馬文馨，宋 謙，田新會(huì)，杜文華

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

青藏高原氣候寒冷，自然環(huán)境惡劣，植物生長(zhǎng)季短，能夠適應(yīng)該地區(qū)生長(zhǎng)的優(yōu)質(zhì)牧草較少，飼草缺乏是制約其畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素，引進(jìn)高產(chǎn)，穩(wěn)產(chǎn)和抗寒性強(qiáng)的牧草品種是當(dāng)前亟待解決的問題[1]。小黑麥(Triticale)是小麥屬(Triticum)和黑麥屬(Secale)經(jīng)屬間有性雜交，育成的異源多倍體新物種[2]。小黑麥不僅生物量高、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)好，而且可以利用冬閑田種植，在冬春枯草季節(jié)為家畜提供優(yōu)質(zhì)飼料[3]。小黑麥發(fā)達(dá)的根系對(duì)土壤中水分、養(yǎng)分具有較強(qiáng)的吸收能力，因此，可在土層淺薄的坡地和貧瘠的土壤種植[4]。小黑麥耐寒性較強(qiáng)，冬季能夠抵御-20℃低溫，在2～-10℃條件下能夠正常生長(zhǎng)，且具有較高生物量[5]。

目前，小黑麥研究多集中于遺傳多樣性[6]、遺傳圖譜構(gòu)建[7]、基因定位[8]、生產(chǎn)性能和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[9-11]等方面，對(duì)于小黑麥抗寒性的研究較少。張舒蕓[12]測(cè)定了小黑麥和黑麥葉片的含水量，可溶性糖含量，SOD，POD，CAT等生理指標(biāo)，對(duì)黑麥和小黑麥抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，小黑麥抗寒性顯著優(yōu)于黑麥。劉杰[13]研究了小黑麥對(duì)低溫復(fù)合脅迫的抗逆性，綜合評(píng)價(jià)了小黑麥的抗逆性。以甘農(nóng)2號(hào)小黑麥和小黑麥新品系P4為試驗(yàn)材料，國(guó)家草品種審定委員會(huì)指定的小黑麥區(qū)域試驗(yàn)統(tǒng)一對(duì)照石大1號(hào)小黑麥(CK1)和中飼1048(CK2)作為對(duì)照，通過研究小黑麥材料在低溫脅迫處理(0℃、-10℃、-20℃、-30℃)下可溶性糖含量、脯氨酸含量和丙二醛含量，以及SOD，POD和CAT活性的變化，并利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以評(píng)價(jià)甘農(nóng)2號(hào)小黑麥的抗寒性強(qiáng)弱，為其在青藏高原高寒牧區(qū)和西北、華北的秋閑田種植提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)設(shè)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草試驗(yàn)地。N 36°03′76″，E 103°53′24″，海拔1 600 m，年均溫7.9℃，無霜期150 d，年降水量320 mm。土壤類型為黃綿土，土壤有機(jī)質(zhì)2.3 g/kg，堿解氮90.05 mg/kg，速效磷7.36 mg/kg，速效鉀172.8 mg/kg，pH 7.35。播種時(shí)間為2016年10月26日，前茬作物為小黑麥，有灌溉條件。

1.2 試驗(yàn)材料

參試材料為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院培育的甘農(nóng)2號(hào)小黑麥品種和小黑麥新品系P4。對(duì)照為國(guó)家草品種委員會(huì)審定的小黑麥品種石大1號(hào)(CK1)和中飼1048(CK2)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積2 m×5 m，行距0.3 m，播種深度3～4 cm。播種量按照750萬基本苗/hm2計(jì)算而得。生長(zhǎng)發(fā)育期間進(jìn)行正常灌水施肥，并及時(shí)防除雜草。于小黑麥出苗40 d，從其上部采集長(zhǎng)勢(shì)良好的葉片。每個(gè)材料取樣20 g。將樣品放入速封袋，存放在裝有液氮的保鮮盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。葉片先用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗1遍，然后用吸水紙吸干。將每個(gè)小黑麥材料的葉片分為3份，3個(gè)重復(fù)，用錫箔紙包好分別放入超低溫冰箱中進(jìn)行人工模擬低溫處理。處理溫度根據(jù)甘肅省高寒牧區(qū)冬季的最低溫，分別為0℃，-10℃，-20℃，-30℃，先在不同溫度下處理8h，取出在常溫下放置8h，重復(fù)3次[14-15]。處理結(jié)束后測(cè)定葉片的生理指標(biāo)。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

