劉煜珺 張雨晴 高 原，2 李喚宇 牟光慶 妥彥峰*

（1 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連116034 2 大連市益生菌功能特性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧大連116034）

自由基是含有單獨(dú)的沒有配對(duì)電子的分子或分子碎片[1]。 當(dāng)自由基奪取機(jī)體細(xì)胞大分子、電子時(shí)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、細(xì)胞、DNA、RNA 等結(jié)構(gòu)受損。由于疾病、感染、輻射等不利環(huán)境造成機(jī)體本身防御體系不能發(fā)揮有效的清除活性氧作用， 或有外源性自由基入侵導(dǎo)致活性氧水平超出正常范圍，便會(huì)出現(xiàn)活性氧損傷。

在穩(wěn)定的條件下機(jī)體會(huì)有特定的防御和清除系統(tǒng)，包括抗氧化酶系統(tǒng)和非抗氧化酶系統(tǒng)，抗氧化物酶可與由氧化應(yīng)激引起的自由基發(fā)生反應(yīng)，從而阻止細(xì)胞的損傷， 常見的防御抗氧化酶系包括：超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等[2-3]。

一些乳酸菌胞外多糖（LAB EPS）具有清除自由基、抗氧化等重要的生理功能[4]。BJ Seo 等[7]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌YML009 胞外多糖中部分純化的EPS（5～40mg/mL）具有清除DPPH 自由基的抗氧化功效，DPPH 自由基清除率達(dá)到44.73%，且清除率越大，抗氧化能力越強(qiáng)。Xin Wang 等[5]報(bào)道隨著植物乳桿菌KX041（L. plantarum KX041）的EPS 作用濃度增加，對(duì)ABTS 自由基的清除率也隨之增高。李景艷[6]通過DPPH 自由基、羥自由基、超氧陰離子清除能力從15 株乳酸菌中篩選出一株產(chǎn)高抗氧化活性胞外多糖的菌株植物乳桿菌LP6， 該菌株胞外多糖可以提高H2O2氧化損傷PC12 細(xì)胞的存活率。

本試驗(yàn)中從8 株乳桿菌所產(chǎn)胞外多糖中篩選出具有較高抗氧化活性的胞外多糖， 評(píng)價(jià)其對(duì)ABAP 損傷的人結(jié)腸癌腺細(xì)胞系HT-29 細(xì)胞存活及抗氧化酶系表達(dá)的影響， 旨在探究乳桿菌胞外多糖抗氧化的機(jī)理。

1 試驗(yàn)方法

1.1 試驗(yàn)試劑

RPMI-1640 培養(yǎng)液、青霉素和鏈霉素，美國Gibco 公司；水溶性維生素E（Trolox）、熒光素鈉（Fluorescein sodium，F(xiàn)L）、2，2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2，2′-Azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride，ABAP）、TPTZ（2，4，6-tripyridyl-striazine）、ABTS（2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid））、鄰二氮菲，均購自于美國Sigma 公司；硫酸亞鐵，天津市大茂試劑廠；單糖標(biāo)準(zhǔn)品， 購于大連美侖生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體、SOD1 抗體、CAT 抗體， 均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司； 辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG（HRP）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（HRP）、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 菌株及細(xì)胞來源

組織細(xì)胞： 本試驗(yàn)所用人結(jié)腸癌腺細(xì)胞HT-29，購自中國科學(xué)院上海典藏細(xì)胞庫。

試驗(yàn)菌株：本試驗(yàn)所采用的菌株干酪乳桿菌-Y3 （Lactobacillus casei-Y3）， 干酪乳桿菌-Y4（L.casei-Y4），干酪乳桿菌-Y16（L.casei-Y16），植物乳桿菌-Y41（Lactobacillus planterum-Y41），植物乳桿菌-Y42（L.planterum-Y42），植物乳桿菌-Y44（L.planterum-Y44）， 干酪乳桿菌-Y （L.casei-Y35）為大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室所保藏菌株，分離自大連傳統(tǒng)晾曬魚制品。

