抑制，在土壤中積累的現(xiàn)象，抑制土壤有機(jī)質(zhì)分解增加土壤有機(jī)碳貯存量，這與土壤中碳和磷元素的變化相呼應(yīng)。POX的活性是分解速率變化最好的預(yù)測(cè)因子，POX活性增強(qiáng)，周轉(zhuǎn)率隨之上升，反之下降[23]。本研究中可以看出，長(zhǎng)期添加無機(jī)氮，抑制了凋落物的分解，周轉(zhuǎn)率下降。黃玉梓[24]和Pregitzer等[25]也得到了相似的研究結(jié)果。

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，氮沉降影響土壤酶活性、凋落物分解及土壤有機(jī)質(zhì)形成。氮沉降導(dǎo)致土壤酶活性變化各異，與碳和磷元素循環(huán)相關(guān)的酶活性增強(qiáng)，與氮元素循環(huán)相關(guān)的酶活性降低，說明氮沉降促進(jìn)了土壤中碳和磷元素循環(huán)。POX活性降低，PER活性增強(qiáng)，則表明土壤中凋落物持續(xù)積累，周轉(zhuǎn)率下降。本文研究了長(zhǎng)期氮沉降對(duì)東北地區(qū)興安落葉松人工林土壤酶活性的影響，今后還需進(jìn)一步研究氮沉降對(duì)其他植被類型土壤酶活性的影響，以便對(duì)比氮沉降對(duì)不同植被類型帶來的影響存在的差異，尋找變化規(guī)律。