土霉素脅迫下小白菜種子萌發(fā)對(duì)橡膠廢水沼液的響應(yīng)

傅悅 趙媛媛 俞花美 閆聰聰 馬瑞陽(yáng) 蘇帆 葛成軍

摘 ?要 ?為認(rèn)識(shí)橡膠廢水沼液中外源溶解性有機(jī)物（dissolved organic matter，DOM）對(duì)抗生素污染生物效應(yīng)的影響，本文采用水培和土培兩種方法研究土霉素（oxytetracycline，OTC）對(duì)小白菜種子的萌發(fā)效應(yīng)，在此基礎(chǔ)上探討外源DOM輸入后土霉素對(duì)小白菜發(fā)芽率和胚根、芽伸長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：（1）水培中DOM促進(jìn)種子萌發(fā)，土培中抑制萌發(fā);土霉素在水培0～50 mg/L、土培0～100 mg/kg脅迫下小白菜種子發(fā)芽率影響差異不顯著;（2）在水培中，外源土霉素濃度與小白菜的胚根、芽長(zhǎng)抑制率之間均呈顯著正相關(guān)性;在土培中，外源性土霉素濃度與小白菜的胚根、芽長(zhǎng)抑制率呈顯著負(fù)相關(guān)性;（3）在水培和土培中，與對(duì)照組相比，DOM對(duì)小白菜的胚根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)均起促進(jìn)作用，水培促進(jìn)率最高達(dá)55.05%，土培促進(jìn)率最高達(dá)27.46%;（4）水培條件下，土霉素與DOM共存時(shí)對(duì)小白菜胚根伸長(zhǎng)的抑制作用更明顯;土培條件下，土霉素與DOM共存時(shí)，低濃度的DOM促進(jìn)小白菜的胚根伸長(zhǎng)，隨著濃度的升高，促進(jìn)作用下降。

關(guān)鍵詞 ?土霉素;DOM;小白菜;種子萌發(fā);發(fā)芽率

中圖分類(lèi)號(hào) ?S19 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

Abstract ?In order to understand the effects of exogenous DOM on the biological effects of antibiotic contamination， the effects of oxytetracycline （OTC） on the germination of Chinese cabbage seeds were studied by two methods： hydroponics and soil cultivation. The effects of oxytetracycline on germination rate， elongation of cabbage after exogenous DOM input were discussed also. DOM promoted seed germination in hydroponics and inhibited seed germination in soil culture. Oxytetracycline had no significant effect on seed germination rate under 050 mg/L and 0100 mg/kg of soil cultivation. In hydroponics the concentration of exogenous oxytetracycline was positively correlated with the inhibition rate of radicle and bud length of cabbage， while in soil cultivation， the concentration of exogenous oxytetracycline was negatively correlated with the inhibition rate of radicle and bud length of cabbage. Compared with the control group， DOM could promote the radicle and bud elongation of cabbage in hydroponics and soil cultivation， with the highest promotion rate of 55.05% and 27.46%. The inhibitory effect of oxytetracycline and DOM on the elongation of cabbage was more obvious under hydroponics. Under soil cultivation， when oxytetracycline co-existed with DOM， low concentration of DOM promoted radicle elongation of cabbage， and the promotion effect decreased with the increase of concentration.

Keywords ?oxytetracycline; DOM; cabbage; seed germination; germination rate

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.06.026

抗生素作為20世紀(jì)的偉大發(fā)現(xiàn)，一方面對(duì)人類(lèi)的發(fā)展起到了深遠(yuǎn)的影響，另一方面抗生素的大量使用會(huì)給環(huán)境帶來(lái)負(fù)面影響?？股乇淮罅康剡\(yùn)用到畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中。研究表明，進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)的抗生素利用率極低，約有25%～90%的抗生素隨著糞便和尿液以原藥形式被排出體外，通過(guò)糞肥的施用和污水的灌溉進(jìn)入土壤和水體等生態(tài)環(huán)境中并長(zhǎng)期存留[1-4]。土壤中的抗生素可被植物吸收，特別是土霉素（oxytetra-cycline，OTC）極易在植物體富集，并通過(guò)食物鏈對(duì)人類(lèi)的健康產(chǎn)生危害[5]。

