劉君穎 張麗慧 桑 鋒 馬慶亮 劉雪濤 趙文霞

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 (河南 鄭州， 450000)

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的患病率有逐年升高趨勢，已經(jīng)成為21世紀(jì)第二大肝臟疾病[1]。NASH是向肝纖維化、肝硬化、肝癌發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中促炎抑炎因子起到重要推動作用。有效治療NASH，控制炎性細(xì)胞因子失衡，可逆轉(zhuǎn)或延緩非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的進(jìn)展[2,3]?；奠顫窕钛绞勤w文霞教授近30年治療NASH的經(jīng)驗方，前期臨床及動物實驗研究表明，該方能減輕肝臟炎性反應(yīng)，改善肝細(xì)胞脂肪沉積，具有良好的保肝、降酶、抗纖維化作用[4，5]。通過對脂肪變細(xì)胞的研究，進(jìn)一步明確化痰祛濕活血方對促炎抑炎因子的影響，探討其抗炎作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 儀器：MK3酶標(biāo)儀(Thermo Fisher)，BX- 43光學(xué)顯微鏡(Olympas)、ABI7500熒光定量PCR儀(life technology公司)、TGL-16M低溫冷凍離心機(湘儀)、SW-CJ-1D單人凈化工作臺(瀘凈凈化)、HR40-Ⅱ A2生物安全柜(Haier)、SMA4000超微量分光光度計(Merinton)。

試劑：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)檢測試劑盒(伊萊瑞特，E-BC-K235)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測試劑盒(伊萊瑞特，E-BC-K236)、甘油三酯(TG)含量檢測試劑盒(索萊寶，BC0625)，肝癌壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、IL-10ELISA試劑盒(均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，貨號分別為 E-EL-H2306c、E-EL-H0149c、E-EL-H0102c、E-EL-H0103c)。熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染主要實驗材料：引物(life technology公司合成)，BestarTMqPCR RT Kit(德國DBI，DBI-2220)，BestarTMSybrGreen qPCR mastermix(德國DBI，DBI-2043)，96孔板(美國life technology)。

1.2 中藥含藥血清的制備 化痰祛濕活血方組成：澤瀉、海藻、決明子、郁金、丹參、山楂、柴胡、水飛薊，以上藥物均由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供(批號分別為13120145、14040236、14070004、14010261、14010086、1420130、14010145、14010256)。

SD雄性大鼠60只，體重(200±10)g，動物合格證號：SCXK(豫)2010-0002；動物使用許可證號：SCXK(豫)2010-0001。隨機分為化痰祛濕活血方組和空白組，每組30只。化痰祛濕活血方組大鼠按照每次0.5 ml/100 g體重灌胃化痰祛濕活血方藥煎劑2次/d，連續(xù)3 d；空白組大鼠灌服去離子水。最后一次灌胃結(jié)束后1 h，采集大鼠腹主動脈血，離心，同組大鼠的血清混合，0.22 μm濾膜過濾，滅活、分裝后儲存于-70℃冰箱中。

1.3 脂肪變肝細(xì)胞模型復(fù)制及分組 常規(guī)培養(yǎng)L02細(xì)胞，采用油酸復(fù)制脂肪變肝細(xì)胞模型，油紅O染色確定造模是否成功[6]。細(xì)胞分為空白組、模型組、脂聯(lián)素(ADPN)組、化痰祛濕活血方含藥血清組(簡稱中藥組)。除空白組L02細(xì)胞加入等體積量的DMSO(二甲基亞砜)外，其余各組細(xì)胞均以終濃度為40 μmol/L的油酸處理24 h造模，ADPN組細(xì)胞加入ADPN，中藥組細(xì)胞加入化痰祛濕活血方含藥血清，孵育24 h收集細(xì)胞及上清液備測。

1.4 指標(biāo)檢測 ①化學(xué)發(fā)光法檢測各組細(xì)胞上清液中ALT、AST、TG含量；②采用ELISA檢測試劑盒檢測細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和OD值計算各組細(xì)胞TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10值。③采用熒光定量RT PCR方法檢測各組細(xì)胞中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 mRNA的表達(dá)；提取各組細(xì)胞總mRNA，測定其濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計并合成引物，采用熒光定量檢測試劑盒于熒光定量PCR儀上擴增，根據(jù)Ct值計算TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 mRNA的相對表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組L02細(xì)胞上清液中ALT、AST、TG檢測結(jié)果 見表1。

