李子欣 尤麗琴 羅瑞明 苑昱東 趙曉策 姬琛

摘 要：以冷鮮灘羊肉為研究對象，應(yīng)用同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，尋找與灘羊肉中風(fēng)味前體物質(zhì)形成及調(diào)控相關(guān)的差異蛋白質(zhì)。對宰后0～12 d的灘羊肉進行定量分析，結(jié)合數(shù)據(jù)庫搜索，鑒定和篩選可信蛋白質(zhì)及差異蛋白質(zhì)。結(jié)果表明：3 組灘羊肉樣品中共鑒定到814 個蛋白質(zhì)，0 d/4 d組發(fā)現(xiàn)159 個差異蛋白質(zhì)，4 d/8 d組發(fā)現(xiàn)151 個差異蛋白質(zhì)，8 d/12 d組發(fā)現(xiàn)151 個差異蛋白質(zhì);對各比對組的差異蛋白質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn)，糖原磷酸化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等21 個蛋白質(zhì)可能與灘羊肉的風(fēng)味前體物質(zhì)及其風(fēng)味表達的差異有關(guān)。

關(guān)鍵詞：冷鮮灘羊肉;同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù);風(fēng)味前體物質(zhì);差異表達蛋白質(zhì)

Abstract： In this study， chilled Tan sheep meat was analyzed by isobaric tags for relative and absolute quantitation （iTRAQ） and liquid chromatography tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） in order to identify the differential proteins related to the formation and regulation of flavor precursors in Tan sheep meat. Quantitative analysis of Tan sheep meat from 0 to 12 days after slaughter was carried out， and credible proteins and differential proteins were screened out and identified via database search. A total of 814 proteins were identified in three comparative groups of meat samples. A total of 159 differential proteins were found between 0 and 4 days postmortem， and 151 both between 4 and 8 days， and between 8 and 12 days. By analyzing these groups of differential proteins， it was found that 21 proteins， such as glycogen phosphorylase， triose phosphate isomerase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， might be related to the variability of flavor precursors and flavor expression in Tan sheep meat.

Keywords： chilled Tan sheep meat; isotope marker relative and absolute quantitative technique; flavor precursors; differentially expressed proteins

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190226-036

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）05-0007-06

引文格式：

李子欣， 尤麗琴， 羅瑞明， 等. 灘羊肉風(fēng)味形成中重要蛋白質(zhì)的解析[J]. 肉類研究， 2019， 33（5）： 7-12. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190226-036.? ? http：//www.rlyj.net.cn

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色、香、味、質(zhì)構(gòu)是評價羊肉及其制品品質(zhì)的重要指標(biāo)，對其評定方法多有研究，但從微觀水平闡述其形成機理，特別是在屠宰后、加工熟制、殺菌、保藏中發(fā)生的微觀水平變化與品質(zhì)改變宏觀表現(xiàn)之間的關(guān)系缺乏機理性的研究[1-3]。目前，針對肉類和肉類產(chǎn)品的評價主要在顏色、香味、味道和質(zhì)地方面進行評估。對肉品風(fēng)味物質(zhì)的研究還停留在滋氣味物質(zhì)的分析鑒定，對其來源尚不清楚，關(guān)于反應(yīng)過程中的前體物質(zhì)和中間物質(zhì)尚不清楚;反應(yīng)中的反應(yīng)條件、調(diào)控因素及其形成機理并沒有進行深入研究，特別是灘羊肉貯藏加工中發(fā)生的微觀變化及其與宏觀表現(xiàn)的聯(lián)系尚缺乏深入研究[4-6]。

