Trichothecium roseum 菌絲體細(xì)胞壁提取物對(duì)蘋果青霉病的控制效果及其誘導(dǎo)抗病機(jī)理

張彥東，胡文瑾，李永才*，畢 陽(yáng)，張婷婷，胡培芳

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070 ）

我國(guó)已成為最大的蘋果生產(chǎn)國(guó)，蘋果種植面積和產(chǎn)量均居世界首位[1]。擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）引起的蘋果青霉病是貯藏期常見的一種侵染性病害[2]，會(huì)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然采用化學(xué)殺菌劑可有效抑制蘋果的青霉病，但由于存在藥物殘留、環(huán)境污染以及病原物產(chǎn)生抗藥性等問題，其應(yīng)用逐漸受到限制[3]；因此開發(fā)抑制蘋果采后病害的安全防腐劑和綜合防控技術(shù)已勢(shì)在必行。

生物源激發(fā)子是指來(lái)源于微生物、寄主植物和非寄主植物中的具有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的活性物質(zhì)，這些物質(zhì)主要為寡糖類、糖蛋白類、蛋白多肽類及脂類化合物[4-5]。其中真菌源激發(fā)子作為一種信號(hào)分子可以引發(fā)植物體內(nèi)抗性相關(guān)酶活力和基因表達(dá)量增加，激發(fā)植物體內(nèi)的代謝調(diào)控，進(jìn)而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性[6]。研究發(fā)現(xiàn)：灰葡萄孢（Botrytis cinerea）菌絲細(xì)胞壁提取物處理能提高葡萄中抗性相關(guān)酶活力及抗病相關(guān)物質(zhì)的含量，有效地降低采后病害的發(fā)生[7]；B. cinerea中的14 kDa激活蛋白PEBCZ處理能提高番茄幼苗對(duì)灰霉病的抗性和防御相關(guān)酶活力[8]；B. cinerea分泌的蛋白激發(fā)子BcSpl也能誘導(dǎo)番茄抗病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[9]；粉紅單端孢（Trichothecium roseum）蛋白激發(fā)子處理不僅可顯著抑制損傷接種杏果實(shí)黑病斑的擴(kuò)展[10]，還能通過提高馬鈴薯切片中苯丙烷代謝關(guān)鍵酶的活力[11]和誘導(dǎo)抗性相關(guān)基因表達(dá)的上調(diào)[12]來(lái)提高馬鈴薯的抗病能力；從稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中分離得到的分泌型蛋白類激發(fā)子MoHrip1可提高水稻對(duì)稻瘟病菌和白葉枯菌的抗性[13]?？梢娬婢醇ぐl(fā)子在采前和采后病害控制中具有良好的應(yīng)用前景，但其作用效果和機(jī)理因來(lái)源真菌、控制病害、寄主等因素而異，需要針對(duì)不同來(lái)源真菌激發(fā)子、不同寄主病害進(jìn)行具體研究，以闡明其作用的特異性。因此本實(shí)驗(yàn)以‘紅富士’蘋果為試材，擬研究采后T.roseum源激發(fā)子處理對(duì)損傷接種P. expansum的蘋果果實(shí)青霉病的控制效果，初步探討誘導(dǎo)抗性作用機(jī)制，以期為真菌源激發(fā)子在果蔬采后病害控制中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試蘋果（品種‘紅富士’）于2016年10月采自甘肅白銀市景泰縣條山農(nóng)場(chǎng)，選取成熟度大致相同、無(wú)病蟲害、大小均勻一致的果實(shí)貯藏于4 ℃冷庫(kù)下待用。

葡萄糖、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂粉、Tween-80 北京Solarbio公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP） 上海索寶生物科技有限公司。

T. roseum分離自貯藏期的甜瓜；P. expansum分離自貯藏期的蘋果。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CX21FSIC光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯工業(yè)有限公司；UV2450型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；H-1850R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)有限公司；1510-04087型酶標(biāo)儀 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物的制備

