殼寡糖對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用

丁榮榮，姜啟興,*，王 斌，夏文水，楊 方，許艷順

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122 ；2.江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122 ）

酒精性肝損傷是由于長(zhǎng)期飲酒造成的。肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致脂肪肝，接著出現(xiàn)炎癥，最終導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2014年關(guān)于酒精與健康的全球狀況統(tǒng)計(jì)，全球有330萬 人死于有害使用酒精，占所有死亡人數(shù)的5.9%。酒精消費(fèi)會(huì)導(dǎo)致較低齡化死亡和殘疾。該研究發(fā)現(xiàn)，過度飲酒是200多種疾病和傷害的誘因。人體內(nèi)有3 種主要的代謝途徑：肝臟、皮膚和呼吸系統(tǒng)；超過90%的酒精被肝臟的酶系統(tǒng)代謝[2]，所以肝臟是酒精損害的主要器官。

殼寡糖是指通過降解殼聚糖獲得的聚合度在2～20之間的寡糖。與殼聚糖相比，殼寡糖具有良好的水溶性，易于在體內(nèi)被吸收、轉(zhuǎn)化和利用，可以發(fā)揮更重要的生物功能[3]。目前已有研究表明殼寡糖具有很好的抗氧化活性[4]、抑菌活性[5-6]、抗炎止血活性[7]、輔助降血脂作用[8-9]、輔助治療糖尿病的作用[10-11]。2014年，殼寡糖已被批準(zhǔn)用于食品的新食品原料。近年來關(guān)于殼寡糖作用保護(hù)酒精性肝損傷已有部分研究，劉紅云等[12]通過建立急性酒精中毒模型說明殼寡糖對(duì)于酒精性肝損傷有保護(hù)作用；劉亮亮等[3]解釋了殼寡糖對(duì)長(zhǎng)期慢性酒精性肝損傷模型的保護(hù)作用；Cho等[13]研究了殼寡糖乳酸鹽對(duì)乙醛脫氫酶活性的影響，突出強(qiáng)調(diào)了乙醛脫氫酶的作用。本研究以殼寡糖為原料，在前人的研究基礎(chǔ)上，參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版）建立急性酒精性肝損傷模型，除了從血清指標(biāo)來闡明殼寡糖的保護(hù)作用外，更加強(qiáng)調(diào)對(duì)一些肝臟指標(biāo)的影響，進(jìn)一步探討殼寡糖對(duì)肝臟的保護(hù)作用，為開發(fā)安全有效的護(hù)肝產(chǎn)品提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)雄性昆明小鼠（6～8 周）購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，動(dòng)物質(zhì)量證書編號(hào)：11400700264351，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2016-0045。

殼寡糖（平均分子質(zhì)量1 299 Da、脫乙酰度85%）為實(shí)驗(yàn)室制備。

聯(lián)苯雙酯滴丸（批號(hào)：170505） 北京協(xié)和藥廠；乙醇（體積分?jǐn)?shù)95%，藥用級(jí)） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

LAB DANCEP S25磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司；DK-8AXX電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；4K15冷凍大容量離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；UV-1800紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；M5酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司；ECLIPSE生物顯微鏡 日本尼康公司；超低溫冷凍冰箱 日本三洋電機(jī)公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及分組

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。明暗期為12 h/12 h，小鼠自由攝取食物和飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將60 只雄性昆明小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組（C）、酒精模型組（M）、陽(yáng)性對(duì)照組（B）、低劑量殼寡糖組（CL）、中劑量殼寡糖組（CM）、高劑量殼寡糖組（CH），每組10 只。陽(yáng)性對(duì)照組每天以0.2 mL/20 g mb給藥灌胃150 mg/kg聯(lián)苯雙酯；根據(jù)國(guó)家規(guī)定殼寡糖食用量不超過0.5 g/d，3 個(gè)劑量殼寡糖組每天分別灌胃70、140、210 mg/kg殼寡糖，對(duì)照組和酒精模型組小鼠給予等體積的蒸餾水。