1.3 多糖含量及蛋白濃度的測定

胞外多糖的提取： 乳桿菌胞外多糖的提取參照Di 等[7]方法稍加修改測定，主要包括菌體擴(kuò)大培養(yǎng)、除菌、濃縮、除蛋白、乙醇沉淀、透析和凍干7 個(gè)步驟。

利用苯酚硫酸法測定多糖的含量， 稱取凍干的8 株菌株的胞外多糖1 mg 溶于1 mL 超純水，具體按照參考文獻(xiàn)[8]的方法稍加修改進(jìn)行操作。

采用考馬斯亮藍(lán)方法測定蛋白含量，將1 mg/mL 的多糖溶液稀釋10 倍，以1∶5（V/V）體積加入考馬斯亮藍(lán)溶液，具體按照Wang 等[9]的方法稍加修改進(jìn)行操作。

1.4 胞外多糖體外抗氧化能力測定方法

1.4.1 DPPH 自由基清除能力測定 將8 株菌所產(chǎn)胞外多糖質(zhì)量濃度配制成為0.5 mg/mL 溶液，DPPH 自由基清除能力的測定具體按照Zhang 等[10]的方法稍加修改進(jìn)行操作，DPPH 自由基清除率按照如下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：Ai——1 mL DPPH-無水乙醇+1 mL 多糖溶液吸光度；Aj——1 mL 超純水+1 mL 多糖溶液吸光度；Ac——1 mL DPPH-無水乙醇+1 mL 超純水吸光度。

1.4.2 ABTS 自由基清除能力測定 8 株菌所產(chǎn)胞外多糖的ABTS 自由基清除能力的測定方法參考Li 等[11]的方法稍加修改進(jìn)行操作。 首先將上述凍干粗多糖配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的多糖溶液，之后配制ABTS 溶液：將ABTS 和過硫酸鉀分別配制成7 mmol/L 和2.45 mmol/L 的水溶液，按1∶1 體積比混合均勻后避光靜置16 h。 在測定之前， 將ABTS 自由基溶液用pH 7.4 的0.2 mol/L PBS 稀釋，測定波長為734 nm，使得最后的吸光值為0.70±0.02。 將0.4 mL 的多糖溶液加入到3 mL稀釋后的ABTS 溶液中，搖晃1 min 混合均勻使反應(yīng)完全，黑暗中靜置6 min。在波長為734 nm 處最終溶液吸光度。 空白組： 等體積的超純水代替樣品。 計(jì)算ABTS 清除能力的公式如下：

式中：As——含有樣品組的吸光度；Ac——只含ABTS+溶液的空白吸光度。

1.4.3 羥自由基清除能力的測定 采用Li 等[12]報(bào)道的Fenton 方法，稍加修改測定8 株菌所產(chǎn)胞外多糖羥自由基清除能力。 稱量干燥器中的8 種乳桿菌胞外粗多糖，配制成4 mg/mL 的多糖溶液。樣品組：1 mL 0.02 mol/L PBS （pH 7.4）溶液依次加入0.5 mL 2.5 mmol/L 鄰二氮菲溶液、0.5 mL 2.5 mmol/L FeSO4溶液和0.5 mL 20 mmol/L H2O2溶液，充分混勻后再加入0.5 mL 樣品，作為樣品組As；用0.5 mL 蒸餾水取代0.5 mL 樣品，作為對(duì)照組Ac；1 mL 蒸餾水取代樣品和H2O2， 作為空白組Ab。 37 ℃恒溫水浴1 h，于536 nm 處測定吸光值。使用以下公式計(jì)算羥自由基清除率：

