蜂蜜接合酵母對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用及其高糖脅迫應(yīng)激代謝特性分析

劉功良，費(fèi)永濤*，余潔瑜，劉 銳，高蘇娟，白衛(wèi)東

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東 廣州 510225）

隨著乙醇濃醪發(fā)酵技術(shù)的進(jìn)步，對(duì)以釀酒酵母為主體的代謝過程和基本代謝途徑已有較多報(bào)道，但由于它的代謝過程極為復(fù)雜，代謝產(chǎn)物較多，對(duì)其在高糖環(huán)境下的代謝特性與應(yīng)答機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。彭酈等[1]研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母AWRI R2在高糖條件下仍可以積累海藻糖，海藻糖積累量是釀酒酵母應(yīng)對(duì)高糖逆境的指標(biāo)之一，同時(shí)溫度會(huì)影響海藻糖的產(chǎn)生。此外，Wang Pinmei等[2]研究發(fā)現(xiàn)重組酵母通過積累胞內(nèi)海藻糖的方式保護(hù)細(xì)胞，通過調(diào)控重組酵母在高滲條件下細(xì)胞的完整性、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的酶活性提高酵母在濃醪中的發(fā)酵能力。除海藻糖外，李曉軍等[3]研究指數(shù)生長(zhǎng)期的釀酒酵母FCC2146在高滲脅迫下的應(yīng)激代謝反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)甘油作為釀酒酵母FCC2146的主要相容性溶質(zhì)也是酵母應(yīng)對(duì)高糖逆境的指示物質(zhì)，在300 g/L高糖環(huán)境下，胞外乙醇、甘油、海藻糖分別較對(duì)照環(huán)境（糖100 g/L）提高100%、400%和11%。同樣，Abertny等[4]也認(rèn)為釀酒酵母細(xì)胞可以通過主動(dòng)調(diào)節(jié)甘油的濃度適應(yīng)高糖環(huán)境。董欣福等[5]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母在高糖培養(yǎng)環(huán)境中，有氧呼吸抑制，三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）斷裂，導(dǎo)致發(fā)酵初期檸檬酸和蘋果酸分泌到胞外，同時(shí)菌體中乳酸也不斷積累，而當(dāng)糖濃度降低時(shí)，TCA循環(huán)重新閉合，檸檬酸、α-酮戊二酸和蘋果酸重新進(jìn)入細(xì)胞參與代謝。酵母不僅可以通過改變代謝流來(lái)適應(yīng)高糖環(huán)境，徐偉等[6]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母YMI-37還可以通過改變自身形態(tài)提高細(xì)胞質(zhì)濃度來(lái)應(yīng)對(duì)高滲環(huán)境。在前期研究中，利用26S rDNA分子鑒定技術(shù)將分離自蜂蜜的酵母鑒定為蜂蜜接合酵母，發(fā)現(xiàn)該菌能夠耐受700 g/L高糖質(zhì)量濃度[7]，而目前開展酵母耐受高糖特性研究所用糖質(zhì)量濃度均在300～650 g/L范圍內(nèi)[8]。因此，本研究以已篩選的蜂蜜接合酵母6-7431為實(shí)驗(yàn)菌，研究其高糖脅迫應(yīng)激代謝特性，為乙醇濃醪發(fā)酵和酵母耐高糖機(jī)制研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

葡萄酒高活性干酵母SY 湖北安琪酵母有限公司；蜂蜜接合酵母（Zygosaccharomyces mellis）7-7142、7-7352、6-7431、7-7551、7-7651、7-7751，由仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院生物工程試驗(yàn)室分離篩選得到，其中蜂蜜接合酵母6-7431保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2015545。

1.1.2 試劑

半乳糖、阿拉伯糖、麥芽糖、木糖、麥芽三糖、甘油 阿拉丁生化科技股份有限公司；酵母膏、瓊脂、麥芽汁培養(yǎng)基、蛋白胨、酵母提取粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其余為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

