酸棗自由態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚對人主動脈平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的影響

李漢卿，劉豐銘，單樹花，魯 洋，張曉莉，李卓玉,,*

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006 ；2.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006 ）

動脈粥樣硬化是導(dǎo)致心腦血管疾病的重要誘因之一，是一種多因素導(dǎo)致的慢性疾病，動脈粥樣硬化發(fā)病誘因主要有2 個方面：一方面為血管內(nèi)膽固醇等脂質(zhì)的積累，逐漸引起動脈粥樣硬化，導(dǎo)致腦中風(fēng)和冠心病等[1-2]；另一方面為機械、炎癥等原因?qū)е卵軆?nèi)皮損傷[3]。人主動脈平滑肌細胞（human aortic smooth muscle cell，HASMC）是主動脈中膜的主要組成部分[4]，存在收縮型和合成型2 種不同表型：收縮型分化程度高，細胞呈紡錘樣細長梭形，增殖和遷移能力較弱，正常成熟血管壁表現(xiàn)為該類型[5-7]；而合成型分化程度較低，細胞肥大呈峰谷狀生長，增殖和遷移能力較強。動脈粥樣硬化中期形成動脈粥樣斑塊，主要是HASMC由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型后，合成型的血管平滑肌細胞經(jīng)過損傷的內(nèi)膜，從血管壁中層遷移到內(nèi)膜。遷移后合成型的血管平滑肌細胞增殖并吞噬低密度脂蛋白[8-10]等脂類蛋白，形成血管平滑肌細胞源性泡沫細胞[11]，從而促進動脈粥樣硬化的進程，引發(fā)心腦血管疾病。由此可見，HASMC表型轉(zhuǎn)化是促進動脈粥樣硬化的重要因素，也是當(dāng)今研究熱點之一。

酸棗（Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) Hu ex H. F. Chow）別名野棗，棗屬植物，是棗的原生種，在我國分布較廣[12-13]，是生長于我國北方的野生藥用植物資源，有著很高的營養(yǎng)價值和藥用價值，富含糖、有機酸、維生素和多種酚類化合物[14]。研究表明，酸棗仁味甘性平，具有安神鎮(zhèn)靜作用，富含脂肪酸類、三萜類和黃酮類等成分，是治療動脈粥樣硬化性心腦血管疾病的高頻藥物之一[15-16]；酸棗葉中提取到的酸葉酮、蘆丁等成分可以治療冠心病等心腦血管疾病；酸棗肉中富含許多可溶性糖、多種有機酸、礦質(zhì)元素[17]和氨基酸等營養(yǎng)成分，對于動脈粥樣硬化的治療也有一定作用。近年來，有研究證明酸棗具有防病抗衰老與延年益壽的作用[18]，這些與酸棗中的多酚類物質(zhì)密不可分。

本實驗以酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉為原材料，運用不同方法提取自由態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚，對其不同方法提取的多酚質(zhì)量濃度進行了測定，并研究了各種多酚對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響，為動脈粥樣硬化的預(yù)防和治療提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸棗葉、酸棗肉和酸棗仁 國藥控股國大藥房山西益源連鎖有限公司。

HASMC 美國模式培養(yǎng)物集存庫；DMEM/F-12（HAM）1∶1培養(yǎng)基 美國Biological Industries公司；無支原體胎牛血清 美國Gibco公司；噻唑藍、福林-酚試劑、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記鬼筆環(huán)肽、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 北京索萊寶科技公司；二甲基亞砜 美國Amresco公司；胰蛋白酶 北方同正公司；血管緊張素II（angiotensin II，AngII） 上海阿拉丁試劑有限公司；乙醇、碳酸鈉、沒食子酸、氫氧化鈉等均為進口分裝或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

5417離心機 德國Eppendorf公司；756MC型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；Milli-QA10超純水儀、超濾管 美國Millipore公司；CO2細胞培養(yǎng)箱、真空冷凍干燥機 美國Thermo公司；Delta Vision Elite系統(tǒng) 美國Applied Precision公司；倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；細胞培養(yǎng)板 美國Hyclone公司。

