不同保存時間的血漿及血清中外泌體生物學(xué)特性的對比

王婷婷，韓 影，高芳芳，葉 磊，張育軍

0 引 言

外泌體（exosomes）是由細(xì)胞向細(xì)胞外主動分泌的具有典型磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的一種囊泡，其大小介于30～200 nm之間［1-2］。外泌體內(nèi)含有細(xì)胞來源的各種蛋白質(zhì)、核酸及脂質(zhì)分子，在細(xì)胞-細(xì)胞間物質(zhì)傳遞及信息交流具有重要作用，參與了多種疾病的發(fā)生［3-4］，外泌體亦可作為藥物載體及疾病的治療靶點［5］。

目前所研究的外泌體主要來自于各種體液如血液、尿液、腹腔積液、膽汁等及細(xì)胞上清液中［6］。由于外泌體的獲取及操作較為簡便，且內(nèi)容物豐富，因此已成為臨床及基礎(chǔ)研究的熱點，對于疾病的診斷和治療具有不可比擬的優(yōu)勢。外泌體的提取、鑒定已有較多研究報道［7-8］，經(jīng)典的提取方法有超速離心法、PEG沉淀法及超濾法等。但是其保存方法、保存時間、保存效果的評估研究較少［9］，體液保存時間及溫度對于其中外泌體的生物學(xué)特性的影響亦鮮少報道。由于臨床取材具有例數(shù)少、頻次高的特點以及生物樣本庫的廣泛開展，使得樣本保存至超低溫冰箱批量處理成為可能。因此本研究主要圍繞保存在超低溫環(huán)境下的不同時間血漿及血清樣本中外泌體的生物學(xué)特性進(jìn)行展開。主要觀察不同保存時間的血漿及血清中外泌體的大小、密度、形態(tài)及陽性蛋白表達(dá)有無改變。

1 材料與方法

1.1 材料本研究使用新鮮采集及1、3、5年前收集后凍存在-80℃冰箱的血漿及血清各3份，均來自于北京大學(xué)人民醫(yī)院生物樣本庫。血漿及血清外泌體提取使用SBI Exoquick試劑盒，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL發(fā)光液來自美國Thermo Fisher公司。外泌體中蛋白Western blot所用一抗TSG101和CD63抗體均使用Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 外泌體提取血漿及血清外泌體提取使用Exoquick試劑盒，操作方法遵循說明書。具體操作步驟如下：血清血漿4℃，10 000×g離心10 min預(yù)處理，隨后將離心得到的上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，按照250 μL血清血漿的體積加63 μL Exoquick試劑的配比加入Exoquick試劑，4℃靜置30 min。離心1500×g，30 min，棄上清，得到的沉淀用 200 μL 1x PBS重懸即為外泌體。

1.2.2 外泌體粒徑分析經(jīng)過Exoquick試劑盒提取得到的外泌體取50 μL加950 μL 1xPBS進(jìn)行1∶20稀釋，使用0.22 μm濾膜過濾外泌體稀釋液。過濾后的外泌體懸液直接使用納米粒度顆粒跟蹤分析儀（NanoSight NS 300）進(jìn)行粒徑檢測，使用軟件NTA 3.2 Dev Build 3.2.16進(jìn)行分析。NanoSight NS 300配備sCMOS相機(jī)進(jìn)行拍攝，激光類型為Blue488，快門317，增益15。每個樣本重復(fù)3次。

1.2.3 外泌體透射電鏡本研究采用1%醋酸乙酰鈾負(fù)染法對外泌體進(jìn)行透射電鏡觀察。外泌體電鏡制備方法參考SBI公司提供的‘TEM Serum Procedure with Exoquick’電鏡操作流程。具體操作步驟如下：血漿及血清冰上融化后，取500 μL加100 μL Exoquick試劑，4℃放置2 h以上。隨后3000 r/min離心 20 s，棄上清，加 450 μL 1xTBS緩沖液溶解。取10 μL稀釋10倍后，4%多聚甲醛固定10 min。將不同樣品的外泌體懸浮液（約5 μL）滴至包被聚醋酸甲基乙烯脂的碳化銅網(wǎng)上，室溫放置4～5 min，濾紙吸干殘余液體。滴加負(fù)染液1%水醋酸雙氧鈾（5 μL）于銅網(wǎng)上反應(yīng)1 min，然后用濾紙吸干，清洗2遍。使用透射電鏡JEM1400PLUS（JEOL USA Inc.，Peabody，MA）高壓120 kV及UltraScan 4000電荷耦合攝像機(jī)及First Light Digital Camera Controller（Gatan Inc.，Pleasanton，CA）進(jìn)行拍照。

