吳金勇，陳祥松，余 超，陸姝歡，李翔宇,,*，姚建銘,3,,*

（1.中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院，安徽 合肥 230031；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，安徽 合肥 230026；4.武漢中科光谷綠色生物技術(shù)有限公司，湖北 武漢 430073；5.湖北省營(yíng)養(yǎng)化學(xué)品生物合成工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430223）

聚唾液酸（polysialic acid，PSA）是由唾液酸單體以α-(2,8)和/或α-(2,9)鍵連接的聚合體[1-2]，唾液酸單體又稱(chēng)為N-乙酰神經(jīng)氨酸。PSA在哺乳動(dòng)物中具有重要的生理功能：參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[3-4]、維持神經(jīng)系統(tǒng)健康[5]、參與癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[6-7]、參與細(xì)胞內(nèi)外分子間相互作用[3]。PSA還具有抗黏附功能，可促進(jìn)哺乳動(dòng)物外壁器官（如肺、肝、睪丸和胎盤(pán)）的發(fā)育、修復(fù)和再生[5,8-9]。PSA也是一種非免疫原性、可生物降解的材料，可用于組織工程和藥物緩釋材料[8-9]。此外，PSA降解后的唾液酸單體已被證實(shí)是人類(lèi)大腦認(rèn)知發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一[10]，食用含唾液酸單體的食物可增加腦神經(jīng)節(jié)苷和糖蛋白的濃度[11]，也可增強(qiáng)早期的學(xué)習(xí)能力[12-14]，母乳中含有大量唾液酸[10]，因此可能對(duì)嬰兒早期的腦神經(jīng)發(fā)育有非常重要的作用[15]。在嬰幼兒奶粉配方領(lǐng)域具有潛在較大的市場(chǎng)。

隨著PSA被關(guān)注度的提高，國(guó)內(nèi)外有許多單位研究開(kāi)發(fā)PSA生產(chǎn)工藝，Wu Jianrong等[12]采用較低水平的初始磷酸鹽，并控制發(fā)酵過(guò)程中pH值為6.4，最終PSA產(chǎn)量達(dá)到5.2 g/L，比初始產(chǎn)量提高了52.9%。Zheng Zhiyong等[13]采用雙階段pH值控制的策略：第1階段pH值控制在6.4，以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和形成PSA，第2階段pH值控制在7.4，促進(jìn)形成較高分子質(zhì)量的PSA，最終得到PSA產(chǎn)量達(dá)到5.65 g/L，比對(duì)照提高了2 倍。Chen Fang等[14]利用基因工程手段加強(qiáng)PSA合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)并敲除競(jìng)爭(zhēng)性途徑中的相關(guān)基因，從而獲得高產(chǎn)PSA的工程菌，在7 L發(fā)酵罐中PSA產(chǎn)量高達(dá)16.15 g/L。從以上研究結(jié)果來(lái)看，對(duì)PSA發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化可有效提高其產(chǎn)量，但最終產(chǎn)率還是較低。采用基因工程手段改造生產(chǎn)菌種效果非常顯著，然而轉(zhuǎn)基因微生物所生產(chǎn)的食品或食品添加劑并不被市場(chǎng)和消費(fèi)者所接受。離子束注入誘變技術(shù)是20世紀(jì)80年代我國(guó)科學(xué)家Yu Zengliang等[16]提出，并迅速在生物工程領(lǐng)域得到應(yīng)用的一項(xiàng)新技術(shù)[17-18]，該技術(shù)采用較低能量的氮離子注入，可誘導(dǎo)微生物體內(nèi)染色體畸變、DNA多態(tài)性變化等[17]。離子束注入由于正突變率高且不涉及轉(zhuǎn)基因操作，已被業(yè)內(nèi)廣泛使用且相應(yīng)產(chǎn)品也被市場(chǎng)所接受。例如，張麗敏等[19]通過(guò)離子束注入誘變，獲得1 株突變株，PSA產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了0.3 g/L。在工藝優(yōu)化方面，呼吸商（respiration quotient，RQ）在線實(shí)時(shí)調(diào)控策略在紅霉素、谷胱甘肽發(fā)酵優(yōu)化及放大中獲得成功應(yīng)用[20-21]，而目前PSA發(fā)酵工藝優(yōu)化主要是圍繞pH值、前體或無(wú)機(jī)鹽等方向開(kāi)展，在線實(shí)時(shí)調(diào)控僅限于pH值、溶氧等手段。RQ能反映微生物代謝實(shí)時(shí)情況[20-21]，因此有必要在PSA的發(fā)酵工藝研究中開(kāi)發(fā)RQ在線實(shí)時(shí)調(diào)控策略以指導(dǎo)PSA的中試放大及生產(chǎn)。鑒于以上情況，要對(duì)現(xiàn)有菌株進(jìn)一步進(jìn)行離子束誘變以獲取高產(chǎn)PSA的生產(chǎn)菌株，同時(shí)配套開(kāi)發(fā)RQ在線實(shí)時(shí)調(diào)控PSA生產(chǎn)以推進(jìn)PSA的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。

