徐璐寧，王宇洋，薛彬冰，梅榮武，張 宇，丁林賢，蘇曉梅?

(1 浙江師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 浙江 金華 321000； 2 浙江省環(huán)境保護(hù)科學(xué)設(shè)計(jì)研究院工程研究中心， 杭州 310007)

高氨氮廢水的治理成為污水處理領(lǐng)域亟待解決的一個(gè)難題。隨著石油化工、制藥、建材、農(nóng)藥、造紙、煤氣、電子、紡織、染料、塑料和焦化等工業(yè)的迅速發(fā)展，高氨氮廢水排放量急劇增加，逐漸成為當(dāng)前水體的主要污染源之一。高氨氮廢水的成分非常復(fù)雜，一旦排入水體中，不僅造成水體的富營(yíng)養(yǎng)化，水生環(huán)境的惡化，同時(shí)也對(duì)人體健康造成嚴(yán)重危害。近年來(lái)，高氨氮廢水的生物處理被認(rèn)為是廢水脫氮最具發(fā)展前景的方法之一，傳統(tǒng)的生物脫氮是通過硝化、反硝化作用將有機(jī)氮、氨氮經(jīng)過一系列反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氮?dú)鈴乃腥コ倪^程。其中反硝化是脫氮中較為關(guān)鍵的一步，反硝化菌種在有氧條件下會(huì)優(yōu)先利用氧進(jìn)行呼吸，阻止硝酸鹽和亞硝酸鹽作為最終的電子受體，同時(shí)氧分子也對(duì)反硝化還原酶產(chǎn)生抑制作用[1]，從而反硝化反應(yīng)一直認(rèn)為是嚴(yán)格厭氧的過程。但是硝化是需氧的過程，因此傳統(tǒng)生物脫氮的過程通常是在兩個(gè)反應(yīng)池中進(jìn)行而且反硝化反應(yīng)單元需要嚴(yán)格厭氧，因此大大增加了污水處理的成本和技術(shù)難度。在20世紀(jì)80年代，Robertson和Knenen[2]報(bào)道好氧反硝化菌以及好氧反硝化酶系為解決上述問題提供了新的思路。好氧反硝化菌可直接利用硝化產(chǎn)物作為反硝化底物，不但提高脫氮效率，同時(shí)也降低運(yùn)行成本。迄今為止，對(duì)高氨氮廢水生物處理系統(tǒng)中好氧反硝化菌種的篩選與培養(yǎng)僅基于常規(guī)分離培養(yǎng)方法，但其最高僅能獲得10%的微生物菌群，大量的潛在功能菌群因處于活的但非可培養(yǎng)(viable but non-culturable，VBNC)狀態(tài)而未被研究[3-5]。因此復(fù)蘇培養(yǎng)作為絕大部分微生物資源的VBNC菌群，可為尋找高效脫氮微生物資源提供新的途徑，同時(shí)也可為防止脫氮菌進(jìn)入VBNC狀態(tài)以發(fā)揮更好的脫氮性能提供新的思路。

藤黃球菌(Micrococcusluteus)所分泌的復(fù)蘇促進(jìn)因子(resuscitation-promoting factor，Rpf)的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是復(fù)蘇培養(yǎng)VBNC狀態(tài)菌最重要的突破。Rpf在皮摩爾濃度下即可使自身處于VBNC狀態(tài)的細(xì)胞復(fù)活，并使可培養(yǎng)數(shù)量增長(zhǎng)至100倍以上，且可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)[6]。研究發(fā)現(xiàn)制藥廢水中對(duì)Rpf敏感的VBNC優(yōu)勢(shì)菌群主要有革蘭氏陽(yáng)性(G+)菌如Microbacterium、Gordonia和Leucobacter屬等，及革蘭氏陰性(G-)菌如Candidimonas、Xanthobacter和Aminobacter屬等。另外，我們前期利用藤黃球菌Rpf從森林、海島、沙漠土壤、城市和富營(yíng)養(yǎng)化污水，以及印染、制藥、農(nóng)藥和焦化廢水等樣品中復(fù)蘇培養(yǎng)VBNC菌近60多屬100余種，并已登陸至國(guó)際基因庫(kù)DDBJ。而且經(jīng)后期研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Rpf蛋白不僅對(duì)親緣關(guān)系較近的革蘭氏陽(yáng)性(G+)菌有較好的復(fù)蘇促進(jìn)功能，對(duì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的少數(shù)革蘭氏陰性(G-)菌屬中部分難培養(yǎng)菌種也有生長(zhǎng)促進(jìn)作用，且多數(shù)菌株具有脫氮、除磷、除臭、絮凝、降解持久性有機(jī)污染物(POPs)等環(huán)境功能。