1.3.1.1 T. roseum菌絲體的培養(yǎng)

將T. roseum接種于馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)7 d，然后取直徑為5 mm左右的菌餅，將其轉(zhuǎn)入PDB液體培養(yǎng)液中，在轉(zhuǎn)速為120 r/min的搖床上培養(yǎng)3 d，將培養(yǎng)的真菌培養(yǎng)液用真空泵抽濾得到菌絲體。

1.3.1.2 T. roseum菌絲體的純化

參照Ayers等[14]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。首先，將菌絲體用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7）洗滌3 次，再懸浮于磷酸鹽緩沖液（含體積分?jǐn)?shù)0.5% Triton-100）中，200 r/min勻漿3～5 min，中間每隔1 min間歇1 次；隨后在轉(zhuǎn)速為4 000 r/min的條件下離心10 min，取沉淀用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液洗滌3 次，之后對(duì)其進(jìn)行離心并用蒸餾水洗滌3 次。

1.3.1.3 T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物的制備

菌絲體經(jīng)超聲波搗碎機(jī)進(jìn)行多次搗碎，然后按照Ayers等[14]的方法獲取得到菌絲體細(xì)胞壁，然后將菌絲體細(xì)胞壁按1∶200（m/V）與去離子水進(jìn)行混合，在高壓滅菌鍋中高溫水解3 h，冷卻后在轉(zhuǎn)速為12 000 r/min件下離心20 min。過濾收集濾液為菌絲體細(xì)胞壁提取物。

1.3.2 病原菌P. expansum的分離、純化

參照李永才[15]的方法并略作修改。采集有青霉病的果實(shí)，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液進(jìn)行果實(shí)表面消毒，再用無(wú)菌水沖洗后切取病間交界處的組織，在無(wú)菌操作條件下移至PDA培養(yǎng)基上，然后放于25 ℃保溫培養(yǎng)，待其長(zhǎng)出分生孢子之后再進(jìn)行分離、純化，并通過回接實(shí)驗(yàn)確定其致病性。分離純化的病原物在PDA培養(yǎng)基上保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 P. expansum孢子懸浮液的配制

參照高春麗等[16]的方法并略作修改，無(wú)菌操作條件下用接種針挑取培養(yǎng)7 d的P. expansum并放于含有無(wú)菌水的三角瓶中，加入少量體積分?jǐn)?shù)0.01% Tween-80，在混合器上振蕩15 s，再將所得溶液通過4 層紗布過濾，用無(wú)菌水稀釋，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配制成1×106個(gè)/mL孢子懸浮液。

1.3.4 T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物對(duì)蘋果青霉病控制效果最佳質(zhì)量濃度的確定

參照Moscoso-Ramírez等[17]的方法并修改。果實(shí)采收后，選取大小均勻、無(wú)病蟲害、機(jī)械損傷的果實(shí)，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液進(jìn)行表面擦拭消毒，分別用0（對(duì)照）、50、100、150、200 mg/mL T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物浸泡蘋果果實(shí)15 min，自然晾干。處理24 h后，用已滅菌的鐵釘（d＝3 mm）在果實(shí)赤道部位均勻打孔3 個(gè)（深3 mm），晾干后用移液槍吸取20 μL P. expansum孢子懸浮液，接入孔內(nèi)，室溫下晾干后，裝入保鮮袋中，在室溫（25±2）℃、相對(duì)濕度45%～55%下貯藏，接種2 d后每隔1 d觀察并測(cè)定果實(shí)表面的病斑直徑，然后根據(jù)病斑直徑確定細(xì)胞壁提取物的最佳處理質(zhì)量濃度，并以該質(zhì)量濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。每個(gè)處理用蘋果9 個(gè)，重復(fù)3 次。

1.3.5 樣品處理

選取用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液表面消毒并晾干的果實(shí)，用滅菌鐵釘（直徑3 mm）在果實(shí)表面沿赤道部位均勻打孔4 個(gè)（深3 mm），待晾干后用移液槍向孔內(nèi)注入20 μL 150 mg/mL T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物，以注入清水作為對(duì)照，常溫貯藏2 h后再注入20 μL P. expansum孢子懸浮液，晾干后裝入包裝箱，上覆聚乙烯塑料薄膜（厚0.01 mm）于常溫條件下貯藏14 d待用，每組處理100 個(gè)果實(shí)，重復(fù)3 次。每隔2 d取樣，在離病斑邊緣1～2 cm的赤道部位表皮下1～5 mm處，用已消毒的不銹鋼刀切取果肉組織4 g，然后錫箔紙包好用液氮進(jìn)行速凍，保存于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)待測(cè)。