肉本身含有風(fēng)味前體化合物，其在加熱過程中經(jīng)歷一系列化學(xué)變化，形成肉味。風(fēng)味前體物質(zhì)是研究肉類風(fēng)味和肉質(zhì)重要組成部分的關(guān)鍵因素。一般來說，風(fēng)味物質(zhì)前體、中間體中的蛋白質(zhì)經(jīng)基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達生成，脂質(zhì)、糖類等合成不由基因直接控制，但合成酶由基因調(diào)控[7-9]。羊在宰殺后活體的生命活動停止，但器官、組織、細胞仍然存活一定時間，基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達與活體相比進入新的階段。新的蛋白質(zhì)推動著代謝物的變化，產(chǎn)生新的物質(zhì)及新的生命活動[10-12]。通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究宰后基因轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達與風(fēng)味物質(zhì)前體、中間體的關(guān)聯(lián)，是研究灘羊肉風(fēng)味物質(zhì)前體及中間體合成途徑及其調(diào)控機制的有效途徑，同時為代謝組學(xué)研究宰后組織代謝物與風(fēng)味物質(zhì)前體、中間體的關(guān)聯(lián)提供一定理論基礎(chǔ)[13-15]。

本研究以灘羊肉為研究對象，采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)以及多維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對不同貯藏期的鹽池灘羊肉進行定量分析，鑒定和篩選出差異蛋白質(zhì)，找出差異蛋白質(zhì)與風(fēng)味物質(zhì)前體、中間體的關(guān)聯(lián)，為進一步研究灘羊肉屠宰后的代謝生化反應(yīng)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品來自寧夏鹽池縣大夏牧場食品有限公司，所取樣本均來自現(xiàn)宰殺的鹽池灘羊。采集貯藏溫度4 ℃、相對濕度為85%的灘羊背最長肌200 mg，封裝于滅菌冷凍管中待用。采樣周期為3 d，即采樣時間點為0、4、8、12 d，每組樣本做3 個平行。

尿素（分析純）、二硫蘇糖醇（dithiothreotol，DTT，色譜純）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA，色譜純）、甲酸（formic acid，F(xiàn)A，色譜純） 美國GE公司;十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS，色譜純）、三羧基氨基甲烷（tricarboxyl aminomethane，Tris，色譜純）、三氯乙酸（three chloroacetic acid，TCA，色譜純）、過硫酸銨（ammonium persulfate，AP，色譜純）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED，色譜純）

美國Amresco公司;三乙二胺碳酸鹽（triethylenediamine carbonate，TEAB，色譜純）、考馬斯亮藍G-250（色譜純） 美國Sigma公司;胰蛋白酶（色譜純） 美國Promega公司;乙腈（acetonitrile，ACN，色譜純）、水（分析純） 美國Thermo公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sciex Triple TOF 5600質(zhì)譜儀（配備納升噴霧Ⅲ離子源）、Eksigent nano LC-1D plus液相系統(tǒng)（Analyst TF 1.6數(shù)據(jù)處理軟件） 美國Sciex公司;Eppendorf冷凍離心機 德國Eppendorf公司;Image Scanner掃描儀 美國GE Healthcare公司;EXF32086A真空冷凍干燥機 美國Thermo公司;VCX130超聲波細胞粉碎機 美國Sonics公司;Mini PROTEAN tetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

取適量冷凍樣品，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入500 μL

SDS裂解液，之后加入蛋白酶抑制劑，使其最終濃度為0.001 mol/L;使用勻漿器將肌肉組織打碎，冰上超聲破碎功率為80 W，超聲破碎1.0 s，封閉1.0 s，持續(xù)3 min;將溶液在室溫條件下15 000×g離心15 min，取上清液，再次離心取上清液;加入5 倍體積的預(yù)冷卻丙酮搖勻并混合，在-20 ℃條件下沉淀過夜;4 ℃、12 000×g離心10 min，收集沉淀;加入適量的預(yù)冷丙酮搖勻，混合，4 ℃、12 000×g離心15 min，收集沉淀，重復(fù)此步驟1 次;常溫干燥后（3 min左右），溶解于樣品裂解液中，室溫溶解3 h;將溶液在室溫條件下12 000×g離心10 min，取上清液，再次離心取上清液;上清液是組織的總蛋白質(zhì)溶液，測定并記錄蛋白質(zhì)濃度，-80 ℃貯藏使用。

1.3.2 蛋白質(zhì)濃度的測定

采用BCA蛋白質(zhì)濃度測定方法[16]。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）

取含有15 μg蛋白質(zhì)的樣品溶液，采用12%凝膠的SDS-PAGE進行分離;用考馬斯亮藍染色法分離凝膠，采用Candiano等[17]的方法進行染色。具體操作如下：固定2 h、染色12 h、水洗至背景清晰;染色后的凝膠應(yīng)用ImageScanner掃描儀進行掃描，掃描模式為全彩模式，光密度值為300 dpi。

