基于GC-MS和PCA分析黑毛茶高濕霉變過程揮發(fā)性組分

胥 偉，姜依何，田雙紅，朱 旗,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川 成都 611130)

茶樹鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、渥堆、干燥等工序制得黑毛茶[1]，生產(chǎn)上再通過不同的精制工藝將其加工成各種類型的黑茶產(chǎn)品，中國茶葉流通協(xié)會(huì)報(bào)道了2017年全國黑茶產(chǎn)量為36.3萬 t，占比13.80%，位居六大茶類第2位[2]。由于生產(chǎn)黑茶的鮮葉原料采摘通常較為粗老，加工成的黑毛茶需在庫房中存放1～2 a才能進(jìn)行精制，通過精制和拼配加工成各種黑茶成品[3]。同時(shí)，銷售后的成品黑茶，民間也有通過存放以改善其口感粗澀的習(xí)俗。但在黑毛茶倉儲(chǔ)或成品黑茶存放過程中，由于環(huán)境條件的變化，特別是在南方的梅雨季節(jié)，茶葉表面極易滋生霉菌[4-5]，輕者有風(fēng)霉味，重者失去飲用價(jià)值，甚至產(chǎn)生安全問題。

為了解高濕條件下霉變黑毛茶揮發(fā)性組分的變化規(guī)律及其呈味特征下的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究人工設(shè)定溫度和濕度環(huán)境促進(jìn)霉菌在黑毛茶上生長，通過氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法測定市場自然霉變茶樣和實(shí)驗(yàn)室人工促霉黑毛茶霉變過程中多種揮發(fā)性組分并進(jìn)行了主成分分析，為揭示高濕霉變導(dǎo)致黑毛茶風(fēng)味劣變的物質(zhì)基礎(chǔ)提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將來源于黑茶生產(chǎn)企業(yè)的黑毛茶（2016年5月產(chǎn)于湖南省桃源縣，一級(jí)，含水量（10.05±0.20）%）樣品盛于培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿開口，每份培養(yǎng)皿15 g茶樣，分別置于培養(yǎng)箱內(nèi)五層?xùn)艩罡舭迳?，每?2 份，合計(jì)60 份）并置于生化培養(yǎng)箱進(jìn)行促霉培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，相對(duì)濕度（relative humidity，RH）為90%。人工促霉培養(yǎng)過程中分別按培養(yǎng)至第0、5、7、9、11、13天依照柵狀隔板分層取樣混勻，-20 ℃密封凍存。從市場收集2 份自然霉變黑茶樣品（霉變茯磚茶：ZM1，霉變花卷茶：ZM2）用于霉變茶樣揮發(fā)性組分的對(duì)照分析。

癸酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；無水硫酸亞鐵（分析純） 長沙隆和化玻實(shí)驗(yàn)用品有限公司。無水乙醚為國產(chǎn)分析純，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室重蒸餾后用于揮發(fā)性組分的提取。

1.2 儀器與設(shè)備

GZ-150-HSII恒溫恒濕箱 韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；PB303-N電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；LDP-350型高速多功能粉碎機(jī) 浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司；KQ3200B超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司；QP2010 GC-MS儀 日本島津公司；同時(shí)蒸餾萃?。╯imultaneous distillation extraction，SDE）裝置 天長市華玻實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)性組分提取

圖1 SDE裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of SDE device

采用趙仁亮等[6]的方法。SDE裝置見圖1，在A瓶（2 000 mL圓底燒瓶）中裝入茶樣粉末50.0 g和蒸餾水1 000 mL，B瓶（250 mL圓底燒瓶）中裝入重蒸好的乙醚60 mL。在A瓶中加入內(nèi)標(biāo)癸酸乙酯1 mL（10 mg/mL），用電熱恒溫套加熱A瓶，待A瓶沸騰時(shí)開始水?。?0 ℃）加熱B瓶，蒸餾萃取45 min（B瓶沸騰時(shí)開始計(jì)時(shí)）。收集萃取液及裝置中央上層的乙醚，于-20 ℃冰箱中靜置過夜后過濾，濾液用液氮氮吹濃縮至1.0 mL，毛細(xì)管迅速轉(zhuǎn)移至1.5 mL玻璃樣品瓶中待GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS分析[7]

GC條件：DB-5MS石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氦氣（純度＞99.999%）；進(jìn)樣口溫度210 ℃；柱流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1。程序升溫：初始溫度為50 ℃，保持4 min；以2 ℃/min升溫至150 ℃，保持1 min；以5 ℃/min升溫至180 ℃，保持5 min；以10 ℃/min升溫至280 ℃，保持20 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度200 ℃；接口溫度220 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～500 u；溶劑延滯時(shí)間2.8 min；掃描方式Scan。

