張宏博 王 巖 郭 莉 范 鑫 阿拉坦朝格蘭 鄭玉山

內(nèi)蒙古自治區(qū)食品檢驗(yàn)檢測中心 內(nèi)蒙古呼和浩特 010090

近年來，隨著農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛使用，越來越多的科研人員將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了食品中農(nóng)藥的殘留上來[1]。郎爽、魏巖等人多次分析了噴灑了農(nóng)藥的農(nóng)業(yè)土地中含有殘留物質(zhì)所采用的研究方法，實(shí)驗(yàn)中所檢測的多種土質(zhì)中存在的相關(guān)農(nóng)藥的回收后都有很好的體現(xiàn)，該方法已經(jīng)在現(xiàn)實(shí)生活中使用[2]。蔣俊樹等人建立氣質(zhì)聯(lián)用法在同一時(shí)間檢測了茶類產(chǎn)品中所存留下的藥品，證實(shí)了其具有較高的靈敏度[3]。

惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ-666為農(nóng)業(yè)上較長見的殺菌藥品，可用于防治黃瓜、葡萄、櫻桃、蔬菜等植物，如霜霉病、枯萎病等，它也可用于治療不同類型的繼發(fā)疾病，如褐斑病和黑腐病等[4]。隨著農(nóng)藥在飼料中的大量使用，其在肉制品中的殘留也不可忽視[5]。隨著人們生活水平的提高，肉制品的品質(zhì)越來越受到人們的重視[6,7]。然而，大部分研究都集中于肉的理化品質(zhì)[8]和食用品質(zhì)[9,10]，對肉制品的安全品質(zhì)大多集中于肉的摻雜摻假[11]和獸藥殘留[12]，而對肉制品中的農(nóng)藥殘留的相關(guān)研究卻少之又少。

當(dāng)前，檢測食物中農(nóng)藥殘留技術(shù)陸續(xù)的被研究、擴(kuò)展和完善，一些高超的技術(shù)、新工藝也頻繁地被發(fā)明出來，例如，納米生物檢測技術(shù)、微流控技術(shù)、分子印跡檢測技術(shù)，但最廣泛使用的農(nóng)業(yè)藥品剩余物檢測技術(shù)是色譜檢測技術(shù)和生化檢測技術(shù)[13]。因此，本文在色譜檢測技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)部分檢測條件，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對肉制品中惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ-666四種較常見農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測，并與相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對比，最終優(yōu)化相關(guān)的檢測方法，為肉制品中農(nóng)藥殘留的檢測方法的開發(fā)提供一定的理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

樣品于2017年11月和2018年8月分別從內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特左旗和蘇尼特右旗采集，共采集6個(gè)蘇木/嘎查/村24只活羊。屠宰場屠宰后取背最長肌5 000g冷凍帶回儲存。

1.1.2 試劑

農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品：惡霜靈，濃度(ug/mL)99.5；三氯殺螨醇，濃度(ug/mL)99.0；生物芐呋菊酯，濃度(ug/mL)99.0；γ媚-666，濃度(ug/mL)98.6。農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品來源均為Dr.Ehrenstorfer GmbH，定容體積(mL)均為100。

輔助試劑：Acetonitrile，規(guī)格色譜純，來源Fisher公司；Sinchers提取鹽包，規(guī)格色譜純，來源Quechers Extract Pouch EN Method。

1.1.3 設(shè)備和耗材

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：絞肉機(jī)，型號GM200，廠家Retsch GobH；電子天平，型號ME204E，廠家梅特勒-托利多；高速離心機(jī)，型號Avanti J-26S XP，廠家BECKMAN COuLTER；氣相色譜儀，型號ISQ-LT，廠家Thermo ISQ-Trace 1300。

試驗(yàn)耗材：Sinchers固相萃取柱，規(guī)格900mg Na2SO4、150mg PSA、150mg C18、Cat.No:112-9669-153，品牌AnyBond安邦健合；色譜柱，規(guī)格0.25m×0.25mm×30m，品牌Agilent DB1701。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱量惡霜靈農(nóng)標(biāo)準(zhǔn)品0.01024g，三氯殺螨醇農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品0.01004g，生物芐呋菊酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品0.01027g，γ-666農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品0.01024g，用Acetonitrile作為定容試劑。

惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯、γ-666四種農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度如表1所示。

將這些儲備液按照一定的濃度混合成新的儲備液，將儲備液的瓶口用錫紙和封口膜封住放在溫度為4℃的冰箱中保存。

表1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

準(zhǔn)確的稱取Heptachlor epoxide試劑，然后用Acetonitrile溶解，放在100mL容量瓶中。內(nèi)標(biāo)溶液的配制如表2所示。