1.3.5.1 POD、PPO活力的測(cè)定

參照Yuan Li等[18]的方法并作修改。過氧化物酶（peroxidase，POD）以每分鐘內(nèi)在470 nm波長(zhǎng)處的吸光度變化0.01為1 個(gè)酶活力單位（U）；多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）以每分鐘內(nèi)在420 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為1 個(gè)酶活力單位（U）。單位均為U/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)，樣品均重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.5.2 PAL活力的測(cè)定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）活力測(cè)定參照曹建康等[19]的方法并略作修改。取冷凍的果肉組織3 g，加入100 mmol/L硼酸緩沖液5 mL（pH 8.8，含1 g/100mL PVP、1 mmol/L EDTA-2Na和50 mmol/L β-巰基乙醇），冰浴條件下充分研磨，于4 ℃ 11 250 r/min離心20 min，上清液立即用于酶活力的測(cè)定。取3 支試管分別標(biāo)記為I、II和III，然后向I和II分別加入3 mL 7 mmol/L L-苯丙氨酸溶液（用50 mmol/L硼酸緩沖液配制），再分別向I和III中加入500 μL上清液，立即于37 ℃保溫1 h，保溫完畢后立即在290 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以II和III混合后測(cè)定的吸光度為初始吸光度，I中測(cè)定的吸光度為終止吸光度。另外以提取液代替上清液按照上述方法測(cè)得的吸光度分別作為初始吸光度和終止吸光度的對(duì)照，以每分鐘吸光度變化0.01為1 個(gè)PAL活力單位（U），單位為U/g，結(jié)果以鮮質(zhì)量計(jì)，重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.5.3 4CL活力的測(cè)定

4-香豆酰-輔酶A連接酶（4-coumaryl coenzyme A ligase，4CL）活力測(cè)定參照Liu Yaoyao等[20]的方法并修改。取冷凍的蘋果組織3 g，加入5 mL 4 ℃預(yù)冷的0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，含體積分?jǐn)?shù)25%甘油和0.1 mol/L二硫蘇糖醇），冰浴下充分研磨成勻漿，然后采用4 層紗布進(jìn)行過濾，濾液在4 ℃、11 250 r/min下離心20 min，上清液用于4CL活力的測(cè)定。以每分鐘內(nèi)在333 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為1 個(gè)酶活力單位（U），單位為U/mg（以蛋白質(zhì)量計(jì)）。參照Bradford[21]的方法，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白質(zhì)量濃度。重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.5.4 C4H活力的測(cè)定

本文選用特征參數(shù)主要包括時(shí)間參數(shù)、幅度參數(shù)、面積參數(shù)以及人體心率，如圖2所示。時(shí)間參數(shù)有收縮期時(shí)間占比t1t、舒張期時(shí)間占比t2t；幅度參數(shù)有降中峽相對(duì)高度h2h1，重搏波相對(duì)高度h3h1。面積參數(shù)有脈搏波特征值，其中SABCU表示ABCU 4個(gè)點(diǎn)圍成的面積。面積參數(shù)采用微元法進(jìn)行計(jì)算，令一個(gè)t時(shí)間內(nèi)的脈搏波ABC段有N1個(gè)樣本點(diǎn)，CDE段有N2個(gè)樣本點(diǎn)。時(shí)間元Δt=1/fs，則K1和K2的計(jì)算分別，如式（5）與（6）所示。由于信號(hào)的歸一化操作h1=1。

