蒙成 黃艷花

摘要：以玉米小斑病病菌野生型菌株為試材，探索不同植物組織培養(yǎng)基、溫度、培養(yǎng)時(shí)間、高低溫誘導(dǎo)、光照等條件對(duì)分生孢子產(chǎn)生的影響。采用單因素組配18種植物組織培養(yǎng)基，共18個(gè)處理，3次重復(fù);設(shè)A、B 2個(gè)供試溫度處理，溫度梯度設(shè)9個(gè)處理，3次重復(fù);設(shè)9個(gè)培養(yǎng)時(shí)間段，3次重復(fù);設(shè)6個(gè)高、低溫誘導(dǎo)處理，3次重復(fù);設(shè)6種不同光照處理，3次重復(fù)。結(jié)果表明，培養(yǎng)基的成分組合對(duì)分生孢子的產(chǎn)生起決定性作用，配方為100.0 g高粱、0.2 g 硫酸鎂、0.2 g 磷酸鈉、15.0 g玉米葉的7號(hào)培養(yǎng)基最佳，產(chǎn)孢量最多，產(chǎn)孢量為16.8×104個(gè)/g;配方為100 g玉米粒、0.2 g硫酸鎂、0.2 g磷酸鈉、15.0 g玉米葉的9號(hào)培養(yǎng)基次之，產(chǎn)孢量第2，產(chǎn)孢量為10.8×104個(gè)/g。在溫度為24 ℃條件下培養(yǎng)的產(chǎn)孢量最多;培養(yǎng)時(shí)間在35 d內(nèi)，培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)孢量越多;高溫為35 ℃、低溫為4 ℃誘導(dǎo)對(duì)玉米小斑病病菌產(chǎn)孢量均有一定的促進(jìn)作用，但經(jīng)過(guò)高、低溫誘導(dǎo)后產(chǎn)生的部分分生孢子一端連接1節(jié)分生孢子梗;光暗交替各 12 h、光照度為2 000 lx，分生孢子產(chǎn)孢量最高。研究認(rèn)為，能促進(jìn)玉米小斑病病菌分生孢子產(chǎn)量增加的最佳組織培養(yǎng)基配方為100 g高粱、0.2 g硫酸鎂、0.2 g磷酸鈉、15.0 g玉米葉;該培養(yǎng)基在24 ℃、光暗交替各12 h、光照度為 2 000 lx 的條件下，分生孢子產(chǎn)量最高;培養(yǎng)時(shí)間在35 d內(nèi)時(shí)，培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)孢量越高;在高溫為35 ℃、低溫為 4 ℃ 下誘導(dǎo)，對(duì)玉米小斑病病菌產(chǎn)孢量均有一定的促進(jìn)作用，但誘導(dǎo)后產(chǎn)生的部分分生孢子形態(tài)發(fā)生改變。

關(guān)鍵詞：玉米;小斑病菌;培養(yǎng)基;產(chǎn)孢技術(shù);分生孢子

中圖分類(lèi)號(hào)： S435.131.4+9? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0144-04