1.3 方法

1.3.1 酸棗多酚的有機溶劑法提取

樣品預(yù)處理：酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉用組織研磨儀粉碎為粉末狀。

自由態(tài)多酚提?。悍謩e稱取酸棗肉粉、酸棗仁粉和酸棗葉粉各10 g，加入適量預(yù)熱的體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，攪拌均勻后靜提1 h，然后將混合物5 000 r/min離心10 min，收集上清液。重復(fù)上述方法，收集上清液。將2 次收集的上清液混合后在80 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡乙醇，最后用冷凍干燥機將其冷凍干燥即相應(yīng)為酸棗肉自由態(tài)多酚（Ziziphus jujuba flesh free polyphenol-ethyl alcohol，ZSFFP-E）、酸棗仁自由態(tài)多酚（Ziziphus jujuba seeds free polyphenolethyl alcohol，ZSSFP-E）、酸棗葉自由態(tài)多酚（Ziziphus jujuba leaves free polyphenol-ethyl alcohol，ZSLFP-E）。在-20 ℃保存，使用時用超純水溶解。

結(jié)合態(tài)多酚提?。簩⑻崛⊥曜杂蓱B(tài)多酚的酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉沉淀按如下2 種方法消化：1）加入100 mL NaOH消化；2）加入100 mL的甲醇和濃硫酸配制的混合溶液消化，在室溫下用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢? h，然后在混合物中加入適量HCl，調(diào)pH值至7，終止消化。然后將混合物在11 000 r/min離心10 min，取上清液。在上清液中加入等體積的乙酸乙酯后充分?jǐn)嚢瑁?1 000 r/min離心10 min，重復(fù)5 次充分除脂。將多酚提取液在70 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡有機溶劑后停止，最后用冷凍干燥機將其冷凍干燥，分別得到6 種結(jié)合態(tài)多酚：酸棗肉結(jié)合態(tài)多酚-法1（ZSFBP-1-E）、酸棗仁結(jié)合態(tài)多酚-法1（ZSSBP-1-E）、酸棗葉結(jié)合態(tài)多酚-法1（ZSLBP-1-E）、酸棗肉結(jié)合態(tài)多酚-法2（ZSFBP-2-E）、酸棗仁結(jié)合態(tài)多酚-法2（ZSSBP-2-E）、酸棗葉結(jié)合態(tài)多酚-法2（ZSLBP-2-E）。在-20 ℃保存，使用時用超純水溶解。

1.3.2 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉中多酚質(zhì)量濃度的測定

采用福林-酚比色法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度分別為0、20、60、100、150、200、300、400、500、600 μg/mL。將1 mL樣品移入離心管，12 000×g離心15 min。加100 μL標(biāo)準(zhǔn)液或樣品和400 μL去離子水到試管中。加100 μL福林-酚試劑，混勻靜置6 min。然后加1 mL的7% Na2CO3和0.8 mL去離子水，混勻靜置90 min。用紫外-可見分光光度計在760 nm波長處檢測吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量（mg）為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.443 1x+0.016 1（R2＝0.998 9），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中多酚的質(zhì)量濃度。

1.3.3 細胞培養(yǎng)

HASMC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F-12（HAM）1∶1培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 細胞形態(tài)學(xué)觀察

用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，經(jīng)胰酶消化后制成細胞懸液，采用血球計數(shù)板進行計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋細胞濃度至5 000 個/孔，接種到96 孔板中饑餓處理24 h，使細胞周期同步。然后棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含有多酚和10-6mol/L AngII的完全培養(yǎng)基，每種多酚設(shè)置5 個平行孔，待處理24、48 h后，在倒置顯微鏡下觀察HASMC的表型轉(zhuǎn)化情況，并在拍照視野內(nèi)隨機選取50 個細胞測量其長度和寬度，求其平均值。