溶解性有機(jī)物（dissolved organic matter，DOM）通常定義為可以溶解于水、酸或堿溶液的有機(jī)物。在生態(tài)系統(tǒng)中，它主要來(lái)源于土壤腐殖質(zhì)、植物凋落物、根系分泌物以及土壤或水體中微生物的殘?bào)w[6-8]。DOM對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)的形成起著不可或缺的作用，能被土壤吸附，可以有效降低土壤對(duì)抗生素的吸附能力，增強(qiáng)土壤系統(tǒng)的耐受性，并與各種污染物相互作用，減輕污染物的毒性，影響遷移率，降低生物有效性[9-11]。DOM可減輕土壤中Phe的生態(tài)毒性[12]，一定范圍內(nèi)的DOM能抑制氟氯氰菊酯的毒性[13];同時(shí)也有相反研究表明DOM能促進(jìn)污染物生物有效性[14]。

就國(guó)內(nèi)來(lái)說(shuō)，沼液還田是目前最簡(jiǎn)單也是使用最多的方式，它能夠有效提高土壤肥力，改變土壤微生物環(huán)境，增加農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量[15-16]。目前天然橡膠廢水沼液處理成本較高，出水不達(dá)標(biāo)的情況較普遍，而海南作為全國(guó)最大的天然橡膠生產(chǎn)基地，橡膠廢水的資源化利用就顯得尤為重要，有研究表明橡膠廢水的施用對(duì)蔬菜產(chǎn)量和農(nóng)作物生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用[17-18]。海南島本地畜禽資源豐富，文昌雞、臨高豬、東山羊等受到廣大消費(fèi)者喜愛(ài)，當(dāng)?shù)赜糜谛笄莸目股厥褂昧枯^大。目前溶解性有機(jī)物對(duì)抗生素影響的研究中選用養(yǎng)殖場(chǎng)沼液的較多，選用天然橡膠廢水沼液作為溶解性有機(jī)物的研究尚罕見(jiàn)報(bào)道。

本文選用小白菜作為供試作物，通過(guò)土培和水培實(shí)驗(yàn)研究外源橡膠廢水沼液DOM和土霉素輸入土壤后對(duì)小白菜種子萌發(fā)的影響，并對(duì)比土霉素脅迫下輸入不同量的DOM對(duì)小白菜的根與芽伸長(zhǎng)的影響效應(yīng)，研究土霉素對(duì)小白菜的植物毒性，以期對(duì)熱帶地區(qū)橡膠廢水沼液生態(tài)資源化利用提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試土壤為磚紅壤，采自海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院基地農(nóng)田表層土壤（0～20 cm），土樣自然風(fēng)干后，過(guò)2 mm尼龍篩。供試土壤基本理化性質(zhì)：pH為5.31，全氮、全磷、全鉀和有機(jī)質(zhì)的含量分別為4.21%、0.15%、0.76%和2.98%。

供試作物小白菜（Brassica rapa var. glabra），品種為揭農(nóng)三號(hào)甜白菜，產(chǎn)地為廣東省揭陽(yáng)市，培育單位為保豐種子商行。在實(shí)驗(yàn)前，用蒸餾水浸泡8 h，除去浮于水面的種子，瀝干水分后備用。