鑒于此，本文利用藤黃球菌Rpf蛋白復(fù)蘇培養(yǎng)高氨氮廢水中的VBNC菌種，并通過測(cè)定反硝化液體培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、氨氮的濃度，研究VBNC菌種的好氧反硝化性能，從而為尋找高效好氧反硝化菌提供新的途徑。同時(shí)也為挖掘污染環(huán)境中難培養(yǎng)及VBNC狀態(tài)微生物的潛在環(huán)境功能提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.2 儀器

紫外分光光度計(jì)(UV-7504，上海欣茂儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZHWY-100C上海智誠(chéng)儀器分析制造公司)；臺(tái)式離心機(jī)(5417R，Eppendorf)；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(HWS-350，寧波海曙塞富實(shí)驗(yàn)儀器廠)；電子天平(JY3002，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；移液槍(P500，Eppendorf)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9070A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 培養(yǎng)基

1)MPN培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物0.5 g，蛋白胨5 g，NaCl 2.5 g，葡萄糖5 g，苯乙醇3 mL，pH調(diào)至7.0，固體培養(yǎng)基需加入1.5%～2%的瓊脂粉。

2)SOB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨20 g，酵母粉5 g，NaCl 0.5 g，250 mmol/L KCl溶液10 mL，pH調(diào)至7.0，該溶液使用前需加入2 mol/L MgCl25 mL。

3)好氧反硝化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1 g，亞硝酸鈉0.98 g或硝酸鈉1.21 g，KH2PO41 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，pH調(diào)至7.0。

4)氨氮降解能力鑒定培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖1 g，(NH4)2SO40.17 g，NaCl 0.3 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，CaCO37.5 g。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Rpf蛋白純化

將M.luteus的rpf基因克隆在EscherichiacoliBL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)純化后獲得Rpf蛋白[7]。

具體步驟簡(jiǎn)述如下：將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的EscherichiacoliBL21(DE3)接種至含有50 mg/L相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后再接種至200 mL SOB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，確認(rèn)轉(zhuǎn)化細(xì)菌濃度為OD600=0.6時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為1 mmol/L，20 ℃，120 r/min誘導(dǎo)過夜。

離心(12 000 r/min，10 min)收集細(xì)胞，加入緩沖液重懸菌體，并超聲破碎使得蛋白釋放出來(lái)。經(jīng)Ni柱吸附，100 mmol/L的咪銼洗脫液洗脫后，再利用純化試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化。提純的Rpf蛋白經(jīng)0.22 μL微孔濾膜過濾后，加甘油至終濃度為50%，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)，將Rpf蛋白高壓滅活(121 ℃，20 min)用于對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 Rpf蛋白對(duì)VBNC菌的復(fù)蘇促進(jìn)作用