表1 各組L02細(xì)胞上清液中ACT、AST、TG結(jié)果比較

2.2 各組L02細(xì)胞上清液中炎癥因子檢測結(jié)果 見表2。

表2 各組L02細(xì)胞上清液中炎癥因子檢測結(jié)果比較

2.3 各組L02細(xì)胞TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 mRNA相對表達(dá)量比較 見表3。

表3 各組L02細(xì)胞上清液中24 h TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 mRNA相對表達(dá)量比較

3 討論

NASH是向肝纖維化、肝硬化、乃至肝癌發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，10～15年內(nèi)肝硬化發(fā)生率高達(dá)15%～25%[7,8]。NASH的發(fā)生、發(fā)展與致炎因子和抗炎因子失衡有重要關(guān)系。IL具有非特異性免疫調(diào)節(jié)作用，是炎性反應(yīng)中起重要作用的細(xì)胞因子。促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6等可引起炎性反應(yīng)，抗炎因子IL-10具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。TNF-α的表達(dá)量與NASH嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，能激活肝臟Kupffer細(xì)胞，釋放IL-6、IL-8等大量炎性因子，引發(fā)瀑布反應(yīng)，促進(jìn)肝細(xì)胞炎性反應(yīng)及肝細(xì)胞壞死[9]。IL-1可活化多種蛋白激酶，參與肝組織纖維化過程[10]。IL-6是單核及巨噬細(xì)胞等對TNF-α、IL-1反應(yīng)的產(chǎn)物，促進(jìn)肝臟炎性損傷及纖維化。另一方面，IL-6又能反向促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α等，加重炎癥反應(yīng)[10]。IL-6在炎癥環(huán)境中含量豐富，也是最典型的原致瘤細(xì)胞因子之一，可影響細(xì)胞增殖、存活、分化、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、炎癥和代謝。臨床研究也證實IL-6信號通路的阻斷是治療炎癥性疾病的有效方法。IL-10是一種多功能負(fù)性調(diào)節(jié)因子，具有抗炎及抗纖維化作用[12,13]。IL-10可控制免疫細(xì)胞激活，抑制促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6，改善脂質(zhì)過氧化和胰島素抵抗，減少膠原生成，介入肝臟纖維化重塑。

趙文霞教授認(rèn)為“痰濕內(nèi)停、瘀血阻絡(luò)、肝失條達(dá)”是 NASH 發(fā)病的主要病機，因此確立了“化痰祛濕活血”的基本治則，制定化痰祛濕活血方。方中澤瀉利水滲濕，丹參活血化瘀，共為君藥；郁金行氣活血，海藻軟堅消痰，山楂消食化瘀，共為臣藥；決明子清肝利濕，水飛薊清熱舒肝，共為佐藥；柴胡疏肝解郁、引藥歸經(jīng)為使藥。全方共奏化痰祛濕活血之功。前期研究證實，該方能有效改善NASH患者肝臟炎癥[14,15]，可下調(diào)NASH大鼠炎性因子TNF-α等的表達(dá)，減輕肝臟炎癥，改善肝組織脂肪變程度，抗肝纖維化[16～20]。本實驗通過復(fù)制L02脂肪變細(xì)胞模型，采用ADPN及化痰祛濕活血含藥血清進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞炎性反應(yīng)及脂肪變程度均高于空白組，細(xì)胞及培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)也明顯增加，IL-10的表達(dá)則顯著減少，這提示L02脂肪變細(xì)胞的炎性反應(yīng)與上述炎性因子的表達(dá)相關(guān)。ADPN及化痰祛濕活血方含藥血清干預(yù)后，細(xì)胞及培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)也明顯降低，IL-10的表達(dá)則明顯升高，提示化痰祛濕活血方可通過調(diào)控炎癥因子表達(dá)起到改善脂肪變細(xì)胞炎癥的作用。

綜上所述，本研究從細(xì)胞因子層面探討化痰祛濕活血方治療NASH的作用機制，發(fā)現(xiàn)化痰祛濕活血方可能通過下調(diào)IL-1、IL-6、TNF-α以及上調(diào)IL-10表達(dá)，使脂肪變L02細(xì)胞炎性反應(yīng)程度降低，從而起到防治NASH的作用，在此過程中有哪些信號通路參與尚需進(jìn)一步研究。