高糖培養(yǎng)基：稱取葡萄糖加入麥芽汁培養(yǎng)基中，溶于去離子水，調(diào)整糖質(zhì)量濃度為300、350、400、450、500、550、600、650、700 g/L和750 g/L，70 ℃水浴搖勻溶解，115 ℃滅菌20 min。其中常規(guī)培養(yǎng)基的含糖質(zhì)量濃度為100 g/L。

糖類發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2 g/L，NaCl 0.5 g/L，溶于去離子水，121 ℃滅菌15 min。

同化碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，酵母膏0.02 g/L，瓊脂 2.0 g/L，pH 5～6，115 ℃滅菌15 min，冷卻至70 ℃后，倒平板備用。

同化氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2.0 g/L KH2PO40.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，酵母膏0.02 g/L，瓊脂2.0 g/L，pH 5～6，115 ℃滅菌15 min，冷卻至70 ℃后，倒平板備用。

完全培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，瓊脂20 g/L，115 ℃滅菌15 min，冷卻至70 ℃后，倒平板備用。

無(wú)維生素生長(zhǎng)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，CaCl2·2H2O 0.1 g/L，KH2PO42.5 g/L，NaCl 0.1 g/L，115 ℃滅菌15 min，冷卻至70 ℃后，倒平板備用。

1.2 儀器與設(shè)備

Phenom-World飛納臺(tái)式掃描電鏡 復(fù)納科學(xué)儀器上海有限公司；UV-2700紫外-可見分光光度計(jì)、LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂蜜接合酵母的活化

取出保存在4 ℃冰箱里的酵母菌試管斜面，用接種環(huán)挑取兩環(huán)菌種，接種于100 g/L常規(guī)糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)基，在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h。

1.3.2 蜂蜜接合酵母的同化性能鑒定

挑取在低溫試管斜面保藏的菌體，接種到含糖量為70 °Bé的麥芽汁試管斜面，28 ℃培養(yǎng)3～4 d，轉(zhuǎn)接到麥芽汁液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用無(wú)菌水對(duì)菌體進(jìn)行清洗，制備菌懸液。

糖類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：采用杜氏管發(fā)酵法測(cè)定6 株菌對(duì)糖類物質(zhì)的代謝能力[9]。將菌體重懸液按照5%接種量（V/V，下同）接入糖質(zhì)量濃度為30 °Bé的杜氏小管培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)3～4 d，觀察6 株蜂蜜接合酵母對(duì)葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、麥芽糖的發(fā)酵能力。

碳、氮源同化性能鑒定：采用生長(zhǎng)譜法[10-11]測(cè)定6 株酵母對(duì)果糖、木糖、麥芽三糖、阿拉伯糖、半乳糖、麥芽糖、甘油等碳源的同化能力，各種碳源在培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度為40 g/L；采用生長(zhǎng)譜法鑒定6 株酵母對(duì)酵母粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸鉀、磷酸三銨、乙酸銨等氮源的同化能力，各種氮源在培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度為40 g/L。

無(wú)維生素培養(yǎng)基上菌種的生長(zhǎng)性能鑒定[12]：將6 株酵母的重懸液按照5%接種量接入無(wú)維生素培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，每隔24 h觀察培養(yǎng)皿中是否有菌落生長(zhǎng)，以完全培養(yǎng)基作對(duì)照，設(shè)置3 組平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 高糖脅迫對(duì)蜂蜜接合酵母生理形態(tài)的影響

取活化后的蜂蜜接合酵母6-7431，以10%接種量接入高糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)96 h后，通過電子掃描顯微鏡觀察蜂蜜接合酵母的形態(tài)特征[13-14]。