本研究采用低能氮離子束注入誘變獲取不同產(chǎn)量的變異菌株，并研究不同產(chǎn)量的菌株發(fā)酵過(guò)程中RQ的變化趨勢(shì)，從而得到PSA和RQ之間的初步規(guī)律，進(jìn)而采用脈沖式補(bǔ)入玉米漿干粉以確定RQ變化的規(guī)律，根據(jù)該規(guī)律，制定不同RQ調(diào)控玉米漿干粉補(bǔ)料策略，在提高生物量的同時(shí)進(jìn)一步提高PSA的產(chǎn)量，最終實(shí)現(xiàn)了PSA的高產(chǎn)，為PSA產(chǎn)業(yè)化提供了理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli ATCC13027），購(gòu)于美國(guó)組織培養(yǎng)庫(kù)。

硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂均為國(guó)產(chǎn)分析純；胰蛋白胨、酵母浸粉 美國(guó)Oxoid公司；玉米漿干粉山東振華生物科技有限公司；氨水 泰興市蘇榮助劑廠；葡萄糖 嘉吉生化有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C1112C潔凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司；FiveEasy S20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LDZH-100KBS立式大型滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；氮離子注入裝置 中國(guó)科學(xué)院等離子體物理研究所；BIOTECH-50JSA全自動(dòng)機(jī)磁力攪拌發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司；PS7000尾氣分析儀 德國(guó)H&B品牌重慶川儀九廠組裝；ZHWY-211C臥式恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司；SBA-40C葡萄糖分析儀 中國(guó)山東科學(xué)院生物研究所；Ultimate3000高效液相色譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 斜面培養(yǎng)

斜面培養(yǎng)基：氯化鈉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.2～7.4。將保存于4 ℃冰箱的菌種，挑取1 環(huán)到準(zhǔn)備好的固體斜面培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)12 h。

1.3.2 種子培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉3.0 g/L，pH 7.2～7.4。將斜面培養(yǎng)活化后的種子接種兩環(huán)于250 mL三角瓶中（內(nèi)裝50 mL 種子培養(yǎng)基）后，放置于搖床中培養(yǎng)，搖床條件為轉(zhuǎn)速250 r/min，溫度37 ℃，培養(yǎng)8～10 h。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，玉米漿干粉20 g/L，硫酸銨3 g/L，磷酸二氫鉀7 g/L，硫酸鎂1 g/L，金屬離子1 mL/L，維生素溶液1 mL/L，pH 7.5（滅菌前）。將活化后的種子液按10%接種量接于250 mL三角瓶中（內(nèi)裝50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基）后，放置于搖床中培養(yǎng)，搖床條件為：轉(zhuǎn)速350 r/min，溫度37 ℃，培養(yǎng)72 h，每培養(yǎng)12 h補(bǔ)入葡萄糖1 g，共計(jì)補(bǔ)入5 次。

1.3.4 離子束誘變

大腸桿菌按照1.3.2節(jié)種子培養(yǎng)方法，培養(yǎng)結(jié)束后10 000 r/min離心5 min，取下層菌體重懸于等體積的無(wú)菌生理鹽水中。經(jīng)離心、重懸2～3 次，制得菌懸液，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)x擇合適梯度的菌懸液涂布于無(wú)菌平皿，在超凈臺(tái)中以無(wú)菌空氣風(fēng)干備用。離子注入實(shí)驗(yàn)在中科院離子束生物工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室氮離子注入裝置上進(jìn)行。N+離子源注入注入能量15 keV，注入劑量1×1014～12×1014ion/cm2，以5 s脈沖式注入，間隔20 s，靶室真空度約10-3Pa。將每?jī)蓚€(gè)涂布平皿上下疊放于注入機(jī)靶臺(tái)上，上層接受離子者為處理，下層未接受離子注入者為真空對(duì)照。每個(gè)劑量進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定存活率，按存活率決定稀釋倍數(shù)，以每平板菌落100～300 個(gè)為宜，誘變結(jié)束后以2 mL無(wú)菌水洗脫，梯度稀釋后，涂布于含有斜面培養(yǎng)基的平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，用于單菌落的挑選及致死率計(jì)算，如式（1）所示：