供試抗生素選用土霉素，純度98%，購(gòu)自Adamas公司。

溶解性有機(jī)物（DOM）前驅(qū)物來(lái)源于海南省儋州市某橡膠加工廠廢水，該加工廠天然橡膠廢水的處理流程為：酸凝槽出水——調(diào)節(jié)池——一級(jí)厭氧池——二級(jí)厭氧池（厭氧UASB池）——一級(jí)好氧池——二級(jí)好氧池——脫氧除磷池——混凝沉淀池——清水池，采集廢水的水樣來(lái)自清水池的好氧終水，其溶解性有機(jī)碳的濃度為128.5 mg/L。發(fā)芽率實(shí)驗(yàn)在受控智能人工氣候培養(yǎng)箱（杭州錢(qián)江ZRX-300）中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)用水由Spring-S60i+PALL超純水系統(tǒng)制備。

1.2 ?方法

1.2.1 ?水培 ?每個(gè)培養(yǎng)皿中添加量均為10 mL水溶液，培養(yǎng)皿底部鋪上2層濾紙。DOM添加量為1、3、5 mL，土霉素濃度梯度設(shè)置為0、10、20、30、40、50 mg/L，處理分別為：對(duì)照（CK），添加不同量DOM，添加不同濃度梯度土霉素，添加30 mg/L土霉素+不同量DOM。

1.2.2 ?土培 ?稱(chēng)取50 g的風(fēng)干土壤于培養(yǎng)皿中，DOM添加量為1、3、5 mL，土霉素濃度梯度設(shè)置為0、5、10、25、50、100 mg/kg，用去離子水調(diào)節(jié)土壤最大持水量的60%左右。處理分別為：對(duì)照（CK），添加不同量DOM，添加不同濃度梯度土霉素，添加50 mg/kg土霉素+不同量DOM。

2種培養(yǎng)方式均選取20粒籽粒飽滿(mǎn)、大小一致的小白菜種子，均勻地?cái)[放于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)7 d，對(duì)芽長(zhǎng)大于2 mm的小白菜幼苗進(jìn)行測(cè)量。實(shí)驗(yàn)共設(shè)24個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)平行，置于25?℃人工氣候培養(yǎng)箱暗處培養(yǎng)，定期觀察小白菜的生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)期間定期補(bǔ)充損失的水分。

1.2.3 ?測(cè)定項(xiàng)目 ?選取發(fā)芽率、胚根生長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)及其抑制率作為測(cè)定指標(biāo)。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件和SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、繪圖以及回歸分析。統(tǒng)計(jì)方法采用Pearson相關(guān)分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?DOM對(duì)土霉素脅迫下小白菜發(fā)芽率的影響

水培中，白菜種子在濃度10～50 mg/L的土霉素脅迫下，均呈現(xiàn)不同程度的促進(jìn)作用，其發(fā)芽率在70%～85%之間波動(dòng)，發(fā)芽率與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）。土培與水培的結(jié)果相似（圖1），小白菜種子萌發(fā)受到不同程度的促進(jìn)作用，在土霉素濃度為50 mg/kg時(shí)，發(fā)芽的數(shù)量最高，但差異未達(dá)顯著水平（P>0.05）。

由圖2可知，在水培中，與對(duì)照組相比，添加土霉素的DOM處理（P>0.05）和純DOM的處理（P>0.05）均對(duì)種子的萌發(fā)起到促進(jìn)的作用。隨著施入DOM量的增多，促進(jìn)效果反而降低。在土霉素脅迫的處理中，DOM添加量的多與少對(duì)小白菜的發(fā)芽率影響不明顯。土霉素脅迫下的DOM處理對(duì)小白菜的促進(jìn)作用略低于純DOM處理的促進(jìn)作用，說(shuō)明土霉素對(duì)小白菜種子的發(fā)芽

A：水培;B：土培。

起到了一定的抑制作用。而土培條件下，DOM對(duì)種子萌發(fā)起到了抑制的作用，且抑制效應(yīng)隨DOM量增加而明顯。土霉素脅迫下的DOM處理（P>0.05）和純DOM（P<0.01）處理下小白菜的發(fā)芽率則呈現(xiàn)出相反趨勢(shì)。土霉素脅迫下的DOM處理的發(fā)芽率，隨著DOM添加量的增多，其抑制效果減弱。在土培條件下，純DOM處理抑制萌發(fā)，在添加土霉素后緩解了抑制作用。