玉米小斑病（southern corn leaf blight，簡(jiǎn)稱(chēng)SCLB）是世界玉米主產(chǎn)區(qū)的重要病害[1]，是我國(guó)溫暖潮濕玉米產(chǎn)區(qū)的重要葉部病害[2]，在玉米全生育期均可發(fā)生，發(fā)生高峰期為植株抽雄后，感病品種在一般發(fā)病年份可減產(chǎn)10%以上，嚴(yán)重發(fā)生年份可減產(chǎn)20%～30%[3]。利用抗病種質(zhì)資源，選育和種植抗病品種是控制玉米小斑病流行的有效措施[4]，在抗病品種的選育與利用過(guò)程中，抗病性鑒定已成為玉米育種及其區(qū)域適應(yīng)性的一個(gè)常規(guī)工作，而獲得大量分生孢子，或者獲得帶大量分生孢子的菌粒是玉米小斑病抗病性接種鑒定工作順利進(jìn)行的基礎(chǔ)條件。因此，研究并獲得大量分生孢子，對(duì)玉米小斑病抗病性接種鑒定具有十分重要的意義。玉米小斑病分生孢子通常采用高粱粒組織培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)[5]，產(chǎn)孢效果不甚理想，且在培養(yǎng)過(guò)程中容易受到雜菌污染，滋生小昆蟲(chóng)。楊秀娟等發(fā)明了CN201510411758.9《一種玉米小斑病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用》，用該方法培養(yǎng)的病菌產(chǎn)孢量約為等量馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基產(chǎn)孢量的1.2～3.6倍，但是該方法還是利用平板培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢，其產(chǎn)孢、取孢操作過(guò)程繁瑣，不便于大面積抗病鑒定操作，不能用帶病菌培養(yǎng)基進(jìn)行接種。國(guó)內(nèi)至今從系統(tǒng)分析角度對(duì)玉米小斑病病菌產(chǎn)孢技術(shù)進(jìn)行研究的報(bào)道尚不多[6-10]。在玉米小斑病抗病鑒定試驗(yàn)中，通常采用隨機(jī)分離得到的玉米小斑菌病菌作為供試菌株，有時(shí)采用的菌株致病力不強(qiáng)，對(duì)抗病鑒定效果不理想;在病菌分離過(guò)程中，常采用稀釋法進(jìn)行單孢分離，不能確定是否得到了單細(xì)胞純培養(yǎng);在病菌保存中，常采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后保存，但因PDA培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)較高，病菌生長(zhǎng)旺盛，保存后菌株的活力容易衰退。為了獲得產(chǎn)孢效果好、成本低且操作簡(jiǎn)單、便于進(jìn)行大面積抗病鑒定的操作方法，本研究采用標(biāo)記法進(jìn)行單孢分離獲得菌株，以低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基作為菌株保存基質(zhì)，從而獲得大量分生孢子，并經(jīng)致病力鑒定篩選菌株，確保菌株純度、致病力及活力，為大面積開(kāi)展玉米小斑病抗病性鑒定提供保障。本研究以常用接種基物高粱粒、小麥粒及玉米粒為主要材料，以玉米葉、甘露醇、碳酸鉀、硫酸鎂、磷酸鈉等為配料，組配18種植物組織培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)試驗(yàn)，并對(duì)各種產(chǎn)孢培養(yǎng)條件進(jìn)行初步探索，以尋找1種適合玉米小斑病抗病鑒定用高產(chǎn)分生孢子的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，為玉米小斑病抗病性接種鑒定工作簡(jiǎn)單、高效、準(zhǔn)確地開(kāi)展提供保障。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2017年在廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 供試菌株

玉米小斑病病菌野生型菌株由廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院作物研究所玉米試驗(yàn)田的感病病株上采集分離獲得，病原菌分離與培養(yǎng)采取常規(guī)分離方法，采用病菌孢子稀釋純化法，將病菌產(chǎn)生的分生孢子配制成懸浮液，涂抹于PDA平板培養(yǎng)基上，產(chǎn)生病菌單孢菌落，最終獲取純化菌株，獲得病菌的純培養(yǎng)物[11]。

1.2 供試培養(yǎng)基

供試的培養(yǎng)基分別以高粱粒、小麥粒及玉米粒為主要材料，以玉米葉、甘露醇、碳酸鉀、硫酸鎂、磷酸鈉等為配料，單因素組配18種培養(yǎng)基。高粱粒處理方法如下：挑選籽粒飽滿(mǎn)、大小一致、無(wú)病蟲(chóng)的帶皮高粱水煮25 min，經(jīng)水洗瀝干備用;小麥粒處理方法如下：挑選籽粒飽滿(mǎn)、大小一致、無(wú)病蟲(chóng)的帶皮小麥粒浸泡20 min后，水煮15 min后水洗瀝干備用;玉米粒的處理方法如下：挑選大小一致、無(wú)病蟲(chóng)的玉米粒浸泡 12～15 h，水煮1 h，水洗瀝干備用;玉米葉用剛從大田采集的新鮮玉米葉，切成約1 cm2左右的碎片備用;培養(yǎng)基制作方法如下：按配方配制，把所需成分混勻，濕度以藥品能溶解，玉米葉能摻和在籽粒上而無(wú)滴水為宜。將配好的培養(yǎng)基裝入 250 mL 三角瓶中，每瓶裝100 g配好的培養(yǎng)基，于121 Pa高壓滅菌45 min備用。

