蘇燕妮

自19世紀(jì)40年代末基因?qū)蚣僬f的誕生就標(biāo)志著分子生物學(xué)手段在植物抗病性研究中奠定了基礎(chǔ)。植物抗病基因反映了植物對特體病原體的識別以及植物能否啟動防衛(wèi)反應(yīng)的能力，抗病基因編碼的產(chǎn)物決定了植物是否能識別特異性的病原菌，同時也在對植物防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)有著直接或間接的影響。植物中存在著抗侵染、抗擴(kuò)展、預(yù)成抗性、誘導(dǎo)抗性、結(jié)構(gòu)抗性、生化抗性、過敏性壞死反應(yīng)和系統(tǒng)獲得性抗性等。在1992年第一個抗病基因（Hml）被分離后，陸續(xù)有很多抗病基因被分離。

1 植物抗病基因類型

大多數(shù)植物抗病基因可根據(jù)其保守結(jié)構(gòu)的不同分為五大類。通過對已經(jīng)克隆的抗病基因的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)抗病基因之間具有一些共同的結(jié)構(gòu)域，即：核苷酸結(jié)合位點（NBS，nucleotide）、富亮氨酸重復(fù)（LRR，leucine-rich repeat）、跨膜結(jié)構(gòu)域（TM，transmembrane domain）、絲氨酸-蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)（STK， serine/threonine kinases）、亮氨酸拉鏈（LZ，leucine）、Toll-白介素-1區(qū)域等（TIR，toll-interleukin-1 region）。

2 植物抗病基因研究方法

近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展并且與基因組學(xué)的結(jié)合使得基因克隆技術(shù)不斷創(chuàng)新，不斷進(jìn)步，很多種基因克隆方法也在此過程中產(chǎn)生。

2.1 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)（Transponson tagging）

轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)利用轉(zhuǎn)座子這樣的一段可以從一個基因座位移動到其它基因座位的特異DNA片段作為探針獲得完整基因的技術(shù)方法。它很早就已發(fā)展成為一個高效率研究功能基因的主要工具之一，此項技術(shù)在后來的研究中又陸續(xù)得到了很多植物的抗病基因，比如番茄抗葉霉病基因Cf-9、Cf-4、Cf-5;煙草花葉病毒基因N;番茄抗花葉病毒基因Tm-2;亞麻的抗葉銹病基因L6等。

2.2 染色體移步法（Chromo

some Walking）

染色體步移技術(shù)是一種可以得到與已知基因序列相鄰的未知基因序列的方法。根據(jù)已公布的基因或已知的分子標(biāo)記連續(xù)步移，獲得重要調(diào)控基因，例如啟動子的克隆及其功能的研究;應(yīng)用該方法獵取目標(biāo)植物中某段基因的非保守區(qū)域，就能得到一條相對完整的目的基因序列。此項技術(shù)適用于大多數(shù)基因組序列尚未知曉的生物，如果想得到某個區(qū)域兩端的DNA序列，染色體步移法是個高效的途徑。

2.3 圖位克隆法（Map-based cloning）

根據(jù)目標(biāo)基因序列在相應(yīng)染色體上的位置進(jìn)行克隆的方法，又稱定位克隆法（positional cloning）。經(jīng)常在基因表達(dá)產(chǎn)物未知和沒有適宜的相對表型的產(chǎn)物功能信息的情況下應(yīng)用，該項技術(shù)經(jīng)常與分子標(biāo)記等相關(guān)技術(shù)配套使用，隨著其他幾項技術(shù)的日趨成熟，圖位克隆法的應(yīng)用范圍越來越廣泛。通過與序列數(shù)據(jù)庫以及分子標(biāo)記方法的結(jié)合，人們已經(jīng)克隆得到了很多抗病基因，以小基因組的模式植物為主，比如番茄抗霜霉病基因Pto。這種方法同樣也存在著一定的局限性，在實際中因其構(gòu)建的克隆群難度較大，提供不了基因功能的相關(guān)信息以及精細(xì)作圖成本太高等問題都限制了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。

2.4 mRNA差異顯示技術(shù)（mRNA differetial display）

克隆差異性表達(dá)基因的高效率且方便的途徑。目前已廣泛應(yīng)用于對比植物差異表達(dá)基因和尋找抗病基因中。mRNA差異顯示技術(shù)具有高效、靈敏度高、操作簡單、周期短、可逐步驗證等優(yōu)點，應(yīng)用該技術(shù)可同時比較多個樣品基因表達(dá)間的差異，對RNA量的要求也不高，操作周期一般在8天左右。隨著該項技術(shù)的不斷改進(jìn)，mRNA差異顯示技術(shù)可以在克隆差異基因的基礎(chǔ)上用來尋找抗病基因。

2.5 同源序列克隆法

關(guān)于抗病基因的研究一直以來都是人們研究的熱點，伴著現(xiàn)代分子生物學(xué)等相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，人們應(yīng)用圖位克隆法（Map-based cloning）和轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法（Transposon tagging）克隆出許多有意義的植物抗病基因，這對植物生產(chǎn)以和各個學(xué)科的發(fā)展具有深遠(yuǎn)的意義。但是這兩種方法都有一定的局限性，只能克隆基因組較小，遺傳圖譜和物理圖譜有高的分辨率的植物基因，而不適用于基因組大，重復(fù)序列多，分子標(biāo)記圖譜比較難構(gòu)建的植物中。而同源序列克隆法是根據(jù)抗病基因的表達(dá)的蛋白功能保守區(qū)設(shè)計合適的引物，并擴(kuò)增目標(biāo)基因組DNA或者cDNA，從而從植物體中得到一個或幾個結(jié)構(gòu)上與抗病基因相關(guān)的片段。在R基因庫中篩選得到的片段，比對序列的同源性，分析得到的序列與已知R基因是否有聯(lián)系，進(jìn)一步得到抗病基因相關(guān)序列的目的。該方法的理論依據(jù)是雖然抗病基因識別的病原種類有區(qū)別，但是抗病基因編碼的蛋白質(zhì)具有同源序列，因此，根據(jù)這些同源序列設(shè)計引物尋找抗病目的基因是可行的。當(dāng)然還有很多通過生物信息學(xué)方法和高通量測序的方法來尋找植物抗病相關(guān)基因，這些方法都會在人們對抗病基因探索的過程中起到至關(guān)重要的作用。