1.3.4 高糖脅迫對(duì)蜂蜜接合酵母應(yīng)急代謝產(chǎn)物的影響

取活化后的蜂蜜接合酵母6-7431，以10%接種量接入高糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中，初始pH 6.0，30 ℃發(fā)酵96 h后，用比重法測(cè)發(fā)酵液的乙醇體積分?jǐn)?shù)[15]。采用高效液相色譜法對(duì)酵母菌6-7431三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物蘋果酸、α-酮戊二酸、檸檬酸進(jìn)行分析[16-17]。以峰面積為y，有機(jī)酸含量（μg）為x，繪制檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘋果酸、α-酮戊二酸、檸檬酸的回歸方程分別為：y=6 718.8x+434.1（R2=1），y=287 820x-39 189（R2=0.999 9），y=46 355x+5 098.5（R2=0.999 8）。此外，用高碘酸鈉-乙酰丙酮法測(cè)定酵母細(xì)胞中甘油的濃度[18]，采用硫酸蒽酮法測(cè)定酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖含量[19-20]，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)檢測(cè)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 17.0和Origin 8.0軟件分別統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)和繪圖?；贒uncan法多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂蜜接合酵母的同化性能鑒定

碳源同化性能鑒定結(jié)果表明6 株蜂蜜接合酵母都能利用葡萄糖、果糖、麥芽糖，無(wú)法利用乳糖、木糖、阿拉伯糖、麥芽三糖，其中菌株6-7431、7-7651、7-7751能利用半乳糖和蔗糖進(jìn)行糖類發(fā)酵，菌株6-7431、7-7142能利用甘油、半乳糖、麥芽糖等4 種碳源。氮源同化性能鑒定結(jié)果顯示6 株菌都能同化蛋白胨和酵母提取粉，但無(wú)法同化乙酸銨和磷酸三銨，其中菌株6-7431、7-7751能夠利用硫酸銨作為氮源，7-7352、6-7431、7-7651可以同化尿素。此外，菌株6-7431、7-7551、7-7651都能在無(wú)維生素培養(yǎng)基生長(zhǎng)。蜂蜜接合酵母6-7431不僅能利用葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、半乳糖、甘油6 種碳源，還能利用尿素、硫酸銨、蛋白胨、酵母提取粉4 種氮源。綜上所述，菌株6-7431利用碳源較廣泛，且無(wú)需專門提供維生素，前期研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜接合酵母6-7431能夠耐受700 g/L的高糖質(zhì)量濃度[7]，該菌具有很好的應(yīng)用潛力。因此，選擇對(duì)菌株6-7431進(jìn)行高糖脅迫應(yīng)激代謝特性的研究。

2.2 高糖環(huán)境對(duì)蜂蜜接合酵母6-7431形態(tài)及生殖方式的影響

圖1 不同糖質(zhì)量濃度環(huán)境下蜂蜜接合酵母6-7431的菌體形態(tài)Fig. 1 Morphology of Z. mellis 6-7431 cultured at different sugar concentrations

酵母菌的生殖方式主要以無(wú)性繁殖中的芽殖為主，尤其是在良好的營(yíng)養(yǎng)與生長(zhǎng)條件下[21]。由圖1可知，隨著糖質(zhì)量濃度從100 g/L增加到550 g/L，細(xì)胞外部的滲透壓變大，蜂蜜接合酵母6-7431細(xì)胞的生殖方式基本未發(fā)生變化，一直保持出芽生殖（圖1b～g），同時(shí)細(xì)胞的形態(tài)未發(fā)生顯著的變化。隨著糖質(zhì)量濃度達(dá)到550 g/L時(shí)，菌絲內(nèi)胞漿濃縮、胞壁增厚，酵母的出芽生殖已經(jīng)停止，但是菌體完整性較好，仍然具有較好的代謝基質(zhì)及產(chǎn)乙醇的能力；質(zhì)量濃度從600～700 g/L，酵母菌菌體中部開始凹陷，隨著質(zhì)量濃度的增加，凹陷菌體的比例越來(lái)越高，但仍然具有一定的代謝活性；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到750 g/L，菌體嚴(yán)重變形，沒有完整的菌體形態(tài)，代謝能力完全被抑制。高糖環(huán)境對(duì)蜂蜜接合酵母6-7431的形態(tài)和生殖具有一定的影響，但該菌株在700 g/L的高糖質(zhì)量濃度下仍能夠保持一定的代謝活性，表明該菌存在應(yīng)對(duì)高滲環(huán)境的生理性防御機(jī)制。研究也發(fā)現(xiàn)酵母菌中存在大量應(yīng)對(duì)高糖環(huán)境的保護(hù)機(jī)制，如高滲壓甘油應(yīng)答途徑、高滲壓轉(zhuǎn)錄因子等[22-24]。因此，后續(xù)將會(huì)對(duì)該菌在高糖環(huán)境中生理性防御機(jī)制進(jìn)行探究。