1.2.4 Western blot法參照文獻(xiàn)［10］，選擇膜結(jié)合蛋白TSG101和跨膜分子CD63作為外泌體的外泌體陽性表達(dá)標(biāo)志物。使用Western blot對外泌體中的蛋白進(jìn)行檢測，對比分析同樣體積、不同保存時間的血漿及血清外泌體蛋白的表達(dá)變化情況。血漿及血清中提取后的外泌體取50 μL加等量的RIPA裂解液進(jìn)行裂解，BCA法測定蛋白濃度，上樣量70 μg，使用12.5%的分離膠及5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE膠蛋白電泳，恒壓80 mV，120 min。外泌體標(biāo)志蛋白CD63轉(zhuǎn)膜條件為恒流200 mA，70 min，TSG101轉(zhuǎn)膜條件為200 mA，100 min。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗孵育過夜。1×TBST洗3遍后，抗兔二抗室溫孵育1 h，1×TBS洗3遍后ECL發(fā)光。

2 結(jié) 果

2.1 不同保存時間的血漿及血清外泌體數(shù)量及大小保存時間達(dá)3年的血漿中的外泌體粒徑較大（30～200 nm）。外泌體粒徑大小的峰值整體較?。ǎ?00 nm），考慮原因可能與提取方法有關(guān)。此外，1 mL血清或血漿能提取到的外泌體數(shù)量在1×1010以上，其中血清中外泌體數(shù)量較血漿中數(shù)量略高，見表1。

2.2 不同保存時間的血漿及血清外泌體形態(tài)通過外泌體透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)不同保存時間的外泌體形態(tài)無太大變化，均為圓形或類圓形結(jié)構(gòu)，杯托狀結(jié)構(gòu)不典型，見圖1。

表1 不同保存時間血漿及血清中外泌體的粒徑、數(shù)量分析(xˉ±s)Table 1 Diameters and numbers of the exosomes isolated from the plasma and serum and preserved for different periods of time(xˉ±s)

2.3 不同保存時間的血漿及血清外泌體蛋白表達(dá)情況保存5年的血漿及血清外泌體中TSG101的表達(dá)發(fā)生明顯降低，CD63分子在保存時間超過1年的血漿及血清外泌體中均發(fā)生明顯降低，且保存時間越久，其表達(dá)水平越低。此外，對比血漿及血清外泌體中的蛋白表達(dá)情況可以發(fā)現(xiàn)血清中外泌體蛋白表達(dá)量，見圖2。

圖1 鏡下觀察不同保存時間的血漿及血清中的外泌體Figure1 Transmission electron microscopic images of the exosomes isolated from the plasma and serum and preserved for different periods of time

圖2 不同保存時間的血漿及血清中外泌體標(biāo)志性蛋白表達(dá)情況Figure 2 Expression of the protein biomarkers of the exosomes isolated from the plasma and serum and preserved for different periods of time