MPN培養(yǎng)體系中，吸取1 mL采自于污水處理廠的高氨氮廢水加入至9 mL LB液體培養(yǎng)基中，而后依次稀釋，連續(xù)設(shè)置10個(gè)稀釋梯度，每一個(gè)梯度設(shè)立3個(gè)平行。在各處理組稀釋液均添加0.25% Rpf蛋白，對(duì)照組各稀釋液添加0.25%無(wú)活性Rpf蛋白上清液，將樣品放置在30 ℃，120 r/min培養(yǎng)體系中生長(zhǎng)。通過測(cè)定處理組與對(duì)照組培養(yǎng)液菌體密度(OD600)來(lái)反映Rpf對(duì)菌體生長(zhǎng)狀況的影響。同時(shí)記錄樣品的濁度以獲得MPN值，利用MPN表計(jì)算出每個(gè)樣品中可培養(yǎng)細(xì)菌的總數(shù)。

當(dāng)細(xì)菌總數(shù)處于穩(wěn)定，將處理組與對(duì)照組培養(yǎng)液最大稀釋度分別涂布于固體平板中獲得可培養(yǎng)細(xì)菌。對(duì)比兩組涂布平板的菌落差異，僅存在于處理組的菌株則為對(duì)Rpf蛋白敏感的VBNC菌。將純化后的的菌株擴(kuò)大培養(yǎng)并收集至10%的甘油中，-80 ℃保存。每種稀釋度的剩余培養(yǎng)液則放至-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 菌株16S rRNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將獲得的VBNC菌株接種至LB液體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)過夜。采用Ezup柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒提取各單菌株的DNA。然后進(jìn)行菌株16S rRNA基因的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL包括：EasyTaq SuperMix：25 μL，引物設(shè)計(jì)為8F (5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1510R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)各1 μL，模板DNA 2 μL，去離子水21 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性3 min，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min，4 ℃保持。擴(kuò)增片段約為1 450 bp。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后送至上海生工進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序。將得到基因序列與Genbank (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)中相似序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行序列同源性分析，采用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]。

2.4 菌種反硝化性能測(cè)定

將所獲的VBNC菌株挑取單菌落接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后將其接種至好氧反硝化培養(yǎng)基中，每隔20 h取樣測(cè)定培養(yǎng)基中的氨氮、硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮的濃度，數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3次。

總氮濃度測(cè)定采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法[9]；氨氮濃度測(cè)定采用納氏試劑法[9]；硝態(tài)氮測(cè)定采用酚二磺酸分光光度法[9]；亞硝態(tài)氮測(cè)定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法[9-10]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.1 SDS-PAGE驗(yàn)證Rpf蛋白

M.luteusrpf基因經(jīng)克隆，并在EscherichiacoliBL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)及系列純化后，獲得Rpf重組蛋白。結(jié)果如圖1所示，由SDS-PAGE圖可知，蛋白洗脫液中含有清晰的目的條帶，重組蛋白的分子量約為23 kDa，且雜條帶數(shù)量相較于粗體液明顯減少，說(shuō)明經(jīng)Ni柱洗脫后得到了純度較高的Rpf蛋白。

本研究中所獲的重組蛋白的分子量相對(duì)于Mukamolova等[6]從藤黃球菌上清液中分離提取的Rpf蛋白(16～17 kDa)偏大，其原因?yàn)榇酥亟M蛋白未去除N端的6個(gè)His標(biāo)簽。同時(shí)，與Mukamolova等[4]所獲的重組蛋白分子量(25 kDa)相當(dāng)。

3.2 MPN值及Rpf蛋白效應(yīng)

每隔24 h記錄MPN培養(yǎng)體系中處理組和對(duì)照組在600 nm處的光密度值。當(dāng)數(shù)值趨于穩(wěn)定后，讀取MPN值。在培養(yǎng)體系中，處理組最后3個(gè)稀釋度分別有3個(gè)，3個(gè)和2個(gè)渾濁管，對(duì)照組分別有3個(gè)，3個(gè)和1個(gè)渾濁管，透明管意味著其OD600值接近于0。在各稀釋度中，處理組的菌體生長(zhǎng)量均大于對(duì)照組，尤其是在最后的稀釋度(10-5)中，這表明Rpf可促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)。