式中：As——含有樣品和H2O2組的吸光值；Ac——不含樣品但含H2O2的吸光值；Ab——不含有樣品和H2O2組的吸光值。

1.4.4 鐵離子還原力（FRAP）的測定 根據(jù)Benzie 和Strain 的方法[13]稍作修改，進(jìn)行對(duì)8 株菌所產(chǎn)胞外多糖鐵離子還原能力的測定。首先是FRAP溶液的配制： 將pH 3.6 的0.3 mol/L 乙酸緩沖液100 mL、10 mmol/L TPTZ 溶液10 mL（含40 mmol/L HCl）以及20 mmol/L FeCl3·6H2O 10 mL 溶液混合，配制成FRAP 溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。 將8 種乳桿菌EPS 配制成5 mg/mL 的多糖溶液，取150 μL 多糖溶液加入到3 mL FRAP 溶液中， 室溫靜置6 min后在593 nm 處測定其吸光值。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制： 配制濃度梯度為20，50，100，200，400，600，800 和1 000 μmol/mL 的Trolox溶液作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)。經(jīng)換算試驗(yàn)結(jié)果以Trolox 當(dāng)量 （μmol Trolox/mg）表示。

1.4.5 氧自由基吸收能力 （ORAC）測定 根據(jù)Huang 等[14]所述ORAC 方法稍加修改測定對(duì)8 株菌所產(chǎn)胞外多糖的ORAC 值，ORAC 計(jì)算公式為[15]：

式中：f0--初始熒光強(qiáng)度；fn——第n 個(gè)測定點(diǎn)的相對(duì)熒光強(qiáng)度；△t——相鄰兩個(gè)檢點(diǎn)之間的時(shí)間間隔（4.5 min）。

對(duì)照組：40 μL PBS+200 μL FL

空白組：20 μL PBS+20 μL ABAP+200 μL FL

試驗(yàn)組：20 μL PBS+20 μL 樣品+200 μL FL

以Trolox 的濃度為橫坐標(biāo)， 配制濃度梯度為6.25，12.5，25，37.5，50，62.5 μmol/L 的Trolox 溶液， 以其相對(duì)ORAC 值為縱坐標(biāo)。 該測定在黑壁96 孔微孔板的內(nèi)孔中進(jìn)行。 經(jīng)換算，試驗(yàn)結(jié)果以Trolox 當(dāng)量（μmol Trolox/mg）表示。

1.4.6 細(xì)胞的培養(yǎng) 人結(jié)腸癌腺細(xì)胞HT-29 細(xì)胞培養(yǎng)方法參照Zhang[10]，并稍有改動(dòng)。

1）培養(yǎng)基： 改良型RPMI-1640 培養(yǎng)基：含20%FBS 和1%雙抗。

2）細(xì)胞培養(yǎng)：HT-29 細(xì)胞加入RPMI-1640培養(yǎng)液，在CO2培養(yǎng)箱于37 ℃培養(yǎng)，每隔24 h 換培養(yǎng)液一次；當(dāng)HT-29 細(xì)胞單層覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)瓶80%～90%， 即用培養(yǎng)基體積的0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化并吹打均勻，離心（3 000 r/min，2 min），吸出上清培養(yǎng)液， 加入適當(dāng)培養(yǎng)液， 繼續(xù)分瓶培養(yǎng)。

1.4.7 亞甲藍(lán)檢測細(xì)胞存活率 首先將生長到對(duì)數(shù)期的HT-29 細(xì)胞消化后接種于無菌96 孔板當(dāng)中，細(xì)胞濃度為4×104cells/mL，每孔加入100 μL。培養(yǎng)24 h 后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長良好，即可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

取凍干粗多糖，用無胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液配制成0.1，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00 mg/mL的粗多糖溶液。 將培養(yǎng)好細(xì)胞的96 孔板取出，吸取原液， 用10 mmol/L pH 7.4 的無菌PBS 清洗2次，在每孔中依次加入100 μL 樣品，對(duì)照組加入100 μL 無血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h 后，用10 mmol/L pH 7.4 的無菌PBS 清洗2 次，采用亞甲藍(lán)染色法測定HT-29 細(xì)胞存活率。