1.3.4 胰蛋白酶酶解及標(biāo)記

參考Wisniewski等[18]的方法酶解蛋白質(zhì)：1）蛋白質(zhì)定量后每個樣品各取含有100 μg蛋白質(zhì)的樣品溶液，于10 K的超濾管中，加入120 μL還原劑緩沖液（含0.01 mol/L?DTT、0.008 mol/L尿素和0.1 mol/L TEAB，pH 8.0），60 ℃反應(yīng)1 h;2）加入IAA至終濃度為0.05 mol/L，室溫避光反應(yīng)40 min;3）4 ℃、12 000 r/min離心20 min，棄掉收集管底部溶液;4）加入100 μL 0.1 mol/L TEAB緩沖液，12 000 r/min離心20 min，2 次;5）更換新收集管，在超濾管中加入100 μL的100 mmol/L TEAB緩沖液，并加入2 μL 1 μg/μL的測序級胰蛋白酶溶液，37 ℃反應(yīng)12 h;6）12 000 r/min離心20 min，收集酶解后肽段，在超濾管中再加入50 μL 0.1 mol/L TEAB緩沖液，12 000 r/min離心20 min，收集管底溶液并凍干;7）向凍干樣品中加入100 μL 0.1 mol/L TEAB緩沖液，渦流混勻，取出40 μL樣品于1.5 mL EP管中進行標(biāo)記反應(yīng);8）從冰箱中取出iTRAQ試劑，平衡到室溫，將iTRAQ試劑離心至管底，加入200 μL異丙醇，渦流混勻，離心，重復(fù)1 次;9）取100 μL iTRAQ試劑加到樣品中，渦流混勻，室溫放置2 h;10）加入200 μL水終止反應(yīng)30 min，凍干后于-80 ℃保存。

1.3.5 反相色譜分離

液相色譜儀：Agilent 1100 HPLC;色譜柱：Agilent Zorbax Extend-C18窄徑柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）;檢測波長：紫外210、280 nm;流動相A：ACN-H2O（2∶98，V/V）;流動相B：ACN-H2O（90∶10，V/V）;流速：300 μL/min;梯度洗脫條件：0～8 min，98%流動相A;8～8.01 min，98%～95%流動相A;8.01～38 min，95%～75%流動相A;38～50 min，75%～60%流動相A;50～50.01 min，60%～10%流動相A;50.01～60 min，10%流動相A;60～60.01 min，10%～98%流動相A;60.01～65 min，98%流動相A。收集8～50 min的樣品，依次每隔1 min收集洗脫液到1～10號離心管中;收集好后真空冷凍干燥，樣品冷凍保存待上質(zhì)譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用ProteinPilot 5.0軟件（美國Sciex公司）進行分析，所用數(shù)據(jù)庫為來自于Uniprot的綿羊數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果及整體分布分析

利用iTRAQ技術(shù)對宰后0～12 d的灘羊肉樣品經(jīng)質(zhì)譜分析及查庫，最終鑒定結(jié)果如表1所示。

對宰后0、4、8、12 d的4 組、12 份灘羊肉樣品中鑒定出的蛋白質(zhì)進行主成分分析。由圖1可知，同組灘羊肉中的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)一定發(fā)散分布，有較好的重復(fù)性，不同組灘羊肉蛋白質(zhì)存在較為顯著的差異，實驗數(shù)據(jù)可行、有效，能夠用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

2.2 差異蛋白質(zhì)分析

酶解標(biāo)記后的樣品利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行分析，分析后進行數(shù)據(jù)庫檢索;對檢索結(jié)果按照未使用片段>1.3且肽段≥1，并去除空白值和反庫數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)篩選可信蛋白，基于篩選出的可信蛋白（多組重復(fù)以均能鑒定到的可信蛋白結(jié)果為基礎(chǔ)進行分析），計算得到每一比較組的差異倍數(shù)值和差異顯著性P值，以差異倍數(shù)值>1.2或差異倍數(shù)值<5/6且P值<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異顯著蛋白。