2.3 高糖質(zhì)量濃度對(duì)蜂蜜接合酵母6-7431分泌乙醇的影響

表1 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)蜂蜜接合酵母6-7431產(chǎn)乙醇的影響Table 1 Effects of different glucose concentrations on ethanol production of Z. mellis 6-7431

表1顯示，不同糖質(zhì)量濃度下該菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇體積分?jǐn)?shù)具有顯著差異（P＜0.05）。糖質(zhì)量濃度100～500 g/L，發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)從7.4%增加10.5%。當(dāng)糖質(zhì)量濃度為550～750 g/L時(shí)，乙醇從9.3%下降到1.6%。糖質(zhì)量濃度在300～600 g/L的乙醇體積分?jǐn)?shù)都要高于常規(guī)糖質(zhì)量濃度100 g/L。目前開展酵母耐受高糖特性研究所用到的糖質(zhì)量濃度均在300～650 g/L范圍內(nèi)[8]，而酵母6-7431在糖質(zhì)量濃度650～700 g/L環(huán)境下仍然能夠保持菌體的完整并能夠代謝糖分泌乙醇，在乙醇濃醪發(fā)酵中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2.4 高糖脅迫對(duì)蜂蜜接合酵母積累應(yīng)急代謝產(chǎn)物的影響

2.4.1 高糖脅迫對(duì)蜂蜜接合酵母積累甘油的影響

圖2 初始糖質(zhì)量濃度對(duì)蜂蜜接合酵母6-7431積累甘油的影響Fig. 2 Effects of different initial sugar levels on the accumulation of glycerol in Z. mellis 6-7431

在接種量為10%初始pH 6.0、30 ℃條件下發(fā)酵96 h，蜂蜜接合酵母6-7431經(jīng)高糖脅迫積累的總甘油質(zhì)量濃度比常規(guī)培養(yǎng)基（100 g/L）中顯著提高（P＜0.05），其中胞內(nèi)和胞外的甘油質(zhì)量濃度都比常規(guī)培養(yǎng)基中的甘油質(zhì)量濃度高，如圖2所示。當(dāng)糖質(zhì)量濃度從300 g/L增加到600 g/L時(shí)，胞內(nèi)甘油質(zhì)量濃度和總甘油質(zhì)量濃度顯著提高（P＜0.05）。當(dāng)糖質(zhì)量濃度達(dá)到600 g/L時(shí)，胞外甘油質(zhì)量濃度和總甘油質(zhì)量濃度達(dá)到最高，分別為4 781 mg/L和22 918 mg/L，遠(yuǎn)超過常規(guī)培養(yǎng)（分別為1 845 mg/L和4 613 mg/L）。隨著糖質(zhì)量濃度從600 g/L增加到750 g/L時(shí)，胞內(nèi)甘油質(zhì)量濃度和總甘油質(zhì)量濃度顯著降低（P＜0.05）。此外，在不同的糖質(zhì)量濃度環(huán)境中，蜂蜜接合酵母胞內(nèi)外甘油質(zhì)量濃度的變化趨勢(shì)基本一致，但胞內(nèi)甘油質(zhì)量濃度始終高于胞外。在面對(duì)高糖環(huán)境時(shí)，釀酒酵母甘油的分泌量也會(huì)增加，主要是由于在高糖環(huán)境中菌體會(huì)上調(diào)甘油合成基因的表達(dá)[25]，蜂蜜接合酵母6-7431也可能利用同樣的機(jī)制應(yīng)對(duì)高糖環(huán)境，甘油可作為該菌株應(yīng)對(duì)高糖逆境的指示物質(zhì)。