1.3.5 50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

全自動(dòng)50 L磁力攪拌發(fā)酵罐中裝30 L發(fā)酵培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的種子按照10%的接種量接入發(fā)酵罐中。在溫度37 ℃、通氣量60～90 L/min、攪拌轉(zhuǎn)速300～500 r/min條件下培養(yǎng)時(shí)間60 h。溶氧全程控制在30%以上。通過(guò)自動(dòng)流加氨水維持發(fā)酵液pH值在6.8±0.02以?xún)?nèi)。全程流加600 g/L的葡萄糖液以補(bǔ)充碳源，每4 h取樣檢測(cè)發(fā)酵液殘?zhí)牵?jì)算葡萄糖消耗速率，根據(jù)葡萄糖實(shí)際消耗速率進(jìn)行控制，發(fā)酵液殘?zhí)强刂撇怀^(guò)0.2 g/L。

1.3.6 生物量測(cè)定

取20 mL發(fā)酵液樣品，10 000 r/min離心5 min，取下層菌體，置于105 ℃烘箱2 h至質(zhì)量恒定，稱(chēng)取質(zhì)量，將菌體干質(zhì)量除以樣品體積，即得到生物量。

1.3.7 還原糖測(cè)定

用葡萄糖分析儀測(cè)定發(fā)酵液殘余葡萄糖含量。

1.3.8 PSA含量的測(cè)定

對(duì)PSA含量的測(cè)定采用間苯二酚法。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取100 mg/L唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL于各管中，補(bǔ)水至2.0 mL為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)。各管加2 mL顯色劑（0.l mol/L硫酸銅溶液0.5 mL，4%間苯二酚溶液5 mL，濃鹽酸80 mL，補(bǔ)水至100 mL混勻，臨用現(xiàn)配）搖勻，沸水浴60 min后冰浴10 min，每管加4 mL有機(jī)相（正丁醇15 mL，加乙酸丁酯定容至100 mL），充分搖勻后置室溫10 min，取上層有機(jī)相，以0 mL對(duì)照為零點(diǎn)，于585 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并作線性回歸。

樣品分析：發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心5 min取上清液0.1 mL，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法處理該樣品，最后在585 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中PSA含量。

1.3.9 乙酸含量的測(cè)定

發(fā)酵液離心后取上清液，0.22 μm濾膜過(guò)濾后采用高效液相色譜測(cè)定，色譜柱為Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm，9 μm）；流動(dòng)相為5 mmol/L硫酸，流動(dòng)相流速0.6 mL/min；紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)200 nm；柱溫60 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.10 OUR、CER和RQ的測(cè)定

測(cè)定尾氣中氧氣含量（O2out）和二氧化碳含量（CO2out），并結(jié)合發(fā)酵過(guò)程通氣量/發(fā)酵培養(yǎng)體積比（VVMin）計(jì)算氧消耗速率（oxygen uptake rate，OUR）、二氧化碳釋放速率（carbon-dioxide escape rate，CER）和RQ，通氣量采用熱式質(zhì)量流量計(jì)測(cè)定，顯示值已經(jīng)換算成標(biāo)準(zhǔn)狀況下的數(shù)值（273.15 K，101 kPa）。OUR、CER和RQ計(jì)算如式（2）～（4）所示：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖像處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)共設(shè)3 個(gè)平行，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差顯著性分析，選擇獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。圖表采用Excel 2007軟件進(jìn)行制作分析，并采用Adobe Photoshop CS5處理后輸出；發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，OUR、CER、RQ每30 min取一個(gè)點(diǎn)，采用Excel 2007軟件制作分析并采用Adobe Photoshop CS5處理后輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 低能N+離子束對(duì)菌體的致死率

表1 不同N＋離子束下大腸桿菌的致死率Table 1 Mortality rates of E. coli under different doses of N+ ion beam

如表1所示，在一定范圍內(nèi)，隨著離子束誘變劑量的提高，大腸桿菌致死率隨之迅速增加，當(dāng)劑量超過(guò)6×1014ion/cm2時(shí)，致死率反而下降，當(dāng)劑量增加至10×1014ion/cm2時(shí)，致死率與6×1014ion/cm2劑量的致死率接近，當(dāng)劑量進(jìn)一步增加至12×1014ion/cm2時(shí)，致死率達(dá)到95%。致死率的先提高后下降再提高的現(xiàn)象在其他文獻(xiàn)中也有報(bào)道，為取得較好的正突變率，一般選擇致死率的平臺(tái)期[22-23]。因此，誘變劑量選擇10×1014ion/cm2。

2.2 突變株搖瓶復(fù)篩

對(duì)平板法篩選到的146 株菌進(jìn)行250 mL搖瓶發(fā)酵復(fù)篩。結(jié)果表明，25 株突變株較出發(fā)菌株P(guān)SA產(chǎn)量有所提高，正突變率為17.1%。PSA產(chǎn)量提高最多的5 株正突變株以及PSA產(chǎn)量出現(xiàn)下降的6 株搖瓶發(fā)酵結(jié)果如表2所示。