由表2可知，0 d/4 d組中篩選出1 066 個可信蛋白，4 d/8 d組中篩選出1 106 個可信蛋白，8 d/12 d組中篩選出1 084 個可信蛋白，3 組中均鑒定到的可信蛋白有814 個。差異顯著蛋白篩選結(jié)果為：0 d/4 d組篩選出159 個差異蛋白，4 d/8 d組篩選出151 個差異蛋白，8 d/12 d組篩選出154 個差異蛋白。此外，對各差異比較組的差異蛋白取并集，得到動態(tài)變化蛋白315 個，這部分蛋白可以較好地詮釋不同差異比較組中蛋白的表達模式。

2.3 多組數(shù)據(jù)韋恩圖分析

針對3 組實驗數(shù)據(jù)，通過韋恩圖分析每組中差異蛋白的特性和共性，根據(jù)韋恩圖結(jié)果以及之前的實驗數(shù)據(jù)，篩選得到3 組共有的差異蛋白及獨有的差異蛋白。

圖中數(shù)字表示交集蛋白質(zhì)數(shù)目，并且這些蛋白質(zhì)具有一定差異倍數(shù)。

由圖2可知，0 d/4 d組中獨有32 個差異顯著蛋白，4 d/8 d組中獨有36 個差異顯著蛋白，8 d/12 d組中獨有43 個差異顯著蛋白，3 組樣品共有的差異表達蛋白有75 個，后續(xù)研究以3 組共有的蛋白質(zhì)為主。

2.4 灘羊肉風(fēng)味前體物質(zhì)差異蛋白質(zhì)的篩選

在韋恩圖的基礎(chǔ)上找到3 組共有的差異蛋白75 個，在這75 個蛋白質(zhì)中，除去結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)及功能性蛋白質(zhì)，篩選出表達量變化大的蛋白質(zhì)（酶），對比其在3 組中相對含量的變化幅度，發(fā)現(xiàn)糖原磷酸化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等20 個與風(fēng)味前體物質(zhì)有關(guān)的蛋白質(zhì)。

生肉是沒有香味的，生肉中的風(fēng)味前體物質(zhì)，如糖類、氨基酸等，經(jīng)過加熱發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，最終產(chǎn)生肉的特殊香味。風(fēng)味前體物質(zhì)大多來源于碳代謝、糖代謝、蛋白質(zhì)代謝等生理代謝活動，代謝通路包括糖酵解/糖異生、氧化磷酸化、丙酮酸代謝及氨基酸生物合成等。由表3可知，糖原磷酸化酶[19]、磷酸丙糖異構(gòu)酶[20]、

磷酸丙酯異構(gòu)酶[21]、甘油醛-3-磷酸脫氫酶[22]、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶[23]及烯醇化酶均參與糖酵解/糖異生代謝通路;磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、磷酸葡萄糖苷酶、蛋白磷酸酶及3-磷酸甘油酸脫氫酶[24]均參與氧化磷酸化代謝通路;丙酮酸激酶[25]、鈣轉(zhuǎn)運ATP酶[26]、核苷二磷酸激酶、磷酸葡萄糖苷酶、蛋白磷酸酶及3-磷酸甘油酸脫氫酶均參與丙酮酸代謝通路;2-氧戊二酸還原酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶[27]、NAD+氧化還原酶、磷酸甘油氧化還原酶[28]、乙醛酸還原酶[29]、L-2-羥基羥酸脫氫酶及果糖二磷酸醛縮酶[30]均參與氨基酸生物合成代謝通路，這些酶通過調(diào)控不同代謝通路，影響風(fēng)味前體物質(zhì)的形成。

2.5 灘羊肉差異蛋白質(zhì)層次聚類分析

a. 0 d/4 d組;b. 4 d/8 d組;c. 8 d/12 d組;每個小方格表示每個蛋白，其顏色表示數(shù)據(jù)大小，數(shù)據(jù)越大顏色越深;每行表示每個蛋白在不同組中的表達量情況，每列表示每個組中所有差異蛋白的表達量情況;上方樹形圖表示對不同分組數(shù)據(jù)的聚類分析結(jié)果，左側(cè)樹狀圖表示對不同組蛋白數(shù)據(jù)的聚類分析結(jié)果。