亞甲藍(lán)染色法參照Wolfe[16]，稍加修改進(jìn)行測定，計(jì)算存活率公式為：

存活率/%=樣品組吸光值/對(duì)照組吸光值×100

1.4.8 ABAP 半致死濃度確定 首先將生長到對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化后接種于無菌96 孔板當(dāng)中，細(xì)胞濃度為2×104cells/孔，每孔100 μL，將上述96 孔板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

將培養(yǎng)好細(xì)胞的96 孔板取出， 無菌PBS（pH 7.4）清洗2 次，向每孔中加入無胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基和ABAP 溶液， 使ABAP 終濃度為70，80，90，100，110，120，130，140 及150 mmol/L，未加入ABAP 組作為對(duì)照組， 置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h 后， 采用亞甲藍(lán)染色法測定HT-29 細(xì)胞存活率。

1.4.9 胞外多糖對(duì)ABAP 氧化損傷HT-29 細(xì)胞的保護(hù)作用 首先將生長到對(duì)數(shù)期的細(xì)胞消化后接種于無菌96 孔板當(dāng)中，細(xì)胞濃度為2×104cells/孔，每孔100 μL，將上述96 孔板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

將培養(yǎng)好細(xì)胞的96 孔板取出， 無菌PBS（pH 7.4）清洗2 次，取8 株菌的凍干粗多糖，用無胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液配制成質(zhì)量濃度為0.50 mg/mL 的多糖溶液加入到各孔中， 置于CO2培養(yǎng)箱中24 h 后，用10 mmol/L pH 7.4 的無菌PBS 清洗2 次，去除多糖溶液，再將ABAP 調(diào)至半致死濃度后加入各孔， 加入ABAP 未加入多糖溶液的為對(duì)照組， 無ABAP 和多糖溶液的為空白組， 置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h 后，采用亞甲藍(lán)染色法測定HT-29 細(xì)胞存活率。

1.5 HT-29 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)及活性測定

1.5.1 不同濃度Y42 菌株胞外多糖對(duì)氧化損傷HT-29 細(xì)胞的保護(hù)作用 用無胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液配制成質(zhì)量濃度為500，250，100，50 μg/mL 的胞外多糖溶液， 其它具體操作步驟同1.4.9節(jié)。

1.5.2 HT-29 細(xì)胞過氧化氫酶（CAT）表達(dá)量測定

本試驗(yàn)采用蛋白免疫印跡法（Western Blot）[17]對(duì)Y42 的胞外多糖作用的HT-29 細(xì)胞進(jìn)行CAT 表達(dá)量的測定，具體步驟如下：

1）細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.4.6 節(jié)。

2）蛋白質(zhì)提?。?當(dāng)HT-29 細(xì)胞長至80%～90%的程度時(shí)進(jìn)行消化， 接種3 mL 于直徑為60 mm 的無菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)2～3 d，空白組和氧化組都加入3 mL 無血清RPMI-1640， 試驗(yàn)組加入500 μg/mL 和50 μg/mL EPS 溶液， 繼續(xù)培養(yǎng)18h后，吸去培養(yǎng)液，用無菌PBS 潤洗兩次，空白組加入RPMI-1640， 氧化組和樣品組加入70 mmol/L ABAP 溶液，避光培養(yǎng)2 h 后，PBS 洗3 次，再用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮掉， 將含有細(xì)胞的PBS 溶液用移液槍轉(zhuǎn)移到EP 管中并迅速放入冰塊中后， 離心（4℃，5 min，11 000 r/min）得到沉淀。 向2 mL 離心管中加入200 μL 左右的裂解液。 吹勻后，迅速放入冰水中進(jìn)行超聲破碎（200 W，3 s/次，20 min）使細(xì)胞裂解完全， 然后離心 （4 ℃，15 000 r/min，10 min），取上清液作為待測樣品迅速放置在-80 ℃冰箱中備用。

3）根據(jù)BCA 蛋白濃度測定試劑盒的說明測定蛋白濃度， 再采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）對(duì)Y42 的EPS 作用的HT-29 細(xì)胞進(jìn)行CAT表達(dá)量的測定。