根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》（2003版），連續(xù)給藥30 d后，酒精模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和3 個(gè)劑量殼寡糖組給予12 mL/kg mb的體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，對(duì)照組給予蒸餾水并禁食16 h。注射60 mg/kg mb的戊巴比妥鈉溶液后采血分離血清，處死動(dòng)物。取肝臟稱質(zhì)量后用液氮速凍于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量及肝臟系數(shù)的測(cè)定

小鼠剛進(jìn)入動(dòng)物房時(shí)稱體質(zhì)量為初始體質(zhì)量/g，最后處死前稱體質(zhì)量為最終體質(zhì)量/g。進(jìn)食量和肝臟系數(shù)分別根據(jù)公式（1）、（2）計(jì)算。

1.3.3 生化指標(biāo)測(cè)定

根據(jù)試劑盒說明書測(cè)定血清中ALT、AST活力和TC濃度，以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%肝臟勻漿中SOD活力和GSH、MDA含量。

1.3.4 組織病理學(xué)觀察

各組小鼠肝臟組織于體積分?jǐn)?shù)10%福爾馬林固定24 h后，通過石蠟切片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色來進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 殼寡糖對(duì)小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量以及肝臟系數(shù)的影響

表1 殼寡糖對(duì)小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量以及肝臟系數(shù)的影響Table 1 Effect of COS on body mass, food intake and liver coefficient of mice

從表1可見，初始體質(zhì)量、最終體質(zhì)量以及進(jìn)食量在各個(gè)組別之間均沒有顯著性差異。說明灌胃殼寡糖未對(duì)小鼠的生長(zhǎng)造成影響。模型組肝臟系數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明在攝入酒精后肝臟因受損而腫大；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和殼寡糖各劑量組肝臟系數(shù)均顯著降低（P＜0.05），說明殼寡糖和陽(yáng)性對(duì)照可以緩解小鼠肝臟受損情況，陽(yáng)性對(duì)照組的效果比殼寡糖好。

2.2 殼寡糖對(duì)酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST活力和TC濃度的影響

ALT、AST活力是反映肝細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)，肝細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重壞死時(shí)其活力會(huì)明顯升高[14]。從圖1中可知，與正常組相比，模型組ALT、AST活力均極顯著增加（P＜0.01），表明酒精性肝損傷模型成功建立。與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和殼寡糖各劑量組的ALT活力極顯著降低（P＜0.01），趨于正常水平。與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和殼寡糖各劑量組AST活力顯著降低（P＜0.05），但和正常組比較有顯著性差異（P＜0.05）。總之，殼寡糖可抑制酒精引起的血清ALT、AST活力升高并改善肝功能。劉紅云等[12]報(bào)道殼寡糖組ALT、AST活力較酒精組極顯著降低，這與本研究結(jié)果一致。

酒精性脂肪肝與血脂有密切的關(guān)系。過量攝入酒精會(huì)導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)的積累，如果肝臟發(fā)生脂肪病變，血脂濃度則會(huì)增加[15-16]。與正常組比較，模型組血清TC濃度極顯著升高（P＜0.01），表明酒精攝入可能引起膽固醇堆積并影響脂質(zhì)代謝。與模型組相比，殼寡糖組的血清TC濃度極顯著降低（P＜0.01），表明它可以改善脂肪堆積。劉亮亮等[3]報(bào)道與模型組相比，殼寡糖各劑量組均能顯著降低TC濃度，且與正常對(duì)照組比較差異不明顯，本研究結(jié)果與其一致。

2.3 殼寡糖對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟SOD活力和GSH、MDA含量的影響

酒精會(huì)在人體的新陳代謝中產(chǎn)生大量的活性氧，影響機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致酒精性肝損傷，而體內(nèi)的抗氧化劑會(huì)保護(hù)細(xì)胞免受活性氧的影響，但這些抗氧化劑的活性很容易被過量的脂質(zhì)過氧化物清除，導(dǎo)致肝臟損傷[17]。

表2 殼寡糖對(duì)小鼠肝臟SOD活力和GSH、MDA含量的影響Table 2 Effect of COS on SOD activity and GSH and MDA contents in liver of mice