2.4.2 高糖脅迫對(duì)蜂蜜接合酵母積累海藻糖的影響

圖3 初始糖質(zhì)量濃度對(duì)蜂蜜接合酵母6-7431積累海藻糖的影響Fig. 3 Effects of different initial sugar levels on the accumulation of trehalose in Z. mellis 6-7431

在相同的培養(yǎng)條件下，蜂蜜接合酵母6-7431經(jīng)高糖脅迫積累的胞內(nèi)海藻糖質(zhì)量濃度比常規(guī)培養(yǎng)基顯著增加（P＜0.05），結(jié)果如圖3所示。糖質(zhì)量濃度在300～650 g/L范圍內(nèi)，胞內(nèi)海藻糖含量與培養(yǎng)基中的糖質(zhì)量濃度呈正比，蜂蜜接合酵母6-7431積累海藻糖的變化趨勢(shì)與前期報(bào)道關(guān)于釀酒酵母積累海藻糖的趨勢(shì)較為類似，可能都是由于海藻糖合成基因的表達(dá)量增加所致[25]。當(dāng)糖質(zhì)量濃度為650 g/L和700 g/L時(shí)，胞內(nèi)海藻糖含量達(dá)到最高83.649 mg/g，同時(shí)在兩個(gè)不同糖質(zhì)量濃度下胞內(nèi)海藻糖含量無(wú)顯著變化，而當(dāng)糖質(zhì)量濃度達(dá)到750 g/L時(shí)，胞內(nèi)海藻糖含量顯著降低，這主要是由于滲透壓過高，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重皺縮（圖1），胞內(nèi)代謝被抑制。本研究顯示海藻糖作為蜂蜜接合酵母6-7431的滲透壓調(diào)節(jié)劑之一，在不超過700 g/L糖質(zhì)量濃度的環(huán)境中可以發(fā)揮作用。

2.4.3 高糖脅迫對(duì)蜂蜜接合酵母TCA中間代謝產(chǎn)物的影響

蜂蜜接合酵母6-7431在高糖脅迫下，由于培養(yǎng)基中存在氧氣，在酵母菌TCA循環(huán)代謝中會(huì)積累蘋果酸。由圖4可知，在接種量為10%、初始pH 6.0、30 ℃條件下發(fā)酵96 h，蜂蜜接合酵母6-7431在初始糖質(zhì)量濃度300～700 g/L范圍內(nèi)，培養(yǎng)基中積累蘋果酸含量比常規(guī)培養(yǎng)基增加顯著（P＜0.05）。糖質(zhì)量濃度為300～650 g/L時(shí)，蘋果酸含量與培養(yǎng)基中的糖質(zhì)量濃度呈正比，有顯著上升趨勢(shì)，糖質(zhì)量濃度為650 g/L時(shí)，蘋果酸質(zhì)量濃度最高達(dá)到371.53mg/L，遠(yuǎn)超過常規(guī)培養(yǎng)（142.13 mg/L）。當(dāng)糖質(zhì)量濃度增加到650～750 g/L時(shí)，蜂蜜接合酵母逐漸無(wú)法適應(yīng)高糖、高滲環(huán)境，TCA循環(huán)的代謝強(qiáng)度進(jìn)一步降低，蘋果酸含量顯著下降（P＜0.05）。但是糖質(zhì)量濃度升至750 g/L時(shí)，蜂蜜接合酵母中積累蘋果酸含量甚至比常規(guī)培養(yǎng)還低，此時(shí)高滲環(huán)境已經(jīng)破壞了該菌的正常代謝功能。