1.3.3 定性和定量分析

揮發(fā)性組分的定性分析采用相關(guān)文獻(xiàn)[8-11]及檢索NIST譜庫的方法進(jìn)行匹配，歸納整理相似指數(shù)大于800的化合物[12]。采用峰面積歸一化法進(jìn)行相對(duì)定量分析[13]，得出相對(duì)豐度后進(jìn)行內(nèi)標(biāo)組分值樣品間調(diào)平，得出相對(duì)定量值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行做圖，采用SPSS 22.0進(jìn)行主成分分析[14]。采用在線軟件繪制韋恩圖（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉變黑茶樣品的各類揮發(fā)性組分存在狀態(tài)

圖2 黑毛茶霉變外觀及體式顯微鏡檢圖Fig. 2 Visual appearance and stereomicroscope observation of mildewed raw dark tea

如圖2所示，隨著高濕條件培養(yǎng)時(shí)間延長，黑毛茶表面霉變程度逐步加深，體式顯微觀察表明在霉變初期肉眼無法觀察到霉變表征時(shí)，霉菌菌絲已開始在黑毛茶表面生長。通過對(duì)不同樣品間各類揮發(fā)性組分的匯總發(fā)現(xiàn)，人工霉變樣品和自然霉變樣品以酸類、醇類、酯類、醛類、酮類和烷類揮發(fā)性組分為主，其中酸類揮發(fā)性組分相對(duì)含量在霉變過程中呈上升趨勢。這與霉變黑茶審評(píng)出現(xiàn)風(fēng)霉味或有相關(guān)性。

2.2 霉變黑茶樣品的揮發(fā)性組分分析

從不同人工霉變程度的樣品中和自然霉變的樣品中共檢測出65 種香氣成分（圖3、4，表1）。人工霉變樣品以酸類、醇類、酯類和烷類4 類揮發(fā)性組分為主，自然霉變茯磚茶樣品以酸類、醇類、醛類和酯類4 類揮發(fā)性為主，自然霉變花卷茶樣品以醛類、酸類、酮類和醇類4 類揮發(fā)性組分為主。23 種單體組分在所有霉變黑茶樣本中檢出，38 種共有單體組分在人工霉變樣品中檢出，43 種共有單體組分在自然霉變樣品中檢出（圖5）。

圖3 霉變黑茶揮發(fā)性組分種類及相對(duì)定量值Fig. 3 Kinds and relative contents of volatile compounds identified in mildewed dark tea

圖5 基于不同黑茶霉變樣本的差異香氣韋恩圖Fig. 5 Venn diagram showing aroma difference among different mildewed dark tea samples

在人工促霉樣品中未霉變起始樣品揮發(fā)性組分相對(duì)含量排前4 位的分別為：棕櫚酸、葉綠醇、亞麻酸甲酯、六氫法呢基丙酮；霉變第5天揮發(fā)性組分相對(duì)含量排前4 位的分別為：葉綠醇、棕櫚酸、亞麻酸甲酯、亞油酸；霉變第7天揮發(fā)性組分相對(duì)含量排前4 位的分別為：葉綠醇、棕櫚酸、亞麻酸甲酯、六氫法呢基丙酮；霉變第9天揮發(fā)性組分相對(duì)含量排前4 位的分別為：棕櫚、葉綠醇、六氫法呢基丙酮、α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷甲醇；霉變第11天揮發(fā)性組分相對(duì)含量排前4 位的分別為：棕櫚酸、葉綠醇、亞麻酸甲酯、亞油酸；霉變第13天揮發(fā)性組分相對(duì)含量排前4 位的分別為：棕櫚酸、葉綠醇、亞麻酸甲酯、油酸；自然霉變茯磚茶揮發(fā)性組分相對(duì)含量排前4 位的分別為：棕櫚酸、2-己烯醛、正己醛、葉綠醇；自然霉變花卷茶揮發(fā)性組分相對(duì)含量排前4 位的分別為：棕櫚酸、正己醛、3-醇-1-戊烯、六氫法呢基丙酮。

表1 霉變黑茶樣品主要香氣成分組成及相對(duì)含量Table 1 Main aromatic components and relative contents in mildewed dark tea