M：蛋白質(zhì)標(biāo)記物；1-2條帶：純化的重組Rpf；3-4條帶：來(lái)自大腸桿菌(DE3)的粗提物。圖1 藤黃球菌rpf基因在Escherichia coli BL21 (DE3)融合表達(dá)蛋白的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE results of rpf gene in the Escherichia coli BL21 (DE3) fusion expression

通過查閱MPN表所得處理組細(xì)菌總數(shù)為1.1×107cells/mL，對(duì)照組細(xì)胞總數(shù)為4.6×106cells/mL，如圖2所示，通過添加Rpf，細(xì)菌的數(shù)量增加58.1%，此結(jié)果表明約58.1%的細(xì)胞因處于VBNC狀態(tài)而無(wú)法用常規(guī)平板分離法培養(yǎng)獲得。

圖2 基于MPN法計(jì)算Rpf對(duì)VBNC菌復(fù)蘇的效果Fig.2 Effect of Rpf on the resuscitation of VBNC bacteria calculated using the MPN method

3.3 16S rDNA序列同源性分析

利用Rpf從高氨氮廢水中復(fù)蘇培養(yǎng)4株VBNC菌種，分別命名為ZYR51、CHZYN52、CHZYR61和CHZYR63?；?個(gè)菌株的16S rRNA基因序列，依據(jù)Blast比對(duì)結(jié)果與Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已有相似度較高菌種共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖3所示，菌株ZYR51與Gordoniasp. VT40(相似性為99%)聚成一支，且與Rpf產(chǎn)生菌株Micrococcusluteus具有較高的同源性。CHZYN52、CHZYR61和CHZYR63菌株與假單胞菌屬(Pseudomonas)具有較近的親緣關(guān)系，穩(wěn)定性較高。由此可以初步確定ZYR51菌株屬于Gordonia屬，CHZYN52、CHZYR61和CHZYR63菌株均屬于Pseudomonas屬。此結(jié)果與前期的研究結(jié)果有較好的一致性，如Jin等[11]利用Rpf蛋白從高濃度印染廢水中復(fù)蘇獲得多株VBNC菌種，發(fā)現(xiàn)對(duì)Rpf蛋白敏感的優(yōu)勢(shì)菌種分別歸屬于Gordonia、Lysinibacillus、Bacillus、Pseudomonas和Moraxella屬，且所獲得VBNC菌種對(duì)廢水中的難降解有機(jī)污染物具有較強(qiáng)的降解性能。同時(shí)，已有研究表明Gordonia屬具有較強(qiáng)的脫氮、脫硫的能力[12-13]。如Chen等[14]利用Gordoniasp. JW8處理制漿造紙廢水，結(jié)果顯示廢水中的含氮有機(jī)污染物與對(duì)照組相比可達(dá)到最佳處理效果。另外，Pseudomonas屬的菌種所具有的脫氮功能也被廣泛報(bào)道[15-17]。如胡朝松等[18]從海洋沉積物中分離得到1株P(guān)seudomonas屬菌株F-8-1，該菌株能通過反硝化作用有效降低硝態(tài)氮和亞硝態(tài)氮含量，在5 d內(nèi)含氮污染物的去除率可達(dá)90%。本研究利用Rpf復(fù)蘇VBNC菌種所獲得的Gordonia屬菌株ZYR51和Pseudomonas屬菌株CHZYN52、CHZYR61和CHZYR63。本研究不僅為挖掘新高效好氧反硝化微生物資源提供新的途徑，并為重新評(píng)價(jià)微生物在生物脫氮過程中的作用提供一定理論依據(jù)。

圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的復(fù)蘇菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 A phylogenetic tree of the resuscitated strains constructed on the basis of the 16S rRNA gene sequence