1.3.5 細胞熒光染色觀察

將蓋玻片酸泡過夜，蒸餾水沖洗干凈，浸泡于體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液中，使用時將蓋玻片上乙醇燒干，鋪于12 孔板中，將用無血清培養(yǎng)基稀釋好的濃度為20 000 個/mL的HASMC鋪于12 孔板中，饑餓處理24 h。待處理完成后棄掉無血清培養(yǎng)基，分別加入1 mL含10-6mol/L AngII的完全培養(yǎng)基，然后加入ZSSBP-2-E、ZSLFP-E，終質(zhì)量濃度分別為0.15、1.5 mg/mL，處理48 h。吸棄培養(yǎng)基，用37 ℃預(yù)熱的pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次，每孔加入600 μL免疫熒光固定液固定10 min，用PBS清洗3 次，每次輕搖5 min。每孔加入500 μL 0.5% TritionX-100溶液透化處理5 min，用PBS清洗3 次，每次輕搖5 min。每孔加200 μL 100 nmol/L FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液，室溫避光孵育30 min，用PBS清洗3 次，每次輕搖5 min。每孔加200 μL 100 nmol/L DAPI溶液，室溫避光孵育30 min，用PBS清洗3 次，每次輕搖5 min。在載玻片中央滴加適量抗熒光猝滅劑，將蓋玻片從12 孔板中取出倒置在載玻片上，封片劑封片后用Delta Vision Elite系統(tǒng)觀察HASMC表型轉(zhuǎn)化情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均為3 次獨立實驗的結(jié)果，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 17.0軟件統(tǒng)計分析，組間差異分析采用t檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉自由態(tài)及結(jié)合態(tài)多酚質(zhì)量濃度

表1 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉中自由態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚質(zhì)量濃度Table 1 Contents of free and bound polyphenols in the flesh,seeds and leaves

由表1可知，酸棗葉中多酚質(zhì)量濃度排序依次為：ZSLFP-E＞ZSLBP-2-E＞ZSLBP-1-E；酸棗肉中多酚質(zhì)量濃度排序依次為：ZSFFP-E＞ZSFBP-1-E＞ZSFBP-2-E；酸棗仁中多酚質(zhì)量濃度排序依次為：ZSSFP-E＞ZSSBP-1-E＞ZSSBP-2-E。酸棗肉、酸棗仁和酸棗葉中自由態(tài)多酚質(zhì)量濃度均高于結(jié)合態(tài)多酚。自由態(tài)多酚中ZSLFP-E得率最高，結(jié)合態(tài)多酚中ZSLBP-2-E得率最高。

2.2 酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉多酚對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響

圖1 倒置顯微鏡下觀察6 種結(jié)合態(tài)多酚對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響（24 h）Fig. 1 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with six kinds of bound polyphenols under an inverted microscope (24 h)

表2 圖1中細胞的長度和寬度Table 2 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 1

圖2 倒置顯微鏡下觀察6 種結(jié)合態(tài)多酚對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響（48 h）Fig. 2 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with six kinds of bound polyphenols under an inverted microscope (48 h)

表3 圖2中細胞的長度和寬度Table 3 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 2

圖3 倒置顯微鏡下觀察3 種自由態(tài)多酚對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響（24 h）Fig. 3 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with three kinds of free polyphenols under an inverted microscope (24 h)

表4 圖3中細胞的長度和寬度Table 4 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 3

圖4 倒置顯微鏡下觀察3 種自由態(tài)多酚對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響（48 h）Fig. 4 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with three kinds of free polyphenols under an inverted microscope (48 h)

表5 圖4中細胞的長度和寬度Table 5 Measurement of the length and width of cells shown in Fig. 4

用提取的9 種多酚（終質(zhì)量濃度0.25 mg/mL）分別處理HASMC 24、48 h并觀察其表型轉(zhuǎn)化。6 種結(jié)合態(tài)多酚處理組與對照組、AngII處理組對比，ZSSBP-2-E處理組的HASMC形態(tài)明顯向收縮型轉(zhuǎn)變（圖1、表2），ZSLBP-1-E影響HASMC的存活率，因此未統(tǒng)計HASMC細胞表型轉(zhuǎn)變；隨時間的延長，ZSSBP-2-E處理組的HASMC形態(tài)進一步向收縮型轉(zhuǎn)變（圖2、表3）；3 種自由態(tài)多酚處理組與對照組、AngII處理組對比，ZSLFP-E處理組的HASMC形態(tài)明顯向收縮型轉(zhuǎn)變（圖3、表4）；隨時間的延長，ZSLFP-E處理組的HASMC形態(tài)進一步向收縮型轉(zhuǎn)變（圖4、表5）。以上結(jié)果表明，9 種多酚中，ZSSBP-2-E和ZSLFP-E可以使HASMC明顯由合成型轉(zhuǎn)變?yōu)槭湛s型，并且呈現(xiàn)時間依賴性。

2.3 不同質(zhì)量濃度ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響

圖5 倒置顯微鏡觀察ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響Fig. 5 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with under an inverted microscope