圖4 初始糖質(zhì)量濃度對(duì)蜂蜜接合酵母6-7431積累蘋果酸的影響Fig. 4 Effects of different initial sugar levels on the accumulation of malic acid in Z. mellis 6-7431

圖5 初始糖質(zhì)量濃度對(duì)蜂蜜接合酵母6-7431積累檸檬酸的影響Fig. 5 Effects of different initial sugar levels on the accumulation of citric acid in Z. mellis 6-7431

蜂蜜接合酵母6-7431在高糖脅迫下，也會(huì)在胞內(nèi)積累檸檬酸，但由于高濃度蘋果酸的反饋抑制作用[26]，檸檬酸積累量較低。由圖5可知，在初始糖質(zhì)量濃度300～550 g/L、接種量10%、初始pH 6.0、30 ℃條件下發(fā)酵96 h，蜂蜜接合酵母6-7431積累的檸檬酸質(zhì)量濃度比常規(guī)培養(yǎng)顯著升高（P＜0.05），在糖質(zhì)量濃度為350 g/L時(shí)，檸檬酸積累量達(dá)到最大9.14 mg/L。糖質(zhì)量濃度在350～750 g/L范圍內(nèi)，蜂蜜接合酵母胞內(nèi)檸檬酸質(zhì)量濃度逐漸降低，主要由蘋果酸的反饋抑制作用和高滲環(huán)境導(dǎo)致。同樣，在高糖環(huán)境下，蜂蜜接合酵母6-7431在胞內(nèi)積累的α-酮戊二酸也具有蘋果酸類似的變化趨勢(shì)。前期大量的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)酵母菌在高糖環(huán)境中會(huì)增加糖酵解和磷酸戊糖途徑中酶基因的表達(dá)量[27]，同樣蛋白組學(xué)的研究也發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境會(huì)促使酵母菌中參與糖酵解和磷酸戊糖途徑的酶蛋白量增加[28]，這樣會(huì)促使更多的乙酰輔酶A進(jìn)入到TCA中，研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母在高糖培養(yǎng)環(huán)境中，有氧呼吸抑制，TCA斷裂，導(dǎo)致TCA中間產(chǎn)物如α-酮戊二酸和蘋果酸不斷積累[5]，與本研究結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

在6 株蜂蜜接合酵母中，發(fā)現(xiàn)蜂蜜接合酵母6-7431對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝能力強(qiáng)于其他菌株，具有較好應(yīng)用潛力。對(duì)該菌株在高糖脅迫下的細(xì)胞形態(tài)、繁殖方式和應(yīng)激代謝產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，菌株6-7431在300～550 g/L的高糖環(huán)境中能正常出芽生殖，其代謝產(chǎn)生的乙醇、甘油、海藻糖、有機(jī)酸等物質(zhì)含量都遠(yuǎn)高于常規(guī)培養(yǎng)基的含糖環(huán)境；在550～700 g/L高糖環(huán)境中，菌株6-7431的繁殖方式由出芽生殖逐漸被抑制，代謝活動(dòng)也有所減弱，分泌產(chǎn)生的乙醇、甘油、海藻糖、有機(jī)酸等物質(zhì)含量降低；在750 g/L高糖環(huán)境中，菌株6-7431嚴(yán)重失水，基本停止發(fā)酵活動(dòng)。本研究不僅探究了高糖環(huán)境對(duì)蜂蜜接合酵母細(xì)胞形態(tài)、繁殖方式的影響，還發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境對(duì)TCA代謝中間產(chǎn)物具有重要的影響，本研究對(duì)酵母的高糖耐受機(jī)制以及酵母在乙醇濃醪發(fā)酵的研究具有重要的參考價(jià)值，但在產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制方面需要進(jìn)一步挖掘。