超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定鹽堿脅迫金銀花中3種內(nèi)源激素

李天雪 胡玉濤 韋笑

摘要：建立同時(shí)測(cè)定金銀花中水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）和茉莉酸（JA）的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法，并應(yīng)用于鹽堿脅迫下的金銀花分析。激素經(jīng)異丙醇/甲酸溶液（99/1，體積分?jǐn)?shù)）提取后，通過(guò)固相萃?。⊿PE）柱凈化。色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流動(dòng)相為0.1%甲酸溶 液- 乙腈;體積流量為0.4 mL/min;進(jìn)樣量為3 μL;質(zhì)譜采用電噴霧離子源負(fù)離子模式（ESI-），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）進(jìn)行測(cè)定。3種內(nèi)源激素具有良好的線性關(guān)系（R2≥0.998），最低定量限均為0.5 μg/L，穩(wěn)定性良好，提取回收率在 81.5%～93.8%之間，精密度的RSD值為2.7%～7.9%之間，該法快速可靠，可適用于其他植物中SA、ABA和JA的含量檢測(cè)。利用該方法測(cè)定鹽堿脅迫下金銀花中的3種內(nèi)源激素，比較分析它們?cè)邴}堿脅迫下的含量變化規(guī)律，為內(nèi)源激素對(duì)植物的逆境調(diào)控機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：金銀花;鹽堿脅迫;水楊酸;脫落酸;茉莉酸;定量;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類(lèi)號(hào)：S567.7+90.1?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）11-0229-05

江蘇省地處黃海之濱，沿海鹽堿灘涂面積達(dá)到 0.76萬(wàn)km2，引種經(jīng)濟(jì)型耐鹽植物，可更有效地開(kāi)發(fā)利用鹽堿灘涂土地資源。金銀花是一種能耐鹽堿、耐干旱的多年生灌木植物，此外，金銀花作為一種常用中藥，具有清熱解毒、涼風(fēng)散熱、保肝利膽等作用，因有較高的觀賞和藥用價(jià)值，是理想的鹽堿地經(jīng)濟(jì)植物[1]。鹽堿脅迫對(duì)作物產(chǎn)量、植物幼苗生理特性有顯著影響[2-6]，植物內(nèi)源激素作為信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)植物代謝以提高植物對(duì)逆境的抗性方面起著關(guān)鍵作用[7]，內(nèi)源激素主要有水楊酸（salicylic acid，SA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA），研究?jī)?nèi)源激素動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，可有助于金銀花抗逆境機(jī)制的研究，為金銀花在鹽堿灘涂的大面積種植提供一定的技術(shù)參考。

ABA是在高等植物中含量較高的植物激素，與種子休眠、幼苗生長(zhǎng)、葉子脫落、氣孔運(yùn)動(dòng)等都有著密切的關(guān)聯(lián)，同時(shí)也是主要的應(yīng)激激素，以調(diào)控植物的抗逆反應(yīng)[8-9]。SA和JA都是特定生育環(huán)境刺激下誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物激素，SA是植物生長(zhǎng)抑制劑，抑制頂端分生組織生長(zhǎng)，促進(jìn)側(cè)枝生長(zhǎng)，屬于一種重要的調(diào)控植物抗逆反應(yīng)的應(yīng)激激素，研究表明，鹽脅迫下，SA可促進(jìn)根莖生長(zhǎng)，增加植株的鮮質(zhì)量[10-11]。JA是參與植物抗性反應(yīng)的一種重要信號(hào)分子[12]，在調(diào)控植物種子萌發(fā)、胚胎發(fā)育、幼苗發(fā)育、果實(shí)成熟、葉片衰老等方面起著重要的作用，尤其在植物干旱、鹽脅迫等逆境脅迫應(yīng)答中作用更為明顯[13-15]。各種激素相互協(xié)同參與調(diào)控植物的生理過(guò)程，因此，同時(shí)測(cè)定SA、ABA和JA含量對(duì)金銀花植物生理、逆境發(fā)育和作物生產(chǎn)等領(lǐng)域的研究具有重要意義。

目前植物激素的檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫（ELISA）法[16-17]、毛細(xì)管電泳法[18-19]、電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)法[20]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法[21]、高效液相色譜（HPLC）法[22-25]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）法[8，26-29]。因超高效色譜分離技術(shù)的應(yīng)用，加上質(zhì)譜的精確性高、選擇性強(qiáng)，超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法被認(rèn)為是測(cè)定內(nèi)源植物激素最靈敏、可靠的方法[30]。本研究建立了UPLC-MS/MS法并用其同時(shí)檢測(cè)金銀花中SA、ABA和JA這3種內(nèi)源植物激素，并用于鹽堿脅迫下金銀花樣品的分析，研究結(jié)果將為植物內(nèi)源激素的合理開(kāi)發(fā)、金銀花的高效培育提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

安捷倫1290 Infinity LC-6460 QqQ三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有G4220A四元低壓梯度泵和MassHunter Version B.04.00工作站（美國(guó)安捷倫科技公司）;Oasis HLB SPE柱（規(guī)格3 cc/60 mg，美國(guó)沃特世公司）;Visiprep 24TM DL固相萃取儀（美國(guó)Supelco公司）;Eppendorf 5427 R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）;氮吹儀N-WVAPTM 112（美國(guó)Organomation公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品SA、ABA和內(nèi)標(biāo)阿魏酸由南通經(jīng)緯生物科技有限公司提供，JA購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，純度均≥99%;甲醇（Sigma公司）、乙腈（Merk公司）、甲酸（上海安譜公司）為色譜純;超純水經(jīng)過(guò)Milli-Q系統(tǒng)純化制備;其余試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器條件

色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流動(dòng)相為0.1%甲酸溶液-乙腈，梯度洗脫：0～3 min，10%～40%乙腈;3～6 min，40%～60%乙腈;6～8 min，60%～80%乙腈;系統(tǒng)平衡3 min;體積流量 0.4 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量3 μL。

質(zhì)譜采用電噴霧負(fù)離子源（ESI-源），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）;駐留時(shí)間為50 ms;檢測(cè)電壓：3.5 kV;離子源溫度：120 ℃;錐孔電壓：220 V;脫溶劑溫度：350 ℃;脫溶劑氣體（N2）體積流量：8 L/min;鞘氣流速：11 L/min。SA、ABA和JA檢測(cè)離子的質(zhì)核和碰撞電壓分別是質(zhì)荷比137→93，35 eV;質(zhì)荷比263→153，15 eV和質(zhì)荷比209→59，14 eV。MRM質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

1.3 樣品處理

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