續(xù)表1

圖6 部分揮發(fā)性單體在霉變過程的動(dòng)態(tài)變化圖Fig. 6 Dynamic changes of some volatile monomers during mildewing process

上述表明，棕櫚酸為黑茶的主體香氣組分，這與趙仁亮[6]、陸英[15]等的研究結(jié)果相一致，并認(rèn)為其對(duì)茶葉香氣的貢獻(xiàn)不大。在黑毛茶樣品中除棕櫚酸外，葉綠醇、亞麻酸甲酯、六氫法呢基丙酮、亞油酸等為其主要香氣。從圖6可以看出，多數(shù)在黑毛茶樣品中相對(duì)含量較高的揮發(fā)性組分隨霉變的過程呈下降的趨勢，如：β-二氫紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、5,6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、六氫法呢基丙酮、芳樟醇、脫氫芳樟醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯；而壬醛、角鯊烯和蘑菇醇相對(duì)含量則隨著霉變時(shí)間的延長而呈現(xiàn)增長的趨勢，有研究表明蘑菇醇是一類帶有泥土氣味或蘑菇味的香氣物質(zhì)，這與審評(píng)感官風(fēng)霉味的呈現(xiàn)存在相關(guān)性，而角鯊烯起初從角鯊的肝中分離出[16]，后有研究從真菌的菌體中亦可分離出該類物質(zhì)[17]，這可能是導(dǎo)致霉變黑毛茶角鯊烯相對(duì)含量上升的原因。壬醛、蘑菇醇及角鯊烯是黑毛茶霉變過程風(fēng)味劣變的主要因素，這與趙澤偉等[18]在研究薏米仁儲(chǔ)存過程風(fēng)味物質(zhì)變化規(guī)律相類似。

2.3 霉變黑毛茶的主成分分析

本實(shí)驗(yàn)從6 個(gè)人工促霉的黑毛茶樣品中共檢出38 種共有的揮發(fā)性成分，以38 種共有的揮發(fā)性成分的相對(duì)含量構(gòu)成的6×38的矩陣，利用SPSS軟件（22.0版本）進(jìn)行主成分分析，提取特征值大于1的主成分，結(jié)果見表2、3。第1主成分方差貢獻(xiàn)率為60.401%，其中壬醛、六氫法呢基丙酮、2,3-辛二酮、2-乙基己醇、3,7,11-三甲基-1-十二烷醇、β-環(huán)檸檬醛、長葉烯、葉綠醇、棕櫚酸甲酯、芳樟醇、鄰苯二甲酸二異丁酯、正辛醛、蘑菇醇、α-甲基-α-[4-甲基-3-戊烯基]環(huán)氧乙烷甲醇、棕櫚酸、β-紫羅蘭酮、油酸、十六甲基環(huán)八硅氧烷、異植醇、硬脂酸和雪松醇貢獻(xiàn)最大，對(duì)應(yīng)的特征向量均大于0.800。第1主成分?jǐn)?shù)據(jù)表明醛類、酮類和醇類是與黑毛茶霉變相關(guān)性系數(shù)最高的成分，是霉變黑毛茶的主體特征性揮發(fā)性組分，如葉綠醇、異植醇廣泛存在于黑茶樣本中[19-20]，是黑茶的揮發(fā)性組分主體組成部分。在香氣感官方面，由于閾值的存在，有研究表明，對(duì)黑茶起主要作用的香氣成分為醇類、醛類等物質(zhì)[21]。第1主成分中體現(xiàn)出的是壬醛的油哈味[22-23]，蘑菇醇的泥土味或蘑菇味[23]。第2主成分方差貢獻(xiàn)率為18.875%，三氯甲烷、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚和十八甲基環(huán)九硅氧烷貢獻(xiàn)最大，對(duì)應(yīng)的特征向量分別為0.972、0.868和0.820，三氯甲烷、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚具有特殊的甜味及稀溶液苯酚的甜味，由于飽和烷烴類物質(zhì)感覺閾值高，一般不易引起明顯嗅感[24]，因此第2主成分主要反映霉變黑毛茶的有機(jī)揮發(fā)性甜味，該味道起修飾作用。由于在茶葉香氣成分中尚未有報(bào)道檢出該類成分，考慮存在原因在于實(shí)驗(yàn)過程中吸附了異味導(dǎo)致；第3主成分方差貢獻(xiàn)率為13.500%，環(huán)氧芳樟醇的貢獻(xiàn)率最大，對(duì)應(yīng)的特征向量為0.960；環(huán)氧芳樟醇具有木香[25]，故第3主成分主要反映霉變黑毛茶的木香，對(duì)主體香氣成分起修飾作用；3 個(gè)主成分方差累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到92.777%，可反映霉變黑毛茶的總體情況。