從表2可以看出，相對(duì)出發(fā)菌株來(lái)說(shuō)，N149菌株P(guān)SA產(chǎn)量增加率最大，為36.81%，而N164菌株P(guān)SA產(chǎn)量下降最多，下降率為22.92%。因而選擇出發(fā)菌株、N149和N164菌進(jìn)一步研究，以了解3 株菌之間的差異。

表2 復(fù)篩得到11 株菌的搖瓶考察結(jié)果Table 2 Results of secondary screening of the 11 strains by in shake flask fermentation

2.3 不同突變株在發(fā)酵過(guò)程中生物量、PSA、RQ、乙酸變化趨勢(shì)

通過(guò)離子束注入誘變得到了正突變和負(fù)突變的菌種，其PSA產(chǎn)量與對(duì)照的差異從-22.92%波動(dòng)至36.81%，離散系數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)差/平均值）達(dá)到21.56%，為研究大腸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)PSA過(guò)程中的關(guān)鍵控制點(diǎn)，分別從突變株中選取產(chǎn)量最高的正突變株N149和產(chǎn)量最低的負(fù)突變株N164在50 L發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵，并以出發(fā)菌株為對(duì)照。從而研究比較3 株不同PSA產(chǎn)量菌株之間的差異。

圖1 不同突變株在發(fā)酵過(guò)程中生物量（A）、乙酸（B）、PSA（C）及RQ（D）變化趨勢(shì)Fig. 1 Time courses of dry biomass yield (A), acetic acid (B),PSA titer (C) and RQ (D) in fed-batch fermentation by E. coli

由圖1A可知，出發(fā)菌株在42 h獲得最大生物量，為49.30 g/L。N149和N164在48 h時(shí)分別達(dá)到48.6 g/L和41.3 g/L。出發(fā)菌株和N149最終生物量相同，而N164生物量整體偏低。3 個(gè)菌株生物量趨勢(shì)的共同特點(diǎn)是在48 h后不再增長(zhǎng)，反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。Zheng Zhiyong等[13]在研究大腸桿菌產(chǎn)PSA的工藝時(shí)發(fā)現(xiàn)，生物量在20 h左右可達(dá)到最高點(diǎn)，隨后開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，該研究采取兩階段pH值調(diào)控的策略后，菌體生物量可持續(xù)增長(zhǎng)至40 h。在Wu Jianrong等[24]的研究中，大腸桿菌生物量在36 h達(dá)到最大值，38 h時(shí)生物量就開(kāi)始下降，通過(guò)添加磷酸二氫鉀以及氨水結(jié)合氫氧化鉀控制pH值后，生物量提高了約40%，并在42 h達(dá)到最高之后一直穩(wěn)定到58 h才出現(xiàn)下降趨勢(shì)。從這些研究來(lái)看，產(chǎn)PSA的大腸桿菌按照常規(guī)發(fā)酵工藝進(jìn)行調(diào)控可能會(huì)較快進(jìn)入衰亡期，因此大部分研究都會(huì)適當(dāng)調(diào)整不同的策略控制工藝以保持菌體的活力，從而延長(zhǎng)PSA的生產(chǎn)期。圖1B顯示，N164乙酸質(zhì)量濃度最高，其次為出發(fā)菌株，最低的為N149。由圖1C可看出，20 h前3 株菌PSA產(chǎn)量比較接近，20 h后3 株菌的PSA產(chǎn)量增長(zhǎng)趨勢(shì)出現(xiàn)差異，42 h時(shí)N164、出發(fā)菌株和N149的PSA產(chǎn)量差異最大，分別為3.26、5.45、8.52 g/L，3 株菌PSA產(chǎn)量差異極顯著（P＜0.01），發(fā)酵結(jié)束時(shí)，N164、出發(fā)菌株和N149的PSA最大產(chǎn)量分別為4.06、6.79、9.05 g/L，PSA生產(chǎn)速率分別為67.6、113.2、150.9 mg/（L·h）。由圖1D可以看出，較優(yōu)的突變株N149在0～18 h RQ維持在1.0上下波動(dòng)，12～48 h RQ保持在0.7左右，而另外兩株保持在1.0左右，并且PSA產(chǎn)量差異也較大，可以推測(cè)，PSA高速合成時(shí)，RQ最佳值可能就在0.7左右，由此看來(lái)，RQ值可能直接表征PSA的合成狀態(tài)。此外，高產(chǎn)菌株在48 h后出現(xiàn)RQ回升的趨勢(shì)，PSA產(chǎn)量在此之后并無(wú)增長(zhǎng)。