3.4 VBNC菌種的反硝化能力

將復(fù)蘇的VBNC菌株接種至好氧反硝化培養(yǎng)基中，每隔20 h測(cè)定培養(yǎng)基中各個(gè)指標(biāo)的含量變化，結(jié)果如圖4(a)所示，菌株在經(jīng)歷一段時(shí)間的延滯期后開始迅速生長(zhǎng)，此時(shí)培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮含量明顯下降，脫氮效率在此階段達(dá)到最大值。通過對(duì)接入不同菌株的硝態(tài)氮好氧反硝化培養(yǎng)基中總氮的變化趨勢(shì)進(jìn)行分析，如圖4(b)所示，在140 h之內(nèi)接入ZYR51菌株的好氧反硝化培養(yǎng)基相比其他實(shí)驗(yàn)組總氮含量較低，下降至90 mg/L，總氮去除率高達(dá)55%。一般認(rèn)為生物同化作用利用的氮不會(huì)超過總氮的20%，菌種ZYR51的脫氮能力較為顯著。

好氧反硝化培養(yǎng)基中的亞硝態(tài)氮含量變化如圖4(c)所示，各菌株的亞硝態(tài)氮含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。表明在該種培養(yǎng)基中存在好氧反硝化作用。

復(fù)蘇的VBNC菌種在好氧反硝化培養(yǎng)基中測(cè)定硝態(tài)氮、總氮、亞硝態(tài)氮和氨氮的質(zhì)量濃度變化：(a)為硝態(tài)氮，(b)為總氮，(c)為亞硝酸鹽氮，(d)為氨氮。圖4 好氧反硝化培養(yǎng)基中各指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic changes of the indicators in aerobic denitrification medium

分離的菌株既可以硝態(tài)氮也可以亞硝態(tài)氮為底物進(jìn)行反硝化作用(圖4(a)和圖4(c))。這與好氧反硝化菌株能直接利用硝化產(chǎn)物作為反硝化底物的特性有關(guān)[19]。

為進(jìn)一步研究各菌株的氨氮降解特性，將菌株接種至以(NH4)2SO4為唯一氮源的氨氮降解能力鑒定培養(yǎng)基中，結(jié)果如圖4(d)所示，氨氮含量在0～60 h快速下降，在60 h后含量下降趨于穩(wěn)定，各個(gè)菌株的氨氮去除率維持在85%～86%，其中ZYR51的氨氮質(zhì)量濃度從35 mg/L下降至4.66 mg/L，其氨氮去除率高達(dá)86.7%。孫慶花等[20]報(bào)道在海底沉積物中分離篩選獲得1株克雷伯氏菌屬(Klebsiella)菌株y5，在未優(yōu)化條件時(shí)，其氨氮去除率為60%，但在最適條件下氨氮的去除率可達(dá)到100%。張峰峰等[21]在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中分離出具有較強(qiáng)反硝化性能的菌株DB-33，在48 h內(nèi)氨氮的去除率可達(dá)到51.52%。本實(shí)驗(yàn)分離得到的菌株ZYR51在120 h內(nèi)氨氮的去除率可達(dá)86.7%。綜上可知，菌株ZYR51具有較強(qiáng)的氨氮去除性能。

4 結(jié)論

1)本研究表明高氨氮廢水中存在大量對(duì)Rpf敏感的VBNC細(xì)菌，其數(shù)量占總菌數(shù)的58.1%。并分離純化4株VBNC菌株，其中ZYR51歸屬于Gordonia屬，菌株CHZYN52、CHZYR61和CHZYR63均歸屬于Pseudomonas屬。

2)本研究表明Pseudomonas和Gordonia屬可能為高氨氮廢水中存在的主要VBNC功能菌群，經(jīng)Rpf復(fù)蘇后具有較好的好氧反硝化性能。

3)本研究揭示在高氨氮廢水中，與藤黃球菌具有較好親緣關(guān)系的Gordonia屬菌株ZYR51的脫氮性能最強(qiáng)。從而為挖掘高效好氧反硝化菌提供新的思路。