宋勝男 郜玉鋼 張雪

摘要：采用同時(shí)測(cè)定20種人參皂苷的高效液相色譜（HPLC）法評(píng)價(jià)人參內(nèi)生多黏類(lèi)芽孢桿菌對(duì)農(nóng)田人參皂苷累積的影響，同時(shí)測(cè)定其對(duì)人參生長(zhǎng)勢(shì)和發(fā)病率的影響。結(jié)果表明，人參內(nèi)生多黏類(lèi)芽孢桿菌在噴施次數(shù)為5次時(shí)，人參根中20種皂苷含量之和可達(dá)1.549 2%，人參莖葉中20種皂苷含量之和可達(dá)到8.754 5%;人參內(nèi)生多黏類(lèi)芽孢桿菌噴施5次在促進(jìn)農(nóng)田人參皂苷含量增加的同時(shí)，對(duì)總株數(shù)、結(jié)果率、地上病情指數(shù)、地下病情指數(shù)、單株莖葉鮮質(zhì)量、單株根鮮質(zhì)量變化均具有正向影響，具體為地上病情指數(shù)、地下病情指數(shù)顯著降低，其余生長(zhǎng)指數(shù)顯著提高。表明人參內(nèi)生多黏類(lèi)芽孢桿菌對(duì)農(nóng)田人參生長(zhǎng)和皂苷累積起著促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：人參皂苷;生長(zhǎng)勢(shì);發(fā)病率;多黏類(lèi)芽孢桿菌;HPLC;皂苷積累

中圖分類(lèi)號(hào)： S567.5+10.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0155-06

人參（Panax ginseng C. A. Mey.）是五加科人參屬植物，通常所說(shuō)的人參是指其干燥根，人參是百草之王，具有多種藥理作用[1-2]，近年來(lái)隨著人們保健意識(shí)的增強(qiáng)和生活水平的提高，人參的需求量不斷增加，但由于國(guó)家天保工程的實(shí)施，嚴(yán)禁伐林栽參，致使園參的栽培數(shù)量急劇下降[3]。由于林下參及園參的價(jià)格相對(duì)較高，因此農(nóng)田栽參在人參資源中的比例逐年增加[4]。如何有效提高農(nóng)田人參的產(chǎn)品質(zhì)量及生物利用率成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點(diǎn)[5]。因此提高人參皂苷含量及產(chǎn)量，有效提高人參的品質(zhì)，使人參資源得到更加合理的開(kāi)發(fā)與利用成為重中之重。

人參的主要藥效成分為人參皂苷[6-7]，稀有人參皂苷具有良好的藥用價(jià)值[8-9]，其主要在微生物作用下產(chǎn)生[10-11]，人參中皂苷的種類(lèi)和含量是評(píng)價(jià)人參質(zhì)量的重要指標(biāo)，本研究所用的人參內(nèi)生多黏類(lèi)芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）分離獲得自人參植株，人參內(nèi)生多黏類(lèi)芽孢桿菌不僅在生物防治方面具有很好的應(yīng)用，而且在促進(jìn)人參生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化人參皂苷方面也有很好的作用，但未見(jiàn)人參內(nèi)生多黏類(lèi)芽孢桿菌在提高農(nóng)田人參皂苷含量方面的應(yīng)用報(bào)道。本研究利用人參內(nèi)生多黏類(lèi)芽孢桿菌作用農(nóng)田人參，旨在增加人參的皂苷含量，促進(jìn)人參生長(zhǎng)，提高人參質(zhì)量，進(jìn)而提升人參的藥用價(jià)值，為人參資源的可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑 對(duì)照品人參皂苷Rg1、Re、Rg2、Rg3、Rg5、Rf、F1、F2、Rc、Rd、Rb1、Rb2、Rb3、Rh2、Compound K、20（R）-Rh1、Rk3、Rh4、原人參三醇及原人參二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在98%以上，批號(hào)分別為201511、201523、201545、201506、201524、201537、201549、201521、201536、201579、201501、201551、201518、201543、201520、201515、201562、201571、201519、201513（吉林大學(xué)天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室）;人參內(nèi)生多黏類(lèi)芽孢桿菌來(lái)自筆者所在實(shí)驗(yàn)室，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通生物中心保存，保藏編號(hào)為CGMCC：No.7052;乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司）;純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 試驗(yàn)器材 LC-2010A高效液相色譜儀、AUY220電子分析天平（島津公司）;KQ-250DV超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 田間背景 試驗(yàn)在吉林省白山市靖宇縣進(jìn)行，選取三年生人參地，每個(gè)小區(qū)3 m2，每個(gè)處理4次重復(fù)，設(shè)空白對(duì)照小區(qū)，隨機(jī)排列，具體見(jiàn)表1。在人參展葉期后，對(duì)每個(gè)小區(qū)每次噴施150 mL濃度為106 CFU/mL的多黏類(lèi)芽孢桿菌，用噴霧器噴灑葉面和土壤，保證多黏類(lèi)芽孢桿菌均勻分布在人參葉面上，于秋季采集樣品，每個(gè)小區(qū)采集10株人參莖葉及其根。

1.2.2 人參內(nèi)生多黏類(lèi)芽孢桿菌對(duì)農(nóng)田人參生長(zhǎng)勢(shì)的影響 精密測(cè)量采回樣品的總株數(shù)、單株根鮮質(zhì)量、單株莖葉鮮質(zhì)量等指標(biāo);計(jì)算地上病情指數(shù)、結(jié)果率、地下病情指數(shù)。

1.2.3 人參內(nèi)生多黏類(lèi)芽孢桿菌對(duì)農(nóng)田人參皂苷含量的影響

1.2.3.1 樣品溶液的制備 精確稱取各組人參根及莖葉粉末0.5 g，分別置于10 mL離心管中，逐一加入色譜甲醇溶液5.0 mL，密封稱質(zhì)量，超聲提取45 min，靜置過(guò)夜，補(bǔ)足質(zhì)量，再次超聲提取45 min，5 000 r/min離心15 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，備用。

1.2.3.2 測(cè)定20種人參皂苷含量 以筆者所在實(shí)驗(yàn)室建立的高效液相色譜（HPLC）條件同時(shí)測(cè)定20種人參皂苷的含量[12]。即色譜柱為C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，流動(dòng)相乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～40.00 min，18.00%～21.00% A;40.00～42.00 min，21.00%～26.00% A;42.00～46.00 min，26.00%～32.00% A;46.00～66.00 min，32.00 %～33.80 % A;66.00～71.00 min，33.80%～38.00% A;71.00～77.70 min，38.00%～49.08% A;77.70～78.00 min，49.08%～49.10% A;78.00～82.00 min，49.10% A;82.00～83.00 min，49.10%～50.60% A;83.00～88.00 min，50.60%～59.60% A;88.00～89.80 min，59.60%～64.96% A;89.80～92.00 min，64.96%～65.00% A;92.00～97.00 min，65.00% A;97.00～102.00 min，65.00%～85.00% A;102.00～109.00 min，85.00% A;109.00～111.00 min，85.00%～18.00% A）;流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。