可溶性糖含量用蒽酮比色法測(cè)定，游離脯氨酸含量用水合茚三酮法測(cè)定，MDA含量用硫代巴比妥酸法測(cè)定，SOD活性用氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定，CAT活性采用紫外吸收法測(cè)定[16-17]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理?？购跃C合評(píng)價(jià)應(yīng)用隸屬函數(shù)法[18]。生理指標(biāo)與抗寒性正相關(guān)時(shí)，用公式：

Uij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

負(fù)相關(guān)公式：

Uij=1-(Xij-Xjmax)/(Xjmax-Xjmin)

式中：i表示某一小黑麥材料，j表示測(cè)定指標(biāo)，Xij表示某一小黑麥材料第j指標(biāo)的測(cè)定值，Xjmin表示所有小黑麥材料j指標(biāo)的最小值，Xjmax表示所有小黑麥材料j指標(biāo)的最大值，Uij表示某一小黑麥材料j指標(biāo)的抗寒隸屬函數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

F測(cè)驗(yàn)表明，除小黑麥材料間可溶性糖含量、脯氨酸含量、SOD，POD和CAT活性無顯著差異外，低溫脅迫間、小黑麥材料間和低溫脅迫×小黑麥材料交互作用間的其他生理生化指標(biāo)均存在極顯著差異(P<0.01)，需要進(jìn)行多重比較(表1)。

表1 小黑麥生理指標(biāo)的方差分析

注：**表示差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)

2.1 小黑麥材料間生理生化指標(biāo)的差異

4個(gè)參試材料中，P4的MDA含量(0.36 μmol/g)顯著高于其他3個(gè)材料，甘農(nóng)2號(hào)小黑麥的MDA含量(0.29 μmol/g)和CK1、CK2無顯著差異。

2.2 低溫脅迫下小黑麥生理生化指標(biāo)的差異

隨著低溫脅迫程度的不斷增加，小黑麥葉片中的可溶性糖含量先升高后下降， -20℃時(shí)可溶性糖含量達(dá)到最大值，且顯著高于其他低溫脅迫處理。低溫脅迫處理對(duì)小黑麥葉片的脯氨酸含量有極顯著影響，-10℃時(shí)小黑麥葉片的脯氨酸含量極顯著高于其他低溫脅迫處理。隨著低溫脅迫程度加劇，小黑麥葉片的MDA含量呈現(xiàn)出不斷升高的變化趨勢(shì)，-30℃時(shí)MDA含量達(dá)到最大值，且與其他各處理間的MDA含量均有極顯著性差異。-30℃處理下小黑麥葉片的SOD活性顯著高于其他低溫處理，-10℃處理的SOD活性顯著低于0℃處理，但與-20℃處理無顯著差異。低溫脅迫下小黑麥的POD在-30℃時(shí)平均POD活性最大，且與其他各處理間的POD活性均有顯著性差異。隨著低溫脅迫加劇，小黑麥葉片的CAT活性呈現(xiàn)出不斷升高的變化趨勢(shì)，-30℃時(shí)大值，且顯著高于其他處理。其余處理間的CAT活性無顯著差異(表2)。

表2 不同低溫脅迫處理下小黑麥的生理指標(biāo)

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 小黑麥材料×低溫脅迫交互作用間生理生化指標(biāo)的差異