1.3 供試儀器

試驗(yàn)用培養(yǎng)箱為L(zhǎng)RH-250-GSB1珠江牌培養(yǎng)箱。

1.4 不同培養(yǎng)條件對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響

1.4.1 培養(yǎng)基對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響 單因素組配18種植物組織培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢量試驗(yàn)，每個(gè)配方1個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，共18個(gè)處理，具體配方見(jiàn)表1。玉米小斑病病菌菌種在PDA培養(yǎng)基上擴(kuò)繁6 d，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)9 cm培養(yǎng)皿后，用帶PDA培養(yǎng)基的菌絲接種到供試植物組織培養(yǎng)基上，每份處理接種半皿菌種（下同）。接種后的培養(yǎng)瓶于24 ℃、全黑暗條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11 d，測(cè)定產(chǎn)孢量。

1.4.2 溫度對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響 以7號(hào)培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，分別在12、16、20、24、26、28、32、36、40 ℃共9個(gè)溫度梯度下黑暗培養(yǎng)11 d[12]，3次重復(fù)。設(shè)A、B 2個(gè)處理：A處理為接種后的培養(yǎng)基瓶分別直接于各溫度培養(yǎng)11 d后測(cè)定產(chǎn)孢量;B處理為接種后的培養(yǎng)基瓶于26 ℃全黑暗條件下培養(yǎng)5 d，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)入各溫度下繼續(xù)培養(yǎng)6 d后測(cè)定產(chǎn)孢量。

1.4.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響 7號(hào)培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，將接種后的培養(yǎng)瓶分別放入溫度為20、24 ℃的黑暗條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)5、7、9、11、15、20、25、30、35 d時(shí)測(cè)定產(chǎn)孢量，重復(fù)3次。

1.4.4 高、低溫誘導(dǎo)對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響 7號(hào)培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，把接種后的培養(yǎng)基瓶放入溫度為26 ℃的全黑暗條件下培養(yǎng)5 d，菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)入各高、低溫條件下進(jìn)行誘導(dǎo)處理，處理結(jié)束后放入溫度為24 ℃的黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 d后測(cè)定產(chǎn)孢量。設(shè)7個(gè)處理：溫度為4 ℃，分別處理12、24、48 h;溫度為35 ℃，分別處理12、24、48 h與對(duì)照（26 ℃ 全黑暗下培養(yǎng)5 d后直接轉(zhuǎn)入24 ℃黑暗培養(yǎng) 6 d）[13]，重復(fù)3次。

1.4.5 光照對(duì)分生孢子產(chǎn)量的影響 7號(hào)培養(yǎng)基為供試培養(yǎng)基，分別使用24 h黑暗、12 h黑暗+12 h光照（1 500、2 000、3 000 lx共3種不同光照度梯度）、24 h光照（光照度為 3 000 lx），在這3種不同光照方式處理下于24 ℃恒溫培養(yǎng) 11 d[14]。

1.5 分生孢子產(chǎn)量的測(cè)定

取各處理2 g含病菌的培養(yǎng)基放入50 mL燒杯中，加 10 mL 水，用不繡鋼勺子連續(xù)攪拌約100次，以保證能將菌株所產(chǎn)生的分生孢子刮下至孢子脫落至水里，過(guò)濾得到孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算1 mL孢子懸液中所含孢子數(shù)，折算成1 g培養(yǎng)基產(chǎn)生的孢子量。每個(gè)處理取樣3次，每樣品讀數(shù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)病菌分生孢子產(chǎn)量的影響

由圖1可知，不同培養(yǎng)基對(duì)玉米小斑病病菌產(chǎn)孢子量有明顯影響，14個(gè)配方的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量超過(guò)對(duì)照（常用的高粱培養(yǎng)基），配方7號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)孢子數(shù)量最多，為16.8×104個(gè)/g;配方9號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)孢子量次之，為10.8×104個(gè)/g;排在第3、4位的為13、11號(hào)培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量分別為8.0×104、7.7×104個(gè)/g;14、2、6號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)孢量相當(dāng)，分別為5.7×104、5.5×104、5.2×104個(gè)/g; 3、4、8、15、18、12、10號(hào)培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量依次為3.2×104、2.7×104、2.1×104、1.3×104、

1.2×104、1.2×104、1.1×104個(gè)/g;常用的高粱培養(yǎng)基（CK）產(chǎn)孢量為6.8×103個(gè)/g，17、16、5號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)孢量少于對(duì)照，分別為6.5×103、2.2×103、5.4×102個(gè)/g。因此可見(jiàn)，7號(hào)培養(yǎng)基為玉米小斑病病菌分生孢子產(chǎn)生的最佳培養(yǎng)基。