表2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

1.2.3 樣品前處理

精密稱取經(jīng)預(yù)處理的羊肉樣品1g于50mL離心管中，精密吸取400uL Heptachlor epoxide內(nèi)標(biāo)儲備液(35ug/mL)加入樣品中，加入10mL去離子水，搖晃使樣品充分溶解。然后加入10mL Acetonitrile，用旋渦機(jī)高速下旋渦2min，超聲波清洗機(jī)超聲20min。向離心管中加入sinchers酸性鹽包，劇烈振蕩，冷卻后5 000rpm高速離心5min，離心管中加入sinchers固相柱，按壓至Acetonitrile層全部進(jìn)入收集管中，過0.45um有機(jī)濾膜后進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.4 儀器條件

1.2.4.1 GC條件

色譜柱類型：超低流失毛細(xì)管色譜柱。

色譜柱型號：DB-1701。

柱膜厚：25cm。

柱內(nèi)徑：0.025cm。

柱長：3 000cm。

載氣類型：He。

載氣流速：1.2mL/min。

進(jìn)樣口的溫度為280℃，載氣為He，每次進(jìn)入1uL，不分流進(jìn)樣。

儀器程序升溫如表3所示。

表3 儀器程序升溫

1.2.4.2 MS條件

傳輸線溫度280℃，離子源溫度250℃，數(shù)據(jù)采集方式SIM。

定性方法：本實(shí)驗(yàn)利用保留時(shí)間結(jié)合利用美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院圖譜庫兩種方法協(xié)助定性。

表4 分析農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品所需的相關(guān)數(shù)據(jù)

定量方法：利用SIM對試樣進(jìn)行觀察，然后通過樣品校正后峰面積的大小與之前配制的標(biāo)準(zhǔn)濃度溶液的比值經(jīng)過儀器做出相關(guān)的數(shù)學(xué)關(guān)系圖，如果檢測的試樣中存在所要分析的目標(biāo)物質(zhì)而且其濃度也在國家所規(guī)定的濃度區(qū)間內(nèi)，就可以通過此種方法對目標(biāo)物質(zhì)按照其含量和濃度準(zhǔn)確的分析計(jì)算。

分析農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品所需的相關(guān)數(shù)據(jù)如表4所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率及線性范圍

本方案在更新了多種檢測條件后的惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ-666四種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及回收率

結(jié)果顯示，惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ媚-666四種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)系數(shù)均在回收率80%～120%區(qū)間內(nèi)，表明該檢測方法適合檢測這四種農(nóng)藥。

2.2 檢出限和精密度

本設(shè)計(jì)方案在更新了多種實(shí)驗(yàn)條件的性質(zhì)下分析了惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ媚-666四種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限和精密度(RSD)。其中，RSD是指用一模一樣檢測方法多次對同一種試樣中的所需物質(zhì)進(jìn)行檢測，經(jīng)過重復(fù)檢測后復(fù)現(xiàn)性的頻率，RSD越小精密度越高。

因?yàn)樗獧z出物質(zhì)的存在量是非常小的，所以本方案以可檢出的限量為GC-MS法的評價(jià)規(guī)定，可檢出物質(zhì)的量是所要檢測的物質(zhì)，由電信號轉(zhuǎn)換成譜圖后的峰面積的高度與通過噪聲檢測出的電信號轉(zhuǎn)換的峰的高度之比如果>3，則說明所要檢測的物質(zhì)有一定量的測出，如表6所示。

表6 樣品檢測結(jié)果

圖1 Oxadixyl標(biāo)準(zhǔn)譜圖 RT：29.81min

圖2 Dicofol標(biāo)準(zhǔn)譜圖 RT：21.49min

圖3 Bioresmethrin標(biāo)準(zhǔn)譜圖 RT：27.66min

圖4 γ-666標(biāo)準(zhǔn)譜圖 RT：17.88min

結(jié)果顯示，蘇尼特羊肉中惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ媚-666的檢出限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)檢出限，符合標(biāo)準(zhǔn)要求，即算作沒有農(nóng)藥殘留被檢測出來。四種農(nóng)藥的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在個(gè)規(guī)定區(qū)間內(nèi)，該檢測的準(zhǔn)確度好，顯示該研究方法對此實(shí)驗(yàn)適用。

2.3 氣相色譜的條件分析

優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件有色譜柱的進(jìn)樣量、樣品進(jìn)入儀器的方式、樣品進(jìn)樣式所需的溫度以及溫度不斷升高時(shí)的速率。

2.3.1 色譜進(jìn)樣方式

試驗(yàn)肉樣中實(shí)際上是含有極少藥品存留下來的，如果把樣品通過多個(gè)通道進(jìn)入到儀器中，一多半待檢測的物質(zhì)在進(jìn)入儀器時(shí)會被儀器感受不到，靈敏度可能會下降很多，所以采取讓樣品從同一個(gè)通道進(jìn)入儀器中，進(jìn)入的時(shí)間為1.5min。

2.3.2 柱流量的優(yōu)化

樣品產(chǎn)生的譜圖的峰形狀會受到樣品在進(jìn)入到色譜柱后不同速度的流速影響，如果進(jìn)入時(shí)的速度很小就會導(dǎo)致譜圖上峰變成又低又寬的樣子，如果速度太大又會造成柱中原來固定存在的物質(zhì)被沖流走，這些都是造成儀器對樣品分離時(shí)的影響因素，本實(shí)驗(yàn)采用的柱中樣品的流速為1.2mL/min。

