蘇 娟，張萬(wàn)巧，王 曉，李昆華，韓 鄲，楊 丹，岳 健

(云南山里紅生物科技有限公司，云南 昆明 650200)

滇黃精Polygonatum kingianum為百合科Liliaceae 黃精屬Polygonatum的多年生宿根性草本藥用植物[1—3]，主要分布于廣西、四川、貴州、云南等地區(qū)。始載于《名醫(yī)別錄》，其根狀莖性平、味甘，具補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤(rùn)肺、益腎等功效，用于陰虛肺燥，陰血不足和脾胃虛弱之癥[4]。

滇黃精目前主要來源野生采挖，資源存量大幅減少，但需求持續(xù)旺盛，供求不平衡持續(xù)加劇。因此，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)加快人工繁殖速度，對(duì)其資源保護(hù)及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)具有重要意義。前人對(duì)滇黃精的組織培養(yǎng)研究較多[5—7]，但有關(guān)褐化現(xiàn)象的研究較少[8]。本研究分析滇黃精組培的褐化問題，并對(duì)其褐化控制措施進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

滇黃精帶芽塊莖采自云南山里紅生物科技有限公司種質(zhì)資源基地(瀘西)。于當(dāng)年3 月至4 月，從塊莖上切取新萌芽作為外植體材料。

1.2 方法

1.2.1外植體滇黃精根莖洗凈，裁成1.2 cm×1.2 cm 帶新萌芽小塊，置于洗潔精水溶液中浸泡15 min，用流水沖洗1 h，再用洗潔精搖晃清洗5 min，在超凈臺(tái)上消毒，用無(wú)菌水充分清洗，無(wú)菌濾紙吸干。經(jīng)不同消毒方式滅菌后，用無(wú)菌水清洗5 次，將植物組織暴露在消毒液中的部分切除后外植體大小約為1 cm×1 cm，接種至培養(yǎng)基，每瓶接種外植體1 個(gè)，每處理10 瓶，重復(fù)3 次。

1.2.2不同消毒時(shí)間處理先用75%乙醇進(jìn)行表面消毒30 s，再用0.1%氯化汞，2%次氯酸鈉兩種消毒劑處理，各設(shè)置5 個(gè)時(shí)間處理，即6 min、8 min、10 min、12 min、14 min。

1.2.3不同消毒方式處理設(shè)三種消毒方式：均用75%乙醇進(jìn)行表面消毒30 s，再用0.1%氯化汞處理10 min；2%次氯酸鈉處理12 min；0.1%氯化汞處理8 min＋2%次氯酸鈉處理12 min。

1.2.4基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件分三種基本培養(yǎng)基進(jìn)行設(shè)計(jì)，分別為MS、1/2MS、1/4MS。培養(yǎng)基均添加6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1、蔗糖30 g·L-1、活性炭0.1 mg·L-1、瓊脂6 g·L-1，pH=5.8。培養(yǎng)條件光照1500 lx，光照周期12 h·d-1，溫度(24±2) ℃，在常規(guī)組培室進(jìn)行，培養(yǎng)30 d 后觀察外植體褐化情況，并計(jì)算褐化率和獲得率。褐化率為褐化株數(shù)占接種總數(shù)百分比，獲得率為未污染未褐化株數(shù)占接種總數(shù)百分比。數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0 進(jìn)行單因素方差分析[9]。

1.2.5不同溫度處理設(shè)20、25、30 ℃三種溫度，在智能人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)外植體褐化的影響

2.1.1氯化汞滅菌對(duì)外植體褐化的影響滇黃精外植體經(jīng)過75%乙醇處理30 s 表面消毒后，再用0.1%氯化汞進(jìn)行不同時(shí)間處理，統(tǒng)計(jì)褐化率和獲得率如表1。隨著消毒時(shí)間增加，褐化率呈遞減趨勢(shì)，獲得率呈先增后減趨勢(shì)，消毒處理10 min 的獲得率最高。綜合來看，0.1%氯化汞處理10 min 消毒效果最好。

2.1.2次氯酸鈉滅菌對(duì)外植體褐化的影響滇黃精外植體經(jīng)過75%乙醇處理30 s 表面消毒后，再用2%次氯酸鈉進(jìn)行不同時(shí)間處理，統(tǒng)計(jì)褐化率和獲得率如表2。隨著消毒時(shí)間的增加，褐化率呈先減后增趨勢(shì)，獲得率呈先增后減趨勢(shì)，處理12 min 獲得率最高。綜合來看，2%次氯酸鈉處理12 min 效果最好。