0℃時(shí)，甘農(nóng)2號(hào)小黑麥的可溶性糖含量顯著低于P4和CK2；-10℃時(shí)，與P4和CK1無顯著差異，但顯著低于CK2；-20℃和-30℃時(shí)顯著高于CK1，但顯著低于P4和CK2。0℃和-20℃時(shí)，甘農(nóng)2號(hào)小黑麥的脯氨酸含量顯著低于P4，但顯著高于CK1和CK2對(duì)照；-10℃時(shí)其脯氨酸含量顯著低于P4，和CK1和CK2；-30℃時(shí)，顯著低于P4，與CK1和CK2對(duì)照無顯著差異。0℃時(shí)，甘農(nóng)2號(hào)小黑麥的MDA含量顯著低于P4和CK2，與CK1無顯著差異；-10℃和-20℃時(shí)，甘農(nóng)2號(hào)小黑麥的MDA含量顯著低于P4，但顯著高于CK1和CK2；-30℃時(shí)，其MDA含量顯著高于CK2，但低于P4和CK1。0℃和-10℃時(shí)，甘農(nóng)2號(hào)小黑麥的SOD活性和P4相近，顯著低于CK1和CK2；-20℃時(shí)其SOD活性顯著高于P4和CK2，但顯著低于CK1；-30℃時(shí)顯著高于CK1和CK2對(duì)照，但顯著低于P4。0℃時(shí)，甘農(nóng)2號(hào)小黑麥的POD活性顯著高于CK1和P4，但顯著低于CK2；-10℃時(shí)其POD活性顯著高于P4，但顯著低于CK1和CK2；隨著低溫脅迫加劇，其SOD活性急劇增加，-20℃時(shí)顯著高于P4和2對(duì)照，-30℃時(shí)雖然低于P4，但顯著高于2對(duì)照除-10℃處理下甘農(nóng)2號(hào)小黑麥和P4的CAT活性顯著低于CK2外，其余低溫脅迫處理下甘農(nóng)2號(hào)小黑麥和P4的CAT活性均顯著高于CK1和CK2(圖1)。

2.4 小黑麥材料間抗寒性綜合評(píng)價(jià)

利用可溶性糖含量、脯氨酸含量、MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性6個(gè)抗寒性指標(biāo)對(duì)4個(gè)小黑麥材料的抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，用隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)結(jié)果為甘農(nóng)2號(hào)小黑麥>P4>CK1>CK2(表3)。

表3 不同小黑麥材料抗寒性排序

圖1 小黑麥材料×低溫脅迫交互作用間小黑麥的生理生化指標(biāo)Fig.1 The physiochemical indexes of the interaction between triticale materials and low temperature stress

3 討論

3.1 小黑麥材料間生理生化指標(biāo)的差異

植物在逆境條件下會(huì)產(chǎn)生活性氧代謝，破壞植物的組織與功能[19]。隨著低溫脅迫程度加劇，抗寒性強(qiáng)的材料能積累更多的可溶性糖和脯氨酸[20]。研究中，隨著低溫脅迫的加劇，小黑麥的可溶性糖含量和脯氨酸含量先增高后降低，CK2的可溶性糖含量最高，P4的脯氨酸含量最高。MDA是植物膜質(zhì)過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，對(duì)細(xì)胞膜有毒害作用，低溫脅迫程度越大，植物積累的MDA越多[21]。植物細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)酶SOD，POD和CAT可清除植物細(xì)胞產(chǎn)生的自由基，使植物細(xì)胞的膜系統(tǒng)不被損傷[22]。逆境脅迫下SOD與CAT的變化趨勢(shì)相似，與抗寒性呈正相關(guān)；POD活性變化較復(fù)雜，有報(bào)道寒冷條件下抗寒品種葉片 POD活性上升或維持較高水平，并隨低溫脅迫程度增強(qiáng)而增加?？购栽綇?qiáng)的植物葉片中SOD，POD和CAT活性越大[22-23]。4個(gè)參試小黑麥材料的其他指標(biāo)無顯著差異，只有P4的MDA含量顯著高于其他3個(gè)材料，說明P4的抗寒性最強(qiáng)。