2.2 溫度對(duì)病菌分生孢子產(chǎn)量的影響

由圖2可知，培養(yǎng)溫度對(duì)玉米小斑病病菌分生孢子產(chǎn)量的影響較大，溫度過(guò)低或過(guò)高都不利于分生孢子的產(chǎn)生，處理A在溫度≤12 ℃或≥32 ℃時(shí)，均不產(chǎn)生分生孢子，在溫度為 16～28 ℃時(shí)，能夠產(chǎn)生孢子，在溫度為20～26 ℃時(shí)，產(chǎn)孢量最多，其中在溫度為24 ℃的條件下產(chǎn)孢量最多;處理B在溫度為12～40 ℃的條件下均可以產(chǎn)生分生孢子，26 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最高，24 ℃時(shí)次之。因此，將接種后的培養(yǎng)基在24 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)是玉米小斑病病菌分生孢子產(chǎn)生的最適宜溫度。

2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)病菌分生孢子產(chǎn)量的影響

由圖3可知，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)玉米小斑病病菌產(chǎn)孢量影響較大，在溫度為20、24 ℃的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間在35 d內(nèi)時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)孢量越多;培養(yǎng)時(shí)間在30 d內(nèi)時(shí)，24 ℃處理的產(chǎn)孢量均高于20 ℃處理。因此，在溫度為20、24 ℃的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為35 d是玉米小斑病病菌分生孢子產(chǎn)生量最多的時(shí)間。

2.4 高、低溫誘導(dǎo)對(duì)病菌分生孢子產(chǎn)量的影響

由圖4可知，在溫度為4 ℃中冷凍24 h的處理產(chǎn)孢量最高，為4.2×105個(gè)/g;35 ℃熱激24 h的處理效果次之，產(chǎn)孢量為3.5×105個(gè)/g;35 ℃熱激48 h與4 ℃冷凍12 h的效果相差不大，產(chǎn)孢量分別為3.2×105、3.1×105個(gè)/g;4 ℃冷凍 48 h 與35 ℃熱激12 h處理與對(duì)照差別均不明顯。研究發(fā)現(xiàn)，高、低溫誘導(dǎo)對(duì)玉米小斑病病菌產(chǎn)孢量均有一定的促進(jìn)作用，但是經(jīng)過(guò)高、低溫誘導(dǎo)后產(chǎn)生的部分分生孢子一端連接1節(jié)分生孢子梗，對(duì)分生孢子的活性是否產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步研究。

2.5 不同光照條件對(duì)病菌分生孢子產(chǎn)量的影響

由圖5可知，光照條件對(duì)玉米小斑病病菌產(chǎn)孢量有一定的影響，適量的光照對(duì)該病菌產(chǎn)孢量有促進(jìn)作用。在連續(xù) 24 h 黑暗條件下不利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為1.9×105個(gè)/g;12 h黑暗+12 h光照（2 000 lx光照度）條件下產(chǎn)孢量最多，達(dá)到 4.6×105個(gè)/g;12 h黑暗+12 h光照（1 500 lx光照度）條件下產(chǎn)孢量次之，為3.3×105個(gè)/g;高強(qiáng)度光照即12 h黑暗+12 h光照（3 000 lx光照度）條件對(duì)該病菌產(chǎn)孢量有抑制作用，產(chǎn)孢量為2.5×105個(gè)/g;連續(xù)24 h光照（光照強(qiáng)度為 3 000 lx）條件下最不利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為1.4×105個(gè)/g。因此，12 h黑暗+12h光照（2 000 lx光照度）條件最有利于玉米小斑病病菌分生孢子的生長(zhǎng)，產(chǎn)孢量最多。

3 結(jié)論與討論

在促進(jìn)植物病原真菌產(chǎn)孢的研究進(jìn)程中，有研究表明，培養(yǎng)基與孢子產(chǎn)生的關(guān)系最大， 采用不同的培養(yǎng)基或者改變它們 的成分， 是促進(jìn)孢子產(chǎn)生的最主要途徑[11]。研究表明，不