3 株菌生物量、PSA以及乙酸產(chǎn)生量均有較大的差異，發(fā)酵工藝保持一致的情況下，可以推測(cè)這些差異是由于菌種本身所造成的。RQ作為很好的在線調(diào)控參數(shù)，可以反映微生物培養(yǎng)過(guò)程中底物的利用、產(chǎn)物和副產(chǎn)物的合成及微觀代謝途徑通量的變化情況[25]，3 株菌培養(yǎng)過(guò)程中RQ在初期都在1.0左右波動(dòng)，這是因?yàn)榫w在生長(zhǎng)初期，只要有足夠的氧氣，葡萄糖就會(huì)進(jìn)入檸檬酸循環(huán)，其反應(yīng)式為：C6H12O6+6O2=6CO2+6H2O，產(chǎn)生的能量主要供給細(xì)胞的生長(zhǎng)[21,25]。隨著產(chǎn)物和副產(chǎn)物的合成，RQ會(huì)發(fā)生變化，本研究中，當(dāng)PSA快速合成時(shí)（20～48 h），RQ從1.0逐漸降低至0.7，而其余兩株菌PSA產(chǎn)量偏低，乙酸含量顯著偏高（P＜0.01），RQ顯著高于高產(chǎn)菌的RQ（P＜0.01）。有報(bào)道指出，葡萄糖被分解利用后產(chǎn)生乙酸，RQ值大約為1.0[26]，N164乙酸產(chǎn)量最高可達(dá)到5.52 g/L，因此RQ顯著高于N149。3 株菌發(fā)酵過(guò)程中的這些差異說(shuō)明：RQ可能很大程度與PSA和乙酸、生物量增長(zhǎng)有密切關(guān)系，當(dāng)PSA快速合成過(guò)程中，RQ值在0.7左右。因此通過(guò)在線控制RQ有可能調(diào)節(jié)PSA和乙酸、生物量。

2.4 氮源添加對(duì)PSA產(chǎn)量和生物量的影響

圖2 不同氮源的添加對(duì)大腸桿菌搖瓶發(fā)酵的生物量、PSA產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effects of different nitrogen sources on dry biomass yield and PSA titer in shake flask fermentation by E. coli

3 株菌株都在48 h后出現(xiàn)生物量下降，PSA產(chǎn)量增長(zhǎng)緩慢的趨勢(shì)，這可能是發(fā)酵中后期出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)元素不足（氮源、維生素、金屬離子或生長(zhǎng)因子），導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，進(jìn)而出現(xiàn)PSA增長(zhǎng)緩慢的問(wèn)題。為解決該問(wèn)題，考慮添加新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。工業(yè)上常用的易溶于水，方便補(bǔ)料操作的氮源有谷氨酸鈉、酵母浸膏、玉米漿干粉等。本研究以N149菌為研究對(duì)象，采用搖瓶進(jìn)行氮源篩選，按照0、24、48 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)以及0.2、0.5、1 g/100 mL質(zhì)量濃度（干質(zhì)量/發(fā)酵體積）分別添加至發(fā)酵液中，結(jié)果如圖2所示。

從圖2A可以看出，添加谷氨酸鈉后生物量和PSA增長(zhǎng)趨勢(shì)并不明顯，說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程并不缺乏氨基態(tài)氮源。從圖2B可以看出，添加酵母浸膏的批次在0、24 h時(shí)，生物量增長(zhǎng)比較明顯，并且在相同質(zhì)量濃度下增長(zhǎng)幅度都比較接近，0 h添加1 g/100 mL的酵母浸膏時(shí)生物量增長(zhǎng)幅度最大，比對(duì)照增加了36.33%，但在48 h添加時(shí)，生物量未見(jiàn)提高；24 h添加1%酵母浸膏時(shí)，PSA比對(duì)照增長(zhǎng)幅度為7.49%，說(shuō)明在發(fā)酵的前中期添加酵母浸膏對(duì)生物量有較好的促進(jìn)效果，在發(fā)酵后期添加酵母浸膏時(shí)，生物量增長(zhǎng)不明顯，而中后期添加酵母浸膏時(shí)PSA有小幅度增長(zhǎng)。從圖2C可以看出，在0、24 h添加玉米漿干粉時(shí)，生物量增長(zhǎng)比較明顯，生物量增長(zhǎng)幅度最大的是0 h添加1 g/100 mL玉米漿干粉，生物量比對(duì)照增加了53.04%，但在48 h加入玉米漿干粉時(shí)，最大增長(zhǎng)幅度為12.17%；在0、48 h添加玉米漿干粉PSA產(chǎn)量遠(yuǎn)不及在24 h添加玉米漿干粉PSA產(chǎn)量高，24 h添加1%玉米漿干粉時(shí)PSA增長(zhǎng)幅度最大，為14.47%，說(shuō)明玉米漿干粉添加的方式對(duì)PSA產(chǎn)量有較大的影響。