1.5.3 HT-29 細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)量測定 測定Y42 的胞外多糖作用后HT-29 細(xì)胞內(nèi)SOD 相對(duì)表達(dá)量，方法同1.5.2 節(jié)。

1.5.4 HT-29 細(xì)胞中谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）活性測定 對(duì)Y42 的胞外多糖作用的HT-29細(xì)胞進(jìn)行GSH-Px 活性的測定。 當(dāng)HT-29 細(xì)胞長至80%～90%的程度時(shí)進(jìn)行消化， 接種3 mL 于直徑為60 mm 的無菌培養(yǎng)皿中， 當(dāng)細(xì)胞完全用貼壁且生長狀態(tài)良好時(shí)，用無血清RPMI-1640 潤洗兩次后，空白組和氧化組都加入3 mL 無血清RPMI-1640，試驗(yàn)組加入500 μg/mL 和50 μg/mL 胞外多糖溶液，繼續(xù)培養(yǎng)18 h 后，吸去培養(yǎng)液，用無菌PBS 潤洗兩次，空白組加入RPMI-1640，氧化組和樣品組加入70 mmol/L ABAP 溶液， 避光培養(yǎng)2 h，將含有細(xì)胞的PBS 溶液用移液槍轉(zhuǎn)移到EP 管中并迅速放入冰塊中，離心（4 ℃，5 min，11 000 r/min）得到沉淀。 加入1 mL pH 7.4 的PBS 形成細(xì)胞懸液，超聲破碎（300 W，3 s/次，3～5 個(gè)間隔），得到細(xì)胞懸液作為待測樣備用。 根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的谷胱甘肽過氧化物酶檢測試劑盒， 進(jìn)行被處理HT-29 細(xì)胞GSH-Px 活性的測定。

1.6 Y42 胞外多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)的測定

1.6.1 Y42 胞外多糖DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱純化 將10 mL 的10 mg/mL 的粗多糖溶液進(jìn)行純化。 純化前檢查柱子的氣泡情況或者是否有斷層，若有則需要重新填裝柱子。檢查柱子正常后用超純水沖洗SepHarose Fast Flow 離子柱，對(duì)柱子進(jìn)行平衡，流速2 mL/min，壓力為0.4，平衡約2 個(gè)柱體積后開始上樣， 上樣之前為了去除雜質(zhì)， 樣品溶液要過0.45 μm 的濾膜后離子柱進(jìn)行純化，流動(dòng)相為超純水，流速2 mL/min，15 mL 的試管每管收集5 mL。 收集48 管后，換流動(dòng)相為0.5 mol/L 的NaCl 溶液，使用蛋白純化儀進(jìn)行梯度洗脫，流速壓力不變，每管收集5 mL。 收集完畢后，采用苯酚硫酸法檢測每管是否含有多糖，作出洗脫曲線圖，根據(jù)洗脫曲線將單一峰收集起來，透析48 h 后冷凍干燥。

1.6.2 單糖組成分析

1）樣品的水解： 稱取5 mg Y42 胞外粗多糖放入帶有蓋子的試管中， 加入2 mL 2 mol/L TFA后，120 ℃的烘箱中水解4 h，旋蒸，待有固體掛在蒸餾瓶壁上時(shí)加入1 mL 甲醇繼續(xù)旋蒸， 反復(fù)3次，徹底除掉TFA 當(dāng)瓶壁幾乎沒有液體且瓶底為可見固體時(shí)即為蒸發(fā)完畢。

2）多糖的PMP 衍生化：粗糖水解后，向含有水解產(chǎn)物的蒸餾瓶中加入1 mL 超純水， 配成5 mg/mL 的多糖溶液，取200 μL 該多糖溶液于離心管中加入0.6 mol/L NaOH， 再取200 μL 混合液，200 μL 0.5 mol/L PMP 甲醇溶液1∶1（V/V）混合均勻，70 ℃水浴70 min。