肉桂酸羥化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）活力的測(cè)定參照Lamb等[22]的方法并修改。取冷凍的果肉組織3 g，冰浴下充分研磨，之后加入5 mL 4 ℃預(yù)冷的提取液（50 mmol/L pH 8.9 Tris-HCl、4 mmol/L MgCl2、15 mmol/L?β-巰基乙醇、10 μmol/L亮抑酶肽、5 mmol/L還原型抗壞血酸、1 mmol/L苯甲基磺酰氟和1.5 g/100mL PVP、體積分?jǐn)?shù)10%甘油），混勻后超聲波破碎2 min，然后用4 層紗布過濾，濾液4 ℃ 9 000 r/min離心20 min，上清液即可用于C4H活力的測(cè)定。C4H以每小時(shí)溶液在340 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.01為1 個(gè)酶活力單位（U），單位為U/mg（以蛋白質(zhì)量計(jì)）。重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.5.5 CAD活力的測(cè)定

肉桂醇脫氫酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活力的測(cè)定參照Goffner等[23]的方法并作修改。取冷凍的果肉組織3 g，加入5 mL 4 ℃預(yù)冷的0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.25，含15 mmol/L β-巰基乙醇、2 g/100 mL聚乙二醇和1 g/100 mL PVP），冰浴下充分研磨成勻漿，在4 ℃、12 500 r/min下離心25 min，上清液用于CAD活力測(cè)定。CAD以每分鐘內(nèi)340 nm波長(zhǎng)處吸光度變化0.001為1 個(gè)酶活力單位（U），單位為U/g（結(jié)果以蛋白質(zhì)量計(jì)）。重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.5.6 總酚、類黃酮含量的測(cè)定

總酚、類黃酮含量測(cè)定參照Pirie等[24]的方法并進(jìn)行修改。取冷凍的蘋果果肉組織3 g，加入5 mL 4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)1% HCl-甲醇，冰浴下充分研磨成勻漿，移入10 mL的離心管內(nèi)置于暗處4 ℃下提取20 min，然后9 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液分別在280 nm和325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值，以每克鮮質(zhì)量樣品的光密度值表征總酚（OD280nm）、類黃酮（OD325nm）含量，重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.5.7 木質(zhì)素含量的測(cè)定

木質(zhì)素含量測(cè)定參照Morrison[25]的方法并進(jìn)行改進(jìn)。取冷凍的蘋果組織3 g，加入5 mL 4 ℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液，冰浴條件下充分研磨，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，過濾后取沉淀物用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液洗滌3 次，乙醇與正己烷體積比為1∶2的溶液沖洗3 次，收集沉淀并將其置于60 ℃干燥至恒質(zhì)量，然后將干燥物溶于1 mL溴化乙酰-冰醋酸（1∶4，V/V）溶液中，在70 ℃下水浴30 min，隨后加入1 mL 2 mol/L NaOH終止反應(yīng)，再加入0.1 mL 7.5 mol/L羥胺鹽酸和2 mL冰醋酸，離心取上清液0.67 mL，用冰醋酸定容到10 mL，在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值，以每克鮮質(zhì)量樣品光密度值表征木質(zhì)素含量（OD280nm），重復(fù)測(cè)定3 次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物處理對(duì)采后蘋果青霉病的控制效果

圖1 T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物處理對(duì)蘋果青霉病的控制效果Fig. 1 Controlling effect of T. roseum hyphal cell wall extract on blue mold of apple

由圖1可知，不同質(zhì)量濃度菌絲體細(xì)胞壁提取物處理的蘋果病斑直徑均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。且隨處理質(zhì)量濃度的增加，其抑制效果呈先升高后下降的趨勢(shì)，其中，150 mg/mL菌絲體細(xì)胞壁提取物處理控制效果最好，該組病斑直徑僅為對(duì)照組的29.5%；因此以150 mg/mL為最佳處理質(zhì)量濃度。

2.2 T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物處理對(duì)蘋果果實(shí)苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活力及其產(chǎn)物含量的影響

2.2.1 對(duì)POD和PPO活力的影響

圖2 T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物對(duì)蘋果組織POD（A）和PPO（B）活力的影響Fig. 2 Effect of T. roseum hyphal cell wall extract on POD (A) and PPO (B) activities in apple fruit