表6 圖5中細胞的長度和寬度Table 6 Measurement results of the length and width of cells in Fig. 5

為了解不同質(zhì)量濃度的ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對HASMC形態(tài)的影響，用不同質(zhì)量濃度梯度的ZSSBP-2-E和ZSLFP-E處理HASMC并觀察其表型轉(zhuǎn)化，隨著ZSSBP-2-E和ZSLFP-E質(zhì)量濃度的增加，HASMC形態(tài)向收縮型轉(zhuǎn)變更加明顯（圖5、表6），同時隨著ZSSBP-2-E和ZSLFP-E質(zhì)量濃度的增加，收縮型細胞數(shù)量在增加。以上結(jié)果表明：ZSSBP-2-E和ZSLFP-E可以使HASMC由合成型轉(zhuǎn)變?yōu)槭湛s型，并且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度梯度依賴性。

2.4 熒光染色實驗觀察ZSLFP-E和ZSSBP-2-E對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響

圖6 Delta Vision Elite觀察ZSSBP-2-E和ZSLFP-E對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響Fig. 6 Observation of phenotype transformation of HASMC after treatment with free polyphenols from leaves and bound polyphenols from seeds obtained by acid digestion under Delta Vision Elite system

為了更加直觀地觀察ZSLFP-E和ZSSBP-2-E對HASMC表型的轉(zhuǎn)化作用，用FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽對HASMC細胞骨架進行染色，用DAPI對HASMC細胞核進行染色，通過Delta Vision Elite系統(tǒng)觀察HASMC形態(tài)。由圖6可知，用ZSLFP-E和ZSSBP-2-E兩種藥物分別處理HASMC后，細胞形態(tài)明顯向收縮型轉(zhuǎn)變。

3 討 論

動脈粥樣硬化是一種慢性疾病，其發(fā)病誘因多種多樣，如不良習(xí)慣、肥胖、高血壓、糖尿病等[19-22]，而HASMC的形態(tài)變化是重要內(nèi)因之一。HASMC存在收縮型和合成型2 種不同表型，收縮型增殖、遷移能力較弱，細胞呈現(xiàn)紡錘樣細長梭形，合成型細胞增殖、遷移能力較強，細胞肥大呈峰谷狀生長。不同的刺激可能引起HASMC由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，并開始遷移、增殖，從而促進動脈粥樣硬化的形成[23]。近幾年來，對于HASMC表型轉(zhuǎn)化的研究是熱門之一，植物中有效成分對于HASMC表型的轉(zhuǎn)化已有很多報道，如具有降血壓、抗氧化、神經(jīng)保護等作用的姜黃素[24-25]，可以促進主動脈平滑肌細胞由合成型向收縮型轉(zhuǎn)變[26]。而多酚對于影響HASMC表型轉(zhuǎn)變的研究也有許多。如鄔秋德等[27]的研究表明黃酒多酚可以抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的大鼠主動脈平滑肌細胞表型的轉(zhuǎn)化，從而能夠預(yù)防一些心血管疾病的發(fā)生。

因此，本實驗通過不同方法提取酸棗不同部位（酸棗肉、酸棗仁、酸棗葉）的自由態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚，并用提取的多酚進行體外實驗，研究其對HASMC表型轉(zhuǎn)化的影響。首先通過多酚的提取和測定，發(fā)現(xiàn)酸棗葉中的自由態(tài)多酚質(zhì)量濃度遠高于其他部位提取的自由態(tài)多酚，且酸棗葉中用甲醇和濃硫酸混合液消化法提取的結(jié)合態(tài)多酚質(zhì)量濃度遠高于其他部位提取的結(jié)合態(tài)多酚。在所提取的9 種多酚中，ZSSBP-2-E和ZSLFP-E可明顯促進HASMC由合成型向收縮型轉(zhuǎn)變，且呈現(xiàn)良好的時間和劑量依賴性。因此，這兩種多酚對于實際生活中預(yù)防和治療動脈粥樣硬化有很好的研究價值。未來可針對這兩種藥物深入探討其發(fā)揮功效的單一組分，并且研究其影響HASMC形態(tài)調(diào)控的基因，以期提供低毒、高效的預(yù)防動脈粥樣硬化的保健品和新型藥物。