綜合以上結(jié)果可知，谷氨酸鈉作為氮源，是一種單獨(dú)的氨基酸，添加后生物量并未見(jiàn)增長(zhǎng)，說(shuō)明大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中不缺氮源，酵母浸膏和玉米漿干粉添加后，生物量均有增加，說(shuō)明兩種有機(jī)氮源中營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)于大腸桿菌的生長(zhǎng)有很好的促進(jìn)效果。但兩者對(duì)PSA產(chǎn)量的促進(jìn)作用差異比較大，玉米漿干粉的促進(jìn)效果好于酵母浸膏，可能是因?yàn)閮烧叩陌被峤M成以及其他營(yíng)養(yǎng)成分的差異所造成。張樂(lè)等[27]研究玉米漿和酵母浸膏對(duì)丁二酸發(fā)酵的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用095K玉米漿干粉完全替換酵母浸膏時(shí)，丁二酸產(chǎn)量從28.45 g/L提高到29.43 g/L，進(jìn)一步分析了玉米漿干粉組分差異，添加影響較大的4 種氨基酸和2 種維生素后，丁二酸產(chǎn)量進(jìn)一步提高到了32.56 g/L，說(shuō)明有機(jī)氮源中的氨基酸組成和維生素對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的影響非常大。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)玉米漿干粉對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)和PSA合成有較好的促進(jìn)作用，因此選擇玉米漿干粉作為氮源進(jìn)一步研究流加策略。

2.5 玉米漿干粉對(duì)大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程RQ的影響

為了解玉米漿干粉對(duì)大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中代謝的影響，采用50 g/L的玉米漿干粉溶液分別在20 h和40 h加入到發(fā)酵液中，累計(jì)最終質(zhì)量濃度為10 g/L。如圖3A所示，OUR在12 h前快速增長(zhǎng)，并在17 h達(dá)到最大值0.23 mol/（L·h），隨后開(kāi)始逐步下降，CER則在7 h達(dá)到最大值，隨后保持相對(duì)穩(wěn)定至發(fā)酵結(jié)束；RQ在10 h前保持在1.0上下波動(dòng)，隨后開(kāi)始下降并維持在0.7左右波動(dòng)，41 h后開(kāi)始上升至0.9左右。圖3B顯示了兩次添加玉米漿干粉后的OUR、CER和RQ的變化，從整體趨勢(shì)上來(lái)看，兩次添加玉米漿干粉導(dǎo)致CER和OUR出現(xiàn)較為明顯的增加，RQ也相應(yīng)從0.7提高至0.9。出現(xiàn)這種變化的原因可能是添加玉米漿干粉后，細(xì)胞獲得足夠多的營(yíng)養(yǎng)因子后進(jìn)一步生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致氧的消耗速率提高，二氧化碳的產(chǎn)生量也加大，反映在OUR曲線上看就是不再下降，而是維持平穩(wěn)趨勢(shì)。從RQ來(lái)看，添加玉米漿干粉后，RQ從0.7慢慢升高至0.9，可能是菌體的代謝發(fā)生了變化，生長(zhǎng)和PSA生產(chǎn)同時(shí)進(jìn)行。這一現(xiàn)象表明，RQ與細(xì)胞生長(zhǎng)以及PSA生產(chǎn)有很強(qiáng)的相關(guān)性，因此有可能是調(diào)控PSA合成的理想實(shí)時(shí)在線參數(shù)。

圖3 發(fā)酵過(guò)程不添加玉米漿干粉（A）和添加玉米漿干粉（B）對(duì)OUR、CER和RQ的影響Fig. 3 Time courses of OUR, CER and RQ in fed-batch fermentation by E. coli in control (A) and with batch feeding of corn steep powder (B)

2.6 在線RQ調(diào)控流加玉米漿干粉策略比較

由于PSA是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，然后通過(guò)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)出胞外[28]，細(xì)胞的數(shù)量在一定程度上影響著PSA的產(chǎn)量，因此可考慮進(jìn)一步提高細(xì)胞密度。根據(jù)搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，玉米漿干粉既可提高生物量也可以提高PSA產(chǎn)量，然而添加時(shí)機(jī)和添加量對(duì)PSA產(chǎn)量影響大，因此需要在生物量的增長(zhǎng)和PSA合成之間進(jìn)行平衡。PSA產(chǎn)量較高的菌種在發(fā)酵過(guò)程中，RQ維持在0.7左右。而玉米漿干粉補(bǔ)入對(duì)RQ影響又比較顯著，可以采用流加玉米漿干粉提高生物量的同時(shí)通過(guò)控制玉米漿干粉流加速率對(duì)RQ進(jìn)行調(diào)控，從而取得高生物量的同時(shí)也能提高PSA產(chǎn)量。