3.2 不同低溫脅迫下小黑麥生理生化指標(biāo)的差異

隨著低溫脅迫加劇，小黑麥葉片的可溶性糖和脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，-20℃時(shí)可溶性糖最高，-10℃時(shí)脯氨酸含量最高，是因?yàn)橐欢ǔ潭鹊牡蜏孛{迫有利于提高植物的可溶性糖和脯氨酸含量。但隨著脅迫程度加劇植物葉片的組織細(xì)胞受到破壞，小黑麥葉片的可溶性糖和脯氨酸含量降低。這與張基德等[24]的研究結(jié)果一致。植物受到低溫脅迫時(shí)，葉片的 MDA含量和POD、SOD、CAT活性會(huì)持續(xù)上升或維持較高水平以降低傷害[25-26]，試驗(yàn)得出相似結(jié)論，即隨著低溫脅迫程度增強(qiáng)，參試小黑麥材料的MDA含量和POD、SOD、CAT活性呈持續(xù)上升的趨勢(shì)。

3.3 小黑麥材料×低溫脅迫交互作用間生理生化指標(biāo)的差異

可溶性糖通過糖代謝來增加細(xì)胞液濃度，增加細(xì)胞中的非結(jié)冰水，保護(hù)植物受到逆境脅迫，抗寒性強(qiáng)的植物可溶性糖含量高[27]。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，在逆境脅迫下隨著低溫脅迫的加劇，細(xì)胞的過氧化物會(huì)增多，植物體內(nèi)的MDA含量會(huì)增高[28]。SOD，POD和CAT作為細(xì)胞的酶保護(hù)物質(zhì)，共同作用清除植物因逆境產(chǎn)生的過多的O2-，防止膜脂過氧化，保護(hù)植物細(xì)胞受到低溫脅迫帶來的傷害[29]。試驗(yàn)的參試小黑麥材料受到低溫脅迫時(shí)，表現(xiàn)各異。0℃和-10℃時(shí)CK2的可溶性糖、脯氨酸和MDA含量，以及POD，SOD和CAT活性顯著高于甘農(nóng)2號(hào)小黑麥和小黑麥品系P4，但隨著脅迫程度加劇，其含量顯著低于2材料，說明其難以抵抗-10℃以下的低溫，抗寒性較甘農(nóng)2號(hào)小黑麥和小黑麥品系P4弱；從總體分析，CK1的可溶性糖、脯氨酸和MDA含量，以及POD，SOD和CAT活性均低于CK2，說明其抗寒性比CK2弱，這與綜合評(píng)價(jià)的結(jié)果一致(表3)。對(duì)于甘農(nóng)2號(hào)小黑麥和小黑麥品系P4分析，雖然0℃和-10℃時(shí)，和抗寒相關(guān)的生理生化指標(biāo)與CK1和CK2相近或低于對(duì)照，但隨著低溫脅迫程度加劇，各指標(biāo)迅速上升，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒性[30-31]。分析圖1結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，0℃和-10℃時(shí)CK1和CK2的相關(guān)生理生化指標(biāo)值較高，甘農(nóng)2號(hào)小黑麥和小黑麥品系P4則較低，溫度低于-10℃時(shí)則相反，因此，4份參試材料在不同低溫脅迫下各生理生化指標(biāo)平均值的差異就縮小，小黑麥材料間除MDA含量外其他生理生化指標(biāo)就無顯著差異(表1)。這一結(jié)果進(jìn)一步說明了小黑麥材料和低溫脅迫天數(shù)交互作用分析的重要性。由于4份參試小黑麥材料對(duì)不同生理生化指標(biāo)的反應(yīng)各異，為準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其抗寒性強(qiáng)弱。

4 結(jié)論

從滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、酶保護(hù)物質(zhì)兩方面相應(yīng)指標(biāo)的變化，基于隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)結(jié)果表明，參試小黑麥材料的抗寒性強(qiáng)弱依次為甘農(nóng)2號(hào)小黑麥>P4>CK1>CK2，甘農(nóng)2號(hào)小黑麥和小黑麥新品系P4的抗寒性較強(qiáng)，適宜于甘肅省高寒牧區(qū)及其他氣候相似區(qū)種植，該研究將為高寒牧區(qū)飼草品種的選擇奠定基礎(chǔ)。