由圖2可知，蘋果果實(shí)組織POD和PPO活力在貯藏期間均呈先升高后下降的趨勢(shì)。150 mg/mL T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物處理顯著提高了果實(shí)POD活力（P＜0.05）（圖2A），該組POD活力在第6天出現(xiàn)峰值，較同期對(duì)照組高80.0%。除第4天外，處理組蘋果組織PPO活力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖2B），且在第10天出現(xiàn)峰值，較同期對(duì)照組高63.3%，隨后逐漸下降。以上結(jié)果說明菌絲體細(xì)胞壁提取物處理對(duì)PPO、POD活力具有一定的促進(jìn)作用。

2.2.2 對(duì)PAL、C4H、4CL和CAD活力的影響

圖3 T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物對(duì)蘋果組織中PAL（A）、C4H（B）、4CL（C）和CAD（D）活力的影響Fig. 3 Effect of T. roseum hyphal cell wall extract on PAL (A), C4H (B),4CL (C) and CAD (D) activities in apple fruit

由圖3可知，除4CL外，蘋果果實(shí)組織PAL、C4H和CAD活力隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)均呈先升高后下降的趨勢(shì)，并且處理組的這4 種酶活力整體上均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），說明菌絲體細(xì)胞壁提取物處理對(duì)酶活力均有一定的促進(jìn)作用。150 mg/mL T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物處理組果實(shí)PAL活力在第6天出現(xiàn)峰值，較同期對(duì)照組高出21.2%（圖3A）。對(duì)于C4H活力，對(duì)照組在8 d后下降，而處理組繼續(xù)升高，12 d后達(dá)到穩(wěn)定（圖3B）。處理組果實(shí)在貯藏6 d后，4CL的活力隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸升高的趨勢(shì)，但對(duì)照組在貯藏2 d后總體呈下降趨勢(shì)（圖3C）。另外，處理組果實(shí)組織CAD活力在第8天達(dá)到最大值，為同期對(duì)照組的1.2 倍（圖3D）。

2.2.3 對(duì)總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量的影響

圖4 T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物對(duì)蘋果組織中總酚（A）、類黃酮（B）和木質(zhì)素（C）含量的影響Fig. 4 Effect of T. roseum hyphal cell wall extract on the contents of total phenolic (A), flavonoids (B), and lignin (C) in apple fruit

由圖4可知，貯藏期間，蘋果組織中總酚、類黃酮和木質(zhì)素的含量整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，且處理組各物質(zhì)含量均高于對(duì)照組，說明150 mg/mL T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物處理顯著提高了蘋果組織的總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量（P＜0.05），并且均在第8天時(shí)達(dá)到峰值，分別較同期對(duì)照組增加了9.2%、6.8%和28.3%

3 討 論

本研究結(jié)果表明，采后T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物處理對(duì)蘋果青霉病具有一定的控制作用，其中150 mg/mL T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物處理能夠有效抑制損傷接種蘋果病斑面積的擴(kuò)展，其抑制率達(dá)到29.5%。這與本課題組前期用T. roseum源激發(fā)子處理控制杏果黑斑病[10]和馬鈴薯干腐病[11-12]的結(jié)果一致，表明T. roseum源激發(fā)子對(duì)采后病害的控制具有廣譜性和良好的應(yīng)用前景。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)B. cinerea菌絲體細(xì)胞壁提取物處理可有效降低葡萄采后自然發(fā)病率[7]，且從該真菌中分離純化的14 kDa激活蛋白PEBC2處理可顯著降低番茄灰霉病的病葉率和發(fā)病率[8]，另外還發(fā)現(xiàn)馬鈴薯早疫病致病菌的胞壁提取物處理能降低馬鈴薯塊莖的早疫病病情指數(shù)[26]?？梢娂?xì)胞壁物質(zhì)是真菌源激發(fā)子的主要來(lái)源，優(yōu)化其提取工藝和使用條件對(duì)進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用具有十分重要的意義。