3 討 論

提純好的外泌體保存溫度及保存時間對其生物學(xué)特性的影響已有相關(guān)報道。Park等［9］分別對比了卡波式肉瘤感染的人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上清液中提取的外泌體在37℃、4℃、-20℃及-70℃的不同保存溫度下的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性改變，其發(fā)現(xiàn)隨著保存時間（1～25d）的延長，外泌體的直徑減小，密度亦降低（-70℃除外）。其CD63及CD81的蛋白表達(dá)在37℃環(huán)境下隨時間延長而發(fā)生減弱，不同保存條件下的外泌體處理正常人類靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)在37℃和-20℃時隨著時間延長其補(bǔ)體激活功能逐漸降低。另一篇報道指出，外泌體提取后保存至4℃和-80℃條件下會導(dǎo)致其直徑變大，且不同保存條件下其外泌體內(nèi)含蛋白可檢測到的種類及數(shù)量存在較大差異［11］。Kalra等［12］報道外泌體中TSG101蛋白在超低溫條件下存放90d依然可被檢測到，然而更長時間的研究尚未報道。我們的研究進(jìn)行了不同保存時間下血漿及血清中外泌體中蛋白表達(dá)的對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)保存時間5年的血漿外泌體中TSG101及CD63表達(dá)明顯降低，此種變化在血清中變化更為明顯，而保存時間較短的血漿及血清中外泌體蛋白改變不明顯。因此進(jìn)行外泌體中蛋白表達(dá)研究時血漿或比血清更具優(yōu)勢。此外，提純后的血漿外泌體保存一定時間后或不如將血漿保存至超低溫條件待實驗準(zhǔn)備好后進(jìn)行批量提取再進(jìn)行相應(yīng)研究。除了對比不同保存時間血漿及血清中蛋白的表達(dá)改變情況，本研究還通過外泌體粒徑分析、電鏡下觀察外泌體形態(tài)改變綜合評估了不同保存時間下外泌體物理特征的改變。我們發(fā)現(xiàn)不同保存時間的外泌體形態(tài)無太大變化，均為圓形或類圓形結(jié)構(gòu)，杯托狀結(jié)構(gòu)不典型，可能與外泌體提取方法及透射電鏡制片方法有關(guān)。但是其大小和形態(tài)均符合外泌體的一般表現(xiàn)，因此說明保存時間及樣本類型對外泌體的大小和形態(tài)學(xué)變化無太大影響。

Chen等［13］的研究中表明保存時間超過5年的血漿中外泌體磷酸化蛋白尚能被檢測，我們選取TSG101胞質(zhì)蛋白和CD63跨膜蛋白作為外泌體蛋白穩(wěn)定性的指示物，僅具有一定的代表性，未進(jìn)一步進(jìn)行磷酸化蛋白的穩(wěn)定性檢測，此為本研究的不足之處。外泌體內(nèi)除了含有蛋白質(zhì)亦具有豐富的RNA及DNA等核酸物質(zhì)［14］，不同的外泌體分離方法和RNA提取方法分離及提取出的外泌體中RNA表達(dá)具有一定的差異性［7，15］，然而保存時間對于外泌體中RNA表達(dá)的影響目前尚無相關(guān)報道。由于本研究中血漿及血清的體積較小，未能進(jìn)行RNA的檢測，亦為本研究不足之處。

外泌體提取方法目前已有較多研究，超速離心法目前仍為最經(jīng)典的方法，然而因其得率低、對樣本量要求較高及超速離心對外泌體的損傷影響限制了其廣泛的應(yīng)用［16］。本研究使用基于PEG沉淀原理的Exoquick試劑盒法提取外泌體，充分提升了其得率，降低了初始樣本要求體積并能有效保護(hù)外泌體的形態(tài)完整性。有研究表明不同提取方法對于外泌體的物理學(xué)特性及生物學(xué)功能無太大影響［7］，另一篇關(guān)于外泌體提取方法的研究表明Exoquick試劑盒法與超速離心法提取的外泌體純度及質(zhì)量均較高［8］。因此，對于樣本較珍貴且樣本量有限的研究推薦使用試劑盒法進(jìn)行外泌體提取。

綜上，本研究對比了不同保存時間的血漿及血清中外泌體的生物學(xué)特性，表明保存時間對于外泌體大小及形態(tài)無明顯影響，但是其標(biāo)志性蛋白TSG101、CD63的表達(dá)隨著保存時間的延長具有明顯降低，尤其在保存時間超過3年時，因此進(jìn)行外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)的相關(guān)研究時推薦新鮮提取立即實驗。外泌體分布于各種體液中，其取樣過程對于臨床患者具有很大的便捷性及依從性，在基于液體活檢的輔助診斷中具有重要價值［17］，外泌體亦可作為疾病治療的藥物載體及治療靶點［18］，對于精準(zhǔn)醫(yī)療的實施及發(fā)展具有重要的促進(jìn)作用。在臨床及基礎(chǔ)科學(xué)研究中，常累積大批血清或血漿樣本進(jìn)行相應(yīng)的外泌體檢測，因此多方面評估其保存時間對于外泌體生物學(xué)特性的影響具有重要的指導(dǎo)意義。

血漿和血清的保存時間對其中外泌體的形態(tài)特征無大影響，但是隨著保存時間延長，外泌體中的蛋白標(biāo)志物TSG101和CD63含量發(fā)生降低。這提示我們進(jìn)行外泌體蛋白的相關(guān)研究時最好新鮮提取外泌體立即進(jìn)行下一步實驗。