2.3.3 進(jìn)樣口溫度

樣品通過進(jìn)樣口進(jìn)入時(shí)的溫度既要使樣品中所要檢測的物質(zhì)在這個(gè)溫度可以沸騰氣化又要使送樣品進(jìn)入的柱子不能在這個(gè)溫度下發(fā)生變化。以惡霜靈為例，以250℃為最開始的溫度，逐步升高10℃，分析其相對應(yīng)數(shù)值的變化，依據(jù)數(shù)值在其中挑選出最好的進(jìn)樣溫度，本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)樣溫度為280℃。

表7 進(jìn)樣口溫度與響應(yīng)值

2.3.4 進(jìn)樣體積

襯管可以控制樣品進(jìn)入儀器量的多少，進(jìn)入量太大時(shí)，樣品發(fā)生汽化后的體積就會超過襯管固定的容納量，因此會使所要檢測的主要物質(zhì)發(fā)生流失，而且樣品如果進(jìn)入儀器太多會給色譜柱增加太大的負(fù)擔(dān)，給實(shí)驗(yàn)帶來不良后果。進(jìn)入的體積比正常的少時(shí)，則所要檢測的物質(zhì)的絕對進(jìn)入量要比原來小很多，實(shí)驗(yàn)的檢出范圍就會受到一定的影響。本實(shí)驗(yàn)的樣品進(jìn)入儀器的體積為1uL。

2.3.5 升溫速度

儀器中所設(shè)置的溫度上升裝置是非常有利于所要檢測的物質(zhì)進(jìn)行全部分離，不一樣的速度下升高溫度對檢測的試樣也有大不相同的分離能力。依據(jù)所要檢測試樣的性質(zhì)不同，對溫度進(jìn)行設(shè)置時(shí)要參考其分離度和信噪比。本設(shè)計(jì)的最后加熱程序是，柱的溫度首先是40℃，保持時(shí)間是60s，30℃/min的溫度被加熱到130℃，然后在5℃/min加熱至250℃，最后從10℃/min升溫至270℃，持續(xù)時(shí)間300s。

2.3.6 色譜柱

食品中藥品殘留的檢測經(jīng)常采用的毛細(xì)管色譜柱有兩種型號(DB-5MS和DB-1701)，為了使實(shí)驗(yàn)不受色譜柱因素控制，選用新的DB-1701型號為本方案的檢測柱。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

對所研究的這幾種藥品的標(biāo)準(zhǔn)液體進(jìn)行掃描，獲得這幾種藥品的圖譜。然后采用選擇性離子監(jiān)測模型篩選這四種藥品的特征離子，然后對試樣檢測研究。

2.4.1 定性分析

實(shí)驗(yàn)的定性分析遵循兩條原則：一是試樣在圖譜上出現(xiàn)峰的時(shí)間與藥品標(biāo)準(zhǔn)品峰出現(xiàn)的時(shí)間共同在所規(guī)定的檢測區(qū)間內(nèi)；二是所檢測的離子都可以被檢出而且對離子定性和定量分析后的豐度比不超出所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間。

2.4.2 定量方式

定量方式包括外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法，外標(biāo)法有非常廣泛的使用范圍，但由于樣品在自動(dòng)進(jìn)入檢測儀器的時(shí)候會出現(xiàn)一系列不穩(wěn)定反應(yīng)，因此造成實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果出現(xiàn)偏差，所以采用內(nèi)標(biāo)法定量。

內(nèi)標(biāo)法最重要的就是內(nèi)部標(biāo)記物，在對內(nèi)部標(biāo)記物進(jìn)行選擇時(shí)，要考慮實(shí)驗(yàn)設(shè)備是否對內(nèi)部標(biāo)記物靈敏，內(nèi)部標(biāo)記物是否對實(shí)驗(yàn)設(shè)備有較好的反應(yīng)，內(nèi)部標(biāo)記物的色譜峰需和樣品的色譜峰分開，而且內(nèi)部標(biāo)記物的出峰時(shí)間要和待檢測的物品的出峰時(shí)間相接近，內(nèi)部標(biāo)記物要與目標(biāo)物的化學(xué)性質(zhì)類似，內(nèi)部標(biāo)記物與色譜柱里的固定相發(fā)生有關(guān)反應(yīng)。本次使用環(huán)氧七氯作為內(nèi)部標(biāo)記物。

3 結(jié)論

通過使用超低流失毛細(xì)管色譜柱，調(diào)節(jié)進(jìn)樣口的溫度為280℃，載氣He每次進(jìn)入1uL且不分流進(jìn)樣。MS傳輸線溫度為280℃、離子源溫度為250℃、數(shù)據(jù)采集方式為SIM可以實(shí)現(xiàn)對羊肉進(jìn)行農(nóng)藥惡霜靈、三氯殺螨醇、生物芐呋菊酯和γ-666的精確測定。