同培養(yǎng)基對(duì)多數(shù)茄鏈格孢的產(chǎn)孢量有明顯影響[15-16]。因此，前人開(kāi)展了通過(guò)培養(yǎng)基促進(jìn)產(chǎn)孢量的研究工作，結(jié)果表明，綠豆湯培養(yǎng)液是蕉斑鐮刀菌液體搖瓶產(chǎn)孢最好的培養(yǎng)液，在適宜條件下，產(chǎn)孢量達(dá)到1×106 mL[17];蘋(píng)果腐爛病病菌在加蜂蜜水和蛋白胨的帶殼大麥上能大量產(chǎn)孢[18];辣椒疫霉菌在胡蘿卜、黑麥和燕麥培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生孢子囊，在胡蘿卜培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子囊的數(shù)量最多[19]。本研究選用18種不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)玉米小斑病病菌分生孢子的產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)，使用配方為100 g高粱、0.2 g硫酸鎂、0.2 g磷酸鈉、15.0 g玉米葉的7號(hào)培養(yǎng)基和配方為100 g玉米、0.2 g硫酸鎂、0.2 g磷酸鈉、15.0 g 玉米葉的9號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)孢量較多，分別為16.8×104、10.8×104個(gè)/g;17、16、5號(hào)培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最少，分別為6.5×103、2.2×103、5.4×102個(gè)/g。

有研究表明，玉米小斑病病菌產(chǎn)孢最適溫度為25 ℃[20];玉米小斑病斑產(chǎn)孢的適宜溫度為20～30 ℃，最適溫度為 26 ℃，在5 ℃以下、35 ℃以上不能產(chǎn)孢[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，玉米小斑病病菌在溫度12 ℃以下或32 ℃以上時(shí)，病原菌菌絲體生長(zhǎng)緩慢，不能產(chǎn)孢;在溫度為16～28 ℃時(shí)，病原菌菌絲生長(zhǎng)速度快，能夠產(chǎn)孢;在溫度為20～26 ℃時(shí)，病原菌產(chǎn)孢量迅速增加，在溫度為 24 ℃ 的條件下，產(chǎn)孢量最多。長(zhǎng)菌絲后的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入各溫度中均可以產(chǎn)孢，在溫度為26 ℃時(shí)，產(chǎn)孢量最高，24 ℃次之。說(shuō)明該病菌的菌絲生長(zhǎng)溫度條件高于分生孢子產(chǎn)生的條件，菌絲一旦生成，在較高和較低的溫度條件下，分生孢子均能產(chǎn)生，這可能是玉米小斑病病菌能在全世界玉米產(chǎn)區(qū)發(fā)生的原因之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)玉米小斑病病菌產(chǎn)孢量影響較大，在溫度為20、24 ℃的條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)時(shí)間為35 d內(nèi)，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)孢量越多。與前人研究結(jié)果[21]基本一致。

在高溫為35 ℃、低溫為4 ℃的條件下誘導(dǎo)，對(duì)玉米小斑病病菌產(chǎn)孢量均有一定的促進(jìn)作用，但經(jīng)過(guò)高、低溫誘導(dǎo)后產(chǎn)生的部分分生孢子一端連接1節(jié)分生孢子梗，對(duì)分生孢子的活性是否產(chǎn)生影響有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，光照條件對(duì)玉米小斑病病菌產(chǎn)孢量有一定的影響，適量的光照對(duì)該病菌產(chǎn)孢量有促進(jìn)作用，在12 h光照+12 h黑暗交替且光照度約為2 000 lx的條件下產(chǎn)孢量最多。與前人研究的光照能顯著抑制病菌產(chǎn)孢的結(jié)果[1]有一定出入，須進(jìn)一步通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證。

利用單因素組配確定促進(jìn)玉米小斑病病菌分生孢子產(chǎn)量增加的最佳組織培養(yǎng)基配方為100 g高粱、0.2 g硫酸鎂、0.2 g 磷酸鈉、15 g玉米葉的7號(hào)培養(yǎng)基;該培養(yǎng)基在溫度為24 ℃、光暗交替各12 h、光照度為2 000 lx的條件下，分生孢子產(chǎn)量最高;培養(yǎng)時(shí)間在35 d內(nèi)，培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)，產(chǎn)孢量越高。高溫為35 ℃、低溫為4 ℃誘導(dǎo)對(duì)玉米小斑病病菌產(chǎn)孢量均有一定的促進(jìn)作用，但誘導(dǎo)后產(chǎn)生的部分分生孢子形態(tài)發(fā)生改變。

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