2.2 ?DOM對(duì)土霉素脅迫下小白菜芽伸長(zhǎng)的影響

2.2.1 ?不同濃度的土霉素對(duì)小白菜芽伸長(zhǎng)的影響 ?水培中不同濃度的土霉素對(duì)小白菜芽伸長(zhǎng)的影響如圖3所示。從圖中可以看到，當(dāng)土霉素濃度為10～50 mg/L時(shí)，芽長(zhǎng)的抑制率均為正值，表明小白菜的芽伸長(zhǎng)受到土霉素的抑制作用，抑制效應(yīng)隨著濃度的增大而增強(qiáng)。與對(duì)照組相比，土霉素濃度和小白菜的芽伸長(zhǎng)呈顯著的線(xiàn)性相關(guān)性（P<0.05）。在土培中，加入土霉素后，其芽長(zhǎng)的增長(zhǎng)趨勢(shì)與水培完全相反。施入5 mg/kg的土霉素，小白菜的芽長(zhǎng)與對(duì)照組相一致。隨著土霉素濃度的增高，芽長(zhǎng)抑制率變?yōu)樨?fù)值，說(shuō)明土霉素對(duì)芽增長(zhǎng)起到了促進(jìn)的作用。土霉素濃度為5～100 mg/kg時(shí)，其曲線(xiàn)先下降后回升，在土霉素為50 mg/kg時(shí)，其促進(jìn)的效果達(dá)到最強(qiáng)。在土壤中，不同的土霉素濃度對(duì)小白菜的芽伸長(zhǎng)的影響達(dá)到顯著性差異（P<0.05）。

2.2.2 土霉素脅迫下DOM對(duì)小白菜芽伸長(zhǎng)的影響 ?純DOM處理下的小白菜芽長(zhǎng)抑制率為負(fù)值（圖4）。在水培中，純DOM處理促進(jìn)小白菜的芽伸長(zhǎng)，DOM添加量為0～1 mL時(shí)，對(duì)小白菜種子的芽伸長(zhǎng)有輕微的抑制作用;隨著添加量的增多，則從抑制轉(zhuǎn)為促進(jìn)，且促進(jìn)的作用隨著添加量的增多而增強(qiáng)。從圖中可以看到，土霉素脅迫下的DOM處理的芽伸長(zhǎng)趨勢(shì)與純DOM處理的培養(yǎng)結(jié)果大致相同，在添加土霉素的處理中加入DOM后，芽長(zhǎng)抑制率由正值轉(zhuǎn)為負(fù)值。通過(guò)觀察純DOM處理與DOM+土霉素處理的結(jié)果可知，在水溶液中，DOM能夠有效緩解土霉素的脅迫，促進(jìn)芽的伸長(zhǎng)。在土培中，添加1～3 mL的DOM會(huì)對(duì)芽伸長(zhǎng)起到促進(jìn)的作用，且添加量越多，促進(jìn)效果越明顯。加入土霉素之后，芽伸長(zhǎng)出現(xiàn)了相

A：水培;B：土培。

反態(tài)勢(shì)，DOM添加量為1～3 mL，其芽長(zhǎng)抑制率為負(fù)值;添加量為3～5 mL，其芽長(zhǎng)抑制率為正值，說(shuō)明DOM抑制了芽長(zhǎng)的增長(zhǎng)。DOM添加量為0～1 mL時(shí)，對(duì)芽伸長(zhǎng)起到了促進(jìn)的作用;添入量為1～3 mL，促進(jìn)效果減弱，DOM添加量為3 mL時(shí)，其芽長(zhǎng)抑制率基本與對(duì)照組持平;施入量為3～5 mL時(shí)，出現(xiàn)明顯的抑制作用。通過(guò)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)土壤中土霉素脅迫下DOM對(duì)小白菜芽伸長(zhǎng)的作用與水溶液中不一致。