圖4 不同策略下生物量（A）、乙酸（B）、PSA產(chǎn)量（C）及RQ（D）變化趨勢(shì)Fig. 4 Time courses of dry biomass yield (A), acetic acid (B), PSA titer (C)and RQ (D) in fed-batch fermentation by E. coli using different strategies

從圖4A可見(jiàn)，流加玉米漿干粉的兩個(gè)批次生物量增長(zhǎng)明顯高于對(duì)照，當(dāng)RQ控制在0.9時(shí)，生物量最高可達(dá)到65.7 g/L，RQ控制在0.8時(shí)，生物量最高可達(dá)到55.2 g/L，分別是對(duì)照生物量的1.45 倍和1.22 倍。圖4B顯示，RQ控制在0.9時(shí)，乙酸整體質(zhì)量濃度高于RQ控制在0.8的批次和對(duì)照。可能是因?yàn)檫@株大腸桿菌乙酸的產(chǎn)生是本底表達(dá)，只要有碳源利用就會(huì)產(chǎn)生乙酸。計(jì)算乙酸對(duì)菌體的得率發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、RQ 0.8、RQ 0.9的批次乙酸/生物量分別為0.055、0.051、0.052，這3 組數(shù)據(jù)都比較接近，說(shuō)明生物量的提高也會(huì)帶來(lái)乙酸質(zhì)量濃度的提高。因此，流加玉米漿干粉對(duì)乙酸的產(chǎn)生無(wú)顯著影響（P＞0.05）。圖4C顯示，RQ 0.8、RQ 0.9的批次在60 h分別達(dá)到12.83、10.42 g/L，比對(duì)照分別提高了45.30%、18.01%。圖4D顯示了不同策略下RQ的實(shí)際變化曲線，可以看出，流加玉米漿干粉可有效實(shí)時(shí)在線控制RQ，隨著玉米漿干粉流加量的提高，RQ也會(huì)提高。這可能是流加玉米漿干粉后，刺激了細(xì)胞的生長(zhǎng)，使得部分細(xì)胞快速生長(zhǎng)，而細(xì)胞在快速生長(zhǎng)階段RQ控制在1.0，因此流加玉米漿干粉后RQ會(huì)適當(dāng)提高。

表3 不同調(diào)控方式下菌體生物量及PSA產(chǎn)量和速率參數(shù)Table 3 Dry biomass yield and calculation of PSA yield and rate parameters in three fermentation modes

瞿亮等[29]采用RQ在線控制葡萄糖流速，以刺激脂肪酸的合成，DHA產(chǎn)量提高了12.19%。程奔等[30]也采用RQ在線實(shí)時(shí)控制葡萄糖流速以提高酵母的生物量。所不同的是已報(bào)道文獻(xiàn)控制的是葡萄糖流速，而本研究控制的是氮源流速?？刂频吹淖钪饕獌?yōu)勢(shì)在于維持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，以持續(xù)穩(wěn)定地進(jìn)行目標(biāo)產(chǎn)物的合成。然而，其中較大的技術(shù)難點(diǎn)在于氮源一旦過(guò)量則會(huì)導(dǎo)致整個(gè)代謝途徑的變化，使得細(xì)胞的生長(zhǎng)占據(jù)主要地位。付旭東等[31]在大腸桿菌合成PSA前期停止補(bǔ)充氨水并補(bǔ)入適量蛋白胨，最終PSA產(chǎn)量有所提高，此結(jié)果和本研究具有一致性。當(dāng)玉米漿干粉補(bǔ)入量提高后，PSA產(chǎn)量得到很好的提高，如表3所示，與對(duì)照相比，RQ 0.8的批次玉米漿干粉用量增加了9 g/L，PSA產(chǎn)量提高了45.30%。隨著玉米漿干粉用量繼續(xù)增加PSA產(chǎn)量反而比RQ 0.8批次降低18.78%?？梢?jiàn)，玉米漿干粉的用量對(duì)PSA影響非常大。實(shí)際上，由于RQ 0.9補(bǔ)入的玉米漿干粉偏多，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，生物量高達(dá)65.7 g/L，盡管PSA產(chǎn)量比對(duì)照提高了，但是葡萄糖轉(zhuǎn)化量（YP/S）大大降低，僅29.6 mg/g，比對(duì)照降低了28.50%，對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，原料成本將大幅度提高。由此可見(jiàn)，玉米漿干粉的流加策略對(duì)PSA產(chǎn)量及生產(chǎn)成本會(huì)有很大的影響。而RQ在線實(shí)時(shí)監(jiān)控則可以隨時(shí)了解菌體的代謝狀況，并據(jù)此對(duì)補(bǔ)料進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)控，從而能穩(wěn)定PSA的生產(chǎn)，這對(duì)PSA工業(yè)化生產(chǎn)將具有重大的意義。