水浴結(jié)束后冷卻至室溫， 向離心管中加入200 μL 0.3 mol/L HCL 中和反應(yīng)液，50 ℃旋蒸至瓶底出現(xiàn)固體且壁上沒有液體，向瓶中加入2 mL超純水，吸出加入2 mL 氯仿，搖勻，靜置5 min，吸出下層水相，重復(fù)3 次萃取，用0.45 μm 微孔濾膜過濾最后萃后的溶液，備用于HPLC 分析。

表1 高效液相色譜條件Table 1 High performance liquid chromatography conditions

1.6.3 高效液相色譜條件 本試驗(yàn)高效液相色譜條件如表2～表7 所示：

1.6.4 紅外光譜分析 采用KBr 壓片法， 稱取2 mg 左右凍干的Y42 胞外多糖樣品與KBr 混合，沿著一個(gè)方向研磨至細(xì)粉末后用壓片機(jī)壓片， 紅外掃描頻率范圍在4 000 cm-1～400 cm-1。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)， 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和單因素方差分析（ANOVE，LSD）。 所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P<0.05 表示差異顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 乳桿菌菌株粗多糖的糖含量及蛋白含量

在乳桿菌胞外多糖的糖含量的測定中， 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.7422X-0.003，R2=0.9954，8 株菌株胞外多糖的糖含量如表2 所示。8株菌株胞外多糖濃度各不相同，但培養(yǎng)、發(fā)酵和提取條件都一致， 這可能與菌株的自身產(chǎn)胞外多糖的能力有關(guān)。

本試驗(yàn)采用TCA 的方法進(jìn)行除蛋白，通過考馬斯亮藍(lán)法測定了8 株菌株胞外多糖的蛋白濃度。在乳桿菌胞外多糖的蛋白濃度測定中，蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=4.0515X+0.0157，R2=0.9950。 各菌株所產(chǎn)胞外多糖中蛋白含量如表2所示，蛋白含量均少于0.03 mg/mL。

表2 8 株乳酸桿菌胞外多糖濃度和蛋白濃度Table 2 EPS concentration and protein concentration of 8 strains of Lactobacillus

2.2 體外抗氧化能力評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2.1 DPPH·清除能力測定結(jié)果 由圖1 可以看出，當(dāng)8 株菌的胞外多糖質(zhì)量濃度均為0.5 mg/mL時(shí)，8 株乳桿菌胞外多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力存在顯著差異（P<0.05），DPPH 自由基清除率最高的是植物乳桿菌Y3 產(chǎn)的胞外多糖，清除率達(dá)到了22.81%±1.89%， 顯著高于LGG 菌株胞外多糖的DPPH 自由基清除率（17.76%±2.26%）（P<0.05），總體來看，Y3、Y4、Y42、Y44 菌株胞外多糖對(duì)DPPH 自由基的清除能力顯著高于LGG 胞外多糖的DPPH 自由基清除能力。

2.2.2 ABTS 自由基清除能力測定結(jié)果 由圖2可以看出，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)，8 株乳桿菌胞外多糖的ABTS 自由基清除能力存在差異，清除范圍在（26.84%±3.70%）～（39.13%±1.74%）。 其中LGG、Y3、Y42 胞外多糖的ABTS 自由基清除率差異不顯著，但均顯著高于（P＜0.05）其他5 株菌株胞外多糖ABTS 自由基清除能力；而Y35 胞外多糖清除率為26.84%±3.70%，顯著低于除Y3 以外其他受試菌株胞外多糖清除率。

2.2.3 羥自由基清除能力的測定結(jié)果 由圖3 可知，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為4 mg/mL 時(shí)，8 株菌株胞外多糖羥自由基清除能力存在差異， 清除范圍為（53.17%±2.21%）～（45.28%±5.14%）。 其中Y44 菌株胞外多糖羥自由基清除率為53.17%±2.21%，顯著高于（P＜0.05）Y41、Y42 菌株胞外多糖的羥自由基清除能力，同LGG 胞外多糖清除率沒有顯著差異（P＞0.05）。 其中Y41 胞外多糖羥自由基清除率為45.28%，顯著低于（P＜0.05）LGG 胞外多糖羥自由基清除率。