針對多組數(shù)據(jù)，通過表達模式聚類熱圖對每組中的差異點表達模式進行分析，熱圖是對實驗數(shù)據(jù)分布的直觀可視化方法，可以用來進行標(biāo)準(zhǔn)化后實驗數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制和差異數(shù)據(jù)富集后的定制化數(shù)據(jù)展示[31-32]。熱圖也可以對數(shù)據(jù)和樣品進行聚類，觀測樣品質(zhì)量，同時也可以根據(jù)表達譜對共表達數(shù)據(jù)進行分組。

本研究基于R語言進行表達模式聚類熱圖分析。由圖3可知，0 d/4 d、4 d/8 d、8 d/12 d組灘羊肉與風(fēng)味前體物質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)含量分布差異很明顯。根據(jù)蛋白質(zhì)的編號，對照表3進行后續(xù)分析。貯藏0～12 d內(nèi)，差異表達蛋白質(zhì)的種類隨貯藏時間的延長總體呈下降趨勢。0 d/4 d組蛋白質(zhì)含量分布差異非常明顯。由圖3a可知，烯醇化酶、糖原磷酸化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸丙酯異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶及蛋白磷酸酶等差異蛋白在4 d組的含量較高，而在0 d組的含量相對較低;由圖3b可知，3-磷酸甘油酸脫氫酶、2-氧戊二酸還原酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、磷酸甘油氧化還原酶、乙醛酸還原酶及L-2-羥基羥酸脫氫酶等差異蛋白在8 d組的含量較高，而在4 d組的含量相對較低。8 d是代謝活動的分水嶺，貯藏8 d后，代謝酶含量開始下降，與風(fēng)味前體物質(zhì)形成相關(guān)的代謝途徑關(guān)閉。

3 結(jié) 論

本研究選取寧夏灘羊羔羊肉為實驗樣品，應(yīng)用iTRAQ技術(shù)對宰后0、4、8、12 d的灘羊肉樣品進行差異蛋白質(zhì)分析，在整個數(shù)據(jù)預(yù)處理過程中分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析包括可信蛋白質(zhì)篩選、差異蛋白質(zhì)篩選、主成分分析、韋恩圖分析及層次聚類分析。3 組樣品共篩選出差異蛋白質(zhì)464 個，根據(jù)聚類熱圖及韋恩圖分析篩選出75 個差異蛋白質(zhì);從上述差異蛋白質(zhì)中找到可能和灘羊肉風(fēng)味前體物質(zhì)有關(guān)聯(lián)的20 個差異蛋白質(zhì)，分別為糖原磷酸化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸丙酯異構(gòu)酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、烯醇化酶、丙酮酸激酶、鈣轉(zhuǎn)運ATP酶、核苷二磷酸激酶、磷酸葡萄糖苷酶、蛋白磷酸酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、

2-氧戊二酸還原酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、NAD+氧化還原酶、磷酸甘油氧化還原酶、乙醛酸還原酶、L-2-羥基羥酸脫氫酶和果糖二磷酸醛縮酶。

尋找差異蛋白質(zhì)有助于進一步探索宰后灘羊肉的代謝過程，了解肉類的風(fēng)味以及風(fēng)味物質(zhì)前體、中間體的來歷、反應(yīng)過程、反應(yīng)條件、調(diào)控因素及其形成機理。用蛋白質(zhì)組學(xué)研究屠宰后基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、表達與風(fēng)味物質(zhì)前體、中間體的關(guān)聯(lián)，是了解灘羊肉風(fēng)味物質(zhì)前體及中間體合成途徑及其調(diào)控機制的有效方法。本研究為揭示冷鮮肉中差異蛋白質(zhì)形成之間的關(guān)系及研究冷鮮羊肉的代謝驅(qū)動提供了理論參考。

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收稿日期：2019-02-26

基金項目：國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31860427）

第一作者簡介：李子欣（1995—）（ORCID： 0000-0002-9591-7123），女，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail： 635872396@qq.com

*通信作者簡介：羅瑞明（1964—）（ORCID： 0000-0003-3704-0519），男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail： ruimingluo.nx@163.com