表2 主成分分析特征值Table 2 Eigenvalues of principal component analysis

表3 主成分分析的特征向量Table 3 Eigenvectors of principal component analysis

圖7 霉變黑毛茶揮發(fā)性組分主成分分析載荷圖Fig. 7 PCA loading plot of volatile components in mildewed raw dark tea

結(jié)合表3和圖7可以看出，黑毛茶霉變期間的揮發(fā)性化合物的主成分分析中蘑菇醇、異植醇、葉綠醇、2,3-辛二酮、硬脂酸、壬醛、長葉烯、鄰苯二甲酸二異丁酯、β-環(huán)檸檬醛、2,6-二甲基環(huán)己醇、芳樟醇與第1主成分高度正相關(guān)，因子載荷系數(shù)較大。由于醇類物質(zhì)的感官閾值較大[26]，在感官上通常表現(xiàn)不明顯，醛類物質(zhì)通常閾值較低，對(duì)樣品整體風(fēng)味貢獻(xiàn)大[27]。由于第1主成分的方差貢獻(xiàn)率為60.401%，能夠概括大部分的霉變黑毛茶風(fēng)味化合物信息，綜合第2、3主成分的相關(guān)信息的呈味特性，從主成分分析的角度可以剖析出霉變黑毛茶呈味特性表現(xiàn)出以油哈味及泥土味為主，類似有機(jī)化學(xué)試劑甜香修飾，略帶木香的品質(zhì)風(fēng)格。

3 討 論

黑茶品質(zhì)化學(xué)多集中于品質(zhì)形成機(jī)理研究，鮮見于高濕霉變導(dǎo)致黑茶品質(zhì)劣變的品質(zhì)化學(xué)研究。本實(shí)驗(yàn)從高濕條件下誘導(dǎo)黑毛茶的霉變過程著手，針對(duì)梅雨季節(jié)的氣象條件，研究霉變黑毛茶的揮發(fā)性組分變化規(guī)律。

利用GC-MS測試技術(shù)結(jié)合主成分分析方法，對(duì)霉變黑毛茶揮發(fā)性成分含量變化進(jìn)行研究得出，人工霉變樣品中共鑒定出38 種揮發(fā)性化合物，對(duì)霉變期間揮發(fā)性組分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可以發(fā)現(xiàn)組分豐度貢獻(xiàn)最大的揮發(fā)性組分為醇類、醛類及酸類；通過對(duì)單一組分分析，結(jié)果顯示大部分帶有花香或果香的揮發(fā)性組分呈現(xiàn)降低的趨勢，而表現(xiàn)為變現(xiàn)為油哈味的壬醛[18]，蘑菇味（或稱泥土味）的蘑菇醇[28]和具有生物活性功能的角鯊烯[29]呈上升的趨勢。進(jìn)一步通過主成分分析，推斷蘑菇醇、異植醇、葉綠醇、2,3-辛二酮、硬脂酸、壬醛、長葉烯、鄰苯二甲酸二異丁酯、β-環(huán)檸檬醛、2,6-二甲基環(huán)己醇、芳樟醇與主成分1高度正相關(guān)，是反映霉變黑毛茶的特征性揮發(fā)性組分。

在針對(duì)成熟度較高的茯磚茶原料的揮發(fā)性組分研究顯示，其香氣類型主要以醇類、酯類和碳?xì)浠衔餅橹鳎犷?、苯類及醛類物質(zhì)相對(duì)含量也較高，這與本研究的未霉變樣品的香氣數(shù)據(jù)規(guī)律一致。而在霉變樣品中，發(fā)現(xiàn)賦予茯磚茶濃郁花果香的萜烯類物質(zhì)[8]含量較低，而導(dǎo)致霉變黑毛茶的內(nèi)含物質(zhì)酸敗的酸類及醇類物質(zhì)含量較大。表明在黑毛茶霉變過程中，高濕條件及微生物的作用誘導(dǎo)醇及酸類物質(zhì)的產(chǎn)生，對(duì)黑茶品質(zhì)帶來不利的影響。這也與楊蕾[30]在研究煙草高濕霉變條件下?lián)]發(fā)性組分變化規(guī)律相一致。由于樣本量的受限，表征霉變黑茶風(fēng)霉味的化學(xué)本質(zhì)有待進(jìn)一步研究。