微生物源激發(fā)子可通過誘導(dǎo)植物組織抗性物質(zhì)的產(chǎn)生和積累而對(duì)病害進(jìn)行有效控制[27]，其中木質(zhì)素、酚類及多種類黃酮類植保素等抗菌化合物的合成主要依賴于組織中的苯丙烷類代謝[28-29]。PAL是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶和限速酶，可將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸[30]。C4H是苯丙烷代謝途徑中第二步反應(yīng)的酶，是苯丙烷代謝的另一關(guān)鍵酶[31]。4CL是苯丙烷代謝總途徑中的最后一個(gè)酶，可催化各種羥基肉桂酸生成相應(yīng)的硫酯，再通過一系列的反應(yīng)最終合成木質(zhì)素、酚類等防御物質(zhì)[32]。同時(shí)，在植物次生代謝中，CAD也是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，與植物生長(zhǎng)發(fā)育和抵御病原菌入侵關(guān)系密切[33]。另外，在植物防御體系中抗性相關(guān)酶POD和PPO也發(fā)揮著積極的作用，其中POD參與了病原物入侵時(shí)植物組織中木質(zhì)素的合成，從而加固細(xì)胞壁以抵抗病原物的入侵，PPO可以將細(xì)胞代謝產(chǎn)物中的酚類物質(zhì)氧化為醌類來(lái)抑制病原物的侵染，從而起到抗病的作用[34-35]。研究發(fā)現(xiàn)Alternaria alternata (Fr.) Keissl菌絲細(xì)胞壁提取物處理能提高采后葡萄皮中抗性相關(guān)酶PAL、POD和PPO的活力及木質(zhì)素、酚類物質(zhì)含量[36]；B. cinerea中的14 kDa激活蛋白PEBCZ處理能提高番茄幼苗葉片中防御相關(guān)酶PAL、POD和PPO的活力[9]；接種稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）細(xì)胞壁來(lái)源的糖蛋白激發(fā)子CSBI后，水稻葉片內(nèi)POD、PAL活力和木質(zhì)素含量在互作早期已開始顯著增加[37]，另外還有研究表明T. roseum蛋白激發(fā)子處理不僅能顯著提高馬鈴薯切片中苯丙烷代謝關(guān)鍵酶PAL、POD和PPO的活力[11]，而且還能誘導(dǎo)馬鈴薯塊莖中苯丙烷途徑中3 個(gè)關(guān)鍵酶（PAL、4CL和C4H）活力的增強(qiáng)及其基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)了木質(zhì)素、總酚、黃酮的積累[12]。大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）分泌蛋白PevDl能誘導(dǎo)棉花葉片抗性早期信號(hào)分子H2O2產(chǎn)生和NO積累，維管束細(xì)胞壁加厚、木質(zhì)素和酚類物質(zhì)的積累，還能提高防御相關(guān)酶PAL、POD和PPO活力以及棉花抗性基因和木質(zhì)素合成相關(guān)基因PAL、C4H和4CL的轉(zhuǎn)錄水平[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物處理能顯著提高采后‘紅富士’蘋果中PPO、POD活力以及誘導(dǎo)果實(shí)組織苯丙烷代謝相關(guān)酶PAL、C4H、4CL和CAD活力的增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)蘋果果實(shí)組織中總酚、類黃酮和木質(zhì)素的積累。這些研究結(jié)果均顯示真菌源激發(fā)子可通過激活植物苯丙烷代謝，增加代謝相關(guān)酶的活力和抗性物質(zhì)的積累來(lái)增加對(duì)病原物的抵抗能力，但真菌源激發(fā)子誘導(dǎo)植物抗病性的具體分子調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

4 結(jié) 論

采后T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物處理能夠有效抑制損傷接種P. expansum蘋果青霉病的擴(kuò)展，其中以150 mg/mL T. roseum菌絲體細(xì)胞壁提取物處理效果為最好。進(jìn)一步研究表明T. roseum菌絲細(xì)胞壁提取物可誘導(dǎo)采后蘋果（‘紅富士’）中PPO、POD、PAL、4CL、C4H和CAD活力的增加，進(jìn)一步提高果實(shí)中抗病代謝產(chǎn)物總酚、類黃酮和木質(zhì)素的含量。