GSH和SOD在體內(nèi)氧化與抗氧化能力之間的平衡中起著重要作用[18]，由表2可知，與正常組相比，模型組的GSH含量、SOD活力均顯著降低（P＜0.05），這表明酒精引起小鼠肝臟中過氧化物水平的顯著增加，并且使抗氧化能力下降。與模型組相比，殼寡糖組GSH含量、SOD活力極顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，低劑量和高劑量殼寡糖組的MDA含量極顯著降低，而MDA是自由基作用于脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，通過測(cè)定MDA含量可以反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，它是膜脂質(zhì)過氧化的常用指標(biāo)[19-20]。這表明，殼寡糖能有效防止酒精攝入引起的小鼠肝細(xì)胞過度氧化，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力可能在酒精性肝損傷的保護(hù)中起重要作用。

圖2 殼寡糖對(duì)小鼠肝臟病理切片的影響（HE染色）(×100）Fig. 2 Photomicrographs of liver sections stained with hematoxylin and eosin (× 100)

由圖2可知，在正常組中，肝小葉的結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞呈放射狀排列且排列整齊，肝竇正常，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰。相比之下，酒精灌胃后導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷。模型組肝細(xì)胞排列無序，肝竇變窄、分散，而且可見點(diǎn)狀壞死和炎癥細(xì)胞。殼寡糖低劑量組和殼寡糖中劑量組肝細(xì)胞排列逐漸趨于整齊，但還可見少數(shù)炎癥細(xì)胞。在殼寡糖高劑量組中，肝細(xì)胞排列整齊，肝竇已恢復(fù)正常，炎癥細(xì)胞和點(diǎn)狀壞死細(xì)胞明顯減少，肝細(xì)胞霧化情況明顯減少。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，殼寡糖能顯著降低血清ALT、AST活力，改善肝功能；肝臟中肝臟系數(shù)、TC濃度、MDA含量也顯著降低，有效地減少了脂肪的積累；GSH含量和SOD活力則顯著增加，脂質(zhì)過氧化程度降低；觀察肝臟病理學(xué)切片可以明顯看到殼寡糖組肝細(xì)胞排列趨于整齊，說明殼寡糖能有效緩解酒精引起的肝臟損傷。

目前對(duì)宿醉和肝臟保護(hù)方面的機(jī)理研究主要是提高肝組織的抗氧化能力、消除氧自由基、減少脂質(zhì)過氧化、緩解脂肪堆積、調(diào)控代謝關(guān)鍵酶以及降低炎癥反應(yīng)這幾個(gè)方面[21-22]。盡管酒精引起的肝毒性與不同的機(jī)制有關(guān)，但不斷有證據(jù)表明氧化應(yīng)激在酒精性肝疾病及其發(fā)病機(jī)理中十分重要[23-26]，因?yàn)檠趸瘧?yīng)激會(huì)使肝功能紊亂，從而造成肝細(xì)胞損傷。氧化應(yīng)激是指ROS產(chǎn)生及其消耗抗氧化防御系統(tǒng)，造成促氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡。本實(shí)驗(yàn)中，殼寡糖組都顯著提高了肝臟SOD活力和GSH含量，表明殼寡糖可能可以抑制乙醇誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化和谷胱甘肽降解，并通過抗氧化作用來降低酒精對(duì)肝臟的損害作用。殼寡糖的抗氧化作用與抗氧化基因有關(guān)，它包括血紅素氧化酶-1、絲裂原活化蛋白激酶、編碼還原型輔酶/醌氧化還原酶等[27-28]。另外，Arora等[29]研究表明酒精濫用會(huì)引起內(nèi)毒素血癥，轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）激活，釋放一些炎癥介質(zhì)（腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-6），導(dǎo)致氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致肝損傷。已有研究表明殼寡糖能有效地抑制炎癥激活因子NF-κB基因啟動(dòng)子活性，也表明了殼寡糖對(duì)預(yù)防疾病相關(guān)的炎癥反應(yīng)方面具有一定功效[30-31]。因此，可在后續(xù)研究中增加炎性反應(yīng)因子及相關(guān)通路的檢測(cè)，繼續(xù)開展殼寡糖致酒精性肝損傷機(jī)制的相關(guān)研究工作。