2.2 不同滅菌方式對(duì)外植體褐化的影響

試驗(yàn)均用75%乙醇表面消毒30 s，然后以氯化汞和次氯酸鈉進(jìn)行深度滅菌，培養(yǎng)7 d 后不同滅菌方式處理的褐化率和獲得率見表3。通過2%次氯酸鈉12 min+0.1%氯化汞10 min 消毒外植體的抗褐化效果最好，獲得率最高。

表1 氯化汞滅菌對(duì)外植體材料褐化的影響Table 1 Effect of mercuric chloride sterilization on browning of explants

表2 次氯酸鈉滅菌對(duì)外植體材料褐化的影響Table 2 Effect of sodium hypochlorite sterilization on browning of explants

表3 不同消毒方式對(duì)外植體材料褐化的影響Table 3 Effects of different disinfection methods on browning of explants

2.3 不同基本培養(yǎng)基對(duì)外植體褐化的影響

將外植體根莖芽滅菌后接種至不同培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d 后統(tǒng)計(jì)褐化率和獲得率。由表4 可知，不同基本培養(yǎng)基褐化率與獲得率均差異顯著，其中1/4MS 褐化率最高，達(dá)43.33%，1/2MS 褐化率最低，為23.33%；就獲得率而言，1/2MS 最高，為46.11%；其次是MS，1/4MS 的最低。

2.4 不同溫度處理對(duì)外植體褐化的影響

以外植體接種后光照1500 lx，光照周期12 h·d-1，溫度(24±2) ℃下培養(yǎng)作為空白對(duì)照。由表5 可知，在不同溫度處理下，與對(duì)照相比，褐化率最低為20℃，為29.66%，獲得率最高為20℃，為40.03%，對(duì)照與30 ℃處理差異不顯著。由此可見，低溫環(huán)境能抑制滇黃精外植體褐化。

表4 不同基本培養(yǎng)基對(duì)外植體材料褐化的影響Table 4 Effects of different basic mediums on browning of explants

3 結(jié)論與討論

表5 不同溫度處理對(duì)外植體材料褐化的影響Table 5 Effect of different temperature treatment on browning of explants

在藥用植物組織培養(yǎng)過程中，一般通過選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w、消毒方法、培養(yǎng)基和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，控制培養(yǎng)溫度和光照，培養(yǎng)基中添加抗氧化劑和吸附劑，加快繼代轉(zhuǎn)瓶速度等綜合手段防止褐化[10—11]。本試驗(yàn)探討消毒時(shí)間、消毒方式、基本培養(yǎng)基及溫度對(duì)外植體褐化的影響，結(jié)果表明，隨著消毒時(shí)間增加，使用HgCl2處理10 min、NaClO 處理12 min 抗褐化效果明顯，采用75%乙醇處理30 s，NaClO 12 min+ HgCl28 min 消毒，抗褐化效果最好；采用1/2MS 為基本培養(yǎng)基的抗褐化效果比MS、1/4MS 基本培養(yǎng)基的抗褐化效果好，這與張振霞等[12]在番荔枝中的研究結(jié)果一致。邱璐等[13]在云桑組織培養(yǎng)中亦發(fā)現(xiàn)，使用1/2MS 培養(yǎng)基，降低無(wú)機(jī)鹽濃度，能有效減輕褐化現(xiàn)象，降低褐化率。在滇黃精組織培養(yǎng)過程中對(duì)其進(jìn)行低溫處理能明顯降低褐化率，溫度越低，抗褐化效果越好，這與Huang 等[14]、趙伶俐等[15]的結(jié)論一致。

在藥用植物組織培養(yǎng)過程中，影響外植體褐化的因素較多，本試驗(yàn)初步探索消毒方式、基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度對(duì)滇黃精根莖芽組織培養(yǎng)過程中褐化的控制效果，發(fā)現(xiàn)先經(jīng)過75%乙醇處理30 s 消毒表面，再用NaClO 12 min+HgCl28 min 消毒的抗褐化效果最好；選用1/2MS 基本培養(yǎng)基能有效降低褐化率；低溫環(huán)境(20 ℃)能進(jìn)一步減少褐化的發(fā)生。