以小白菜的芽長(zhǎng)抑制率對(duì)土霉素濃度、DOM添加量以及DOM與土霉素共存時(shí)DOM添加量進(jìn)行回歸分析，由表1可見(jiàn)，在水培和土培中，土霉素濃度、DOM添加量與芽伸長(zhǎng)呈對(duì)數(shù)相關(guān)，DOM與土霉素共存時(shí)DOM添加量與芽伸長(zhǎng)呈線(xiàn)性相關(guān)。在3種處理?xiàng)l件下，水培中芽的抑制率的相關(guān)性均高于在土培中。2.3.1 ?土霉素濃度對(duì)小白菜胚根生長(zhǎng)的影響 ?水培中不同濃度的土霉素對(duì)小白菜胚根生長(zhǎng)的影響如圖5所示。在土霉素濃度10～50 mg/L，芽長(zhǎng)的抑制率均為正值且在40%～60%之間波動(dòng)，表明土霉素對(duì)小白菜的根生長(zhǎng)起到抑制的作用，抑制效應(yīng)隨著濃度的增大而增強(qiáng)，土霉素濃度與胚根長(zhǎng)呈顯著性相關(guān)（P<0.05）。在土培中，胚根長(zhǎng)抑制率呈負(fù)值，說(shuō)明土霉素對(duì)胚根長(zhǎng)起到了促進(jìn)的作用，其促進(jìn)作用是先增強(qiáng)后減弱，在土霉素為5～50 mg/kg時(shí)，其促進(jìn)作用隨著土霉素濃度增大而增強(qiáng)（P<0.05），在50 mg/kg處理下達(dá)到最大值，土霉素濃度為50～100 mg/kg時(shí)，其促進(jìn)作用減弱。在土培中，小白菜的胚根生長(zhǎng)的效應(yīng)與芽長(zhǎng)相一致。

2.3.2 DOM對(duì)土霉素脅迫下的小白菜胚根長(zhǎng)抑制率的影響 ?在水培條件下，純DOM處理的胚根長(zhǎng)抑制率為負(fù)且呈上升趨勢(shì)，表明DOM對(duì)胚根生長(zhǎng)起到促進(jìn)的作用。從圖6可以看出，隨著DOM量的增加，對(duì)胚根生長(zhǎng)促進(jìn)的效果減弱。施入土霉素后，與DOM共同作用下胚根長(zhǎng)抑制率為正值，說(shuō)明小白菜的胚根長(zhǎng)受到了明顯的抑制。在土霉素脅迫下的處理中，施加DOM的處理與不加DOM的處理相比，隨著DOM添加量的增加，加重對(duì)小白菜胚根生長(zhǎng)的抑制作用。土培條件下，小白菜在純DOM處理下與在土霉素脅迫處理下的胚根生長(zhǎng)抑制率均為負(fù)值，說(shuō)明小白菜胚根長(zhǎng)均在兩種處理中受到了促進(jìn)作用。純DOM處理的抑制率曲線(xiàn)呈上升趨勢(shì)，隨著量的增加，其促進(jìn)作用減弱。在土霉素脅迫下的處理中添加DOM，DOM的促進(jìn)效應(yīng)呈現(xiàn)出先增強(qiáng)后減弱的現(xiàn)象，在DOM添加量為0～1 mL時(shí)，其促進(jìn)效應(yīng)優(yōu)于對(duì)照組;DOM添加量為1～5 mL時(shí)，促進(jìn)效應(yīng)弱于對(duì)照組。由圖6可知，在土霉素與DOM共同作用下，其DOM添加量越高，其促進(jìn)效果越弱。