表4 大腸桿菌工藝調(diào)控方式及PSA產(chǎn)率與文獻(xiàn)結(jié)果的比較Table 4 Comparison of PSA productivity of E. coli using the strategy presented in this study with literature data

采用離子束誘變大腸桿菌產(chǎn)PSA的研究甚少，其中張麗敏等[19]采取離子束誘變處理得到高產(chǎn)PSA菌株的產(chǎn)量提高率為24.00%，但并沒(méi)有進(jìn)一步研究發(fā)酵工藝。Chen Fang等[14]采用基因改造加強(qiáng)了PSA合成途徑并敲除競(jìng)爭(zhēng)性途徑中的相關(guān)基因，PSA產(chǎn)量提高率達(dá)到85.00%。如表4所示，本研究通過(guò)離子束誘變得到的菌株P(guān)SA產(chǎn)量提高率為36.81%，采用RQ在線調(diào)控流加玉米漿干粉后，PSA產(chǎn)量提高率相對(duì)出發(fā)菌株的PSA提高率達(dá)到了88.95%。最終產(chǎn)量達(dá)到12.83 g/L，高于大部分文獻(xiàn)報(bào)道的PSA產(chǎn)量。盡管本研究所采用的離子束誘變技術(shù)應(yīng)用于PSA菌株篩選已有文獻(xiàn)報(bào)道，但篩選得到的菌株產(chǎn)量提高了36.81%，相對(duì)已有報(bào)道的產(chǎn)量提高率24.00%有所提高，此外，本研究基于誘變得到的不同菌株進(jìn)行了深入研究，得到了工藝調(diào)控的思路，且采用RQ調(diào)控玉米漿補(bǔ)料的方式在PSA生產(chǎn)中鮮見(jiàn)應(yīng)用，具有一定的新穎性。采用RQ在線實(shí)時(shí)調(diào)控玉米漿干粉補(bǔ)料工藝的產(chǎn)量提高率為45.30%，和其他研究相比不高，但RQ是從代謝角度反映菌體在發(fā)酵過(guò)程中的實(shí)時(shí)變化情況，因此可以用于指導(dǎo)PSA的中試放大，并且在PSA生產(chǎn)過(guò)程中可實(shí)時(shí)監(jiān)控菌體代謝情況，具有很好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

本研究采用低能離子束注入誘變結(jié)合RQ在線實(shí)時(shí)調(diào)控PSA生產(chǎn)的策略，誘變得到1 株P(guān)SA產(chǎn)量最高為3.94 g/L的突變株，通過(guò)RQ在線實(shí)時(shí)調(diào)控流加玉米漿干粉使得PSA產(chǎn)量達(dá)到12.83 g/L，比對(duì)照提高了45.30%，比出發(fā)菌株的產(chǎn)量提高了88.95%。低能離子束注入誘變產(chǎn)生的菌株P(guān)SA產(chǎn)量最低和最高之間的差異可達(dá)到77.48%（P＜0.01），通過(guò)比較產(chǎn)量差異極大菌株的RQ變化規(guī)律可了解高產(chǎn)菌株在RQ上的表現(xiàn)性狀，從而制定相應(yīng)的工藝調(diào)控策略。在PSA生產(chǎn)期，流加玉米漿干粉將RQ控制在0.8左右是一種易于實(shí)現(xiàn)的控制策略，既能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，也能提高PSA產(chǎn)量。與傳統(tǒng)誘變選育高產(chǎn)菌株的研究相比，本研究特別利用了產(chǎn)量較低的菌株作為參照，通過(guò)尾氣分析不同菌株的RQ變化規(guī)律，得到低產(chǎn)和高產(chǎn)菌株的RQ差異，進(jìn)而在后續(xù)工藝調(diào)控上應(yīng)用RQ控制策略，最終實(shí)現(xiàn)了PSA產(chǎn)量的大幅度提高，因此本研究提出的離子束注入誘變結(jié)合RQ在線實(shí)時(shí)補(bǔ)料的思路對(duì)于其他發(fā)酵工藝產(chǎn)品具有一定的借鑒意義，此外，在PSA產(chǎn)業(yè)化放大也具有很好的參考價(jià)值。