2.2.4 FRAP 試驗(yàn)結(jié)果 在本試驗(yàn)中，以Trolox 濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)RAP 值為縱坐標(biāo)，制作回歸方程Y=0.0017X+0.0102，R2=0.997。由圖4 可以看出，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)，8 株菌株胞外多糖的鐵離子還原力存在差異，Y4 菌株胞外多糖FRAP值為（38.90±1.63）μmol Trolox/mg，顯著高于（P＜0.05）LGG 菌株胞外多糖鐵離子還原力。 Y44 FRAP 值為（12.44±2.83）μmol Trolox/mg，顯著低于（P＜0.05）其余7 株菌胞外多糖FRAP 值。

圖1 8 株乳酸桿菌胞外多糖DPPH 自由基清除能力Fig.1 Scavenging DPPH radicals activity of EPS from 8 strains Lactobacillus

圖2 8 株乳酸桿菌胞外多糖ABTS 自由基清除率Fig.2 Scavenging ABTS free radicals activity of EPS from 8 strains Lactobacillus

圖3 8 株乳酸桿菌胞外多糖羥由基清除率Fig.3 Scavenging hydroxyl free radicals activity of EPS from 8 strains Lactobacillus

圖4 8 株乳酸桿菌胞外多糖鐵離子還原能力測定Fig.4 The Fe3+ reduction ability determination of EPS from 8 strains Lactobacillus

2.2.5 ORAC 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果 ORAC 試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于分析測量物質(zhì)的總抗氧化能力。 在本試驗(yàn)中，以Trolox 為標(biāo)準(zhǔn)品，得到ORAC 試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.4448X+1.0488，R2=0.980。8 株乳桿菌株胞外多糖的ORAC 值見圖5 所示，8 株菌株胞外多糖相對(duì)ORAC 值存在差異， 其中菌株Y42 和Y4 胞外多糖ORAC 值顯著高于 （P＜0.05）其它菌株胞外多糖的ORAC 值（P＜0.05）。

2.2.6 ABAP 半致死濃度確定 進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)首先要保證胞外多糖樣品對(duì)細(xì)胞無毒性， 經(jīng)檢驗(yàn)8株菌株胞外多糖對(duì)HT-29 細(xì)胞均無毒性。 ABAP是一種常用的促進(jìn)產(chǎn)生活性氧的誘導(dǎo)劑， 因此本次試驗(yàn)選擇ABAP 作為HT-29 細(xì)胞氧化損傷模型的氧化劑。 由圖6 可知， 當(dāng)ABAP 濃度范圍在20～110 mmol/L 之間上升時(shí)，HT-29 細(xì)胞存活率逐漸下降，當(dāng)ABAP 濃度為70 mmol/L 時(shí)，HT-29 細(xì)胞存活率為53.87%，接近50%，因此細(xì)胞抗氧化試驗(yàn)中，ABAP 半致死濃度確定為70 mmol/L。

2.2.7 EPS 對(duì)ABAP 氧化損傷HT-29 細(xì)胞的保護(hù)作用 當(dāng)ABAP 濃度為70 mmol/L 時(shí)，經(jīng)過8 株菌株胞外多糖處理的HT-29 細(xì)胞的存活率與未經(jīng)多糖處理的對(duì)照組相比顯著提高（P＜0.05），表現(xiàn)出對(duì)HT-29 細(xì)胞的保護(hù)作用，如圖7 所示。8 株菌株胞外多糖均有抑制ABAP 氧化損傷HT-29 細(xì)胞的作用，其中Y42、Y41 和Y44 菌株胞外多糖對(duì)HT-29 細(xì)胞的保護(hù)作用顯著高于其它菌株胞外多糖的保護(hù)作用。

圖5 8 株乳酸桿菌EPS 相對(duì)ORAC 值Fig.5 The value of ORAC of EPS from 8 strains Lactobacillus

2.3 乳