A：水培;B：土培。

以小白菜的胚根長(zhǎng)抑制率對(duì)土霉素濃度、DOM添加量以及DOM與土霉素共存時(shí)DOM添加量進(jìn)行回歸分析，由表2可見(jiàn)，在水培和土培中，土霉素、DOM與芽伸長(zhǎng)呈對(duì)數(shù)相關(guān)，DOM與土霉素共存時(shí)呈線(xiàn)性相關(guān)。在水培中，土霉素對(duì)芽長(zhǎng)的IC50為1168.691 mg/L，胚根長(zhǎng)的IC50為26.9 mg/L，芽伸長(zhǎng)的IC50明顯大于胚根生長(zhǎng)，說(shuō)明芽對(duì)土霉素的耐受性更強(qiáng)，根對(duì)土霉素敏感性更大。

3 ?討論

前人研究普遍表明土霉素會(huì)抑制植物芽、根的伸長(zhǎng)，DOM能夠有效降低生物的有效性[1-3， 15， 19]。本研究中，土霉素對(duì)小白菜的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響，其發(fā)芽率的結(jié)果與安靖等[19]研究結(jié)果相一致。在水培中，土霉素對(duì)小白菜的芽伸長(zhǎng)和胚根生長(zhǎng)均表現(xiàn)出抑制作用，濃度越高，抑制效果越強(qiáng);在土壤中，胚根生長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)均呈現(xiàn)先促進(jìn)后促進(jìn)減弱的現(xiàn)象，造成這一趨勢(shì)的原因可能是因?yàn)橥寥谰哂幸欢ǖ奈侥芰σ约熬彌_的作用，削弱了土霉素對(duì)小白菜芽、胚根長(zhǎng)的抑制作用。在0～100 mg/kg的土霉素濃度處理下未對(duì)小白菜的胚根生長(zhǎng)、芽伸長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，可能由于當(dāng)前土培所設(shè)最高土霉素濃度未達(dá)到脅迫小白菜胚根生長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)的濃度。在水培和土培中，純DOM的處理能夠有效促進(jìn)小白菜的胚根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)。但是在土霉素脅迫下施加DOM的處理，與只有土霉素的處理相比，DOM對(duì)小白菜的芽、根抑制率，在土培和水培中胚根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)呈現(xiàn)出完全相反的兩種情況。在水培中，土霉素脅迫下加入不同量的DOM，DOM對(duì)芽起促進(jìn)作用，對(duì)根起抑制作用;在土壤中，土霉素脅迫下加入不同量的DOM，DOM對(duì)芽起到抑制作用，對(duì)根產(chǎn)生先促進(jìn)后抑制的作用。但DOM對(duì)植物生長(zhǎng)、發(fā)育所起到的作用還有待進(jìn)一步探討。有文獻(xiàn)表明DOM會(huì)影響抗生素在土壤上的吸附行為，一般認(rèn)為DOM會(huì)通過(guò)增加土壤中有機(jī)C的濃度、暴露出極性官能團(tuán)、與抗生素競(jìng)爭(zhēng)吸附點(diǎn)位使得吸附容量增大，但是也有其他研究表明DOM會(huì)降低抗生素、農(nóng)藥在土壤中的吸附，如Yaron Drori的研究中提到DOM能改變?cè)瓉?lái)土壤的有機(jī)質(zhì)性質(zhì)，降低土壤對(duì)抗生素的吸附作用[20-22]。Song等[23]發(fā)現(xiàn)DOM提高了除草劑對(duì)小麥的毒性，認(rèn)為是DOM的配位體與除草劑結(jié)合，提高了除草劑的生物有效性。所以橡膠廢水DOM對(duì)土霉素脅迫下的生物有效性促進(jìn)或抑制的原因需要考慮土壤中土霉素的吸附解吸行為、土霉素的疏水性成分、DOM配位體與土霉素的結(jié)合以及DOM的濃度、分子大小等[14， 24-25]，其促進(jìn)或抑制的濃度閾值點(diǎn)尚待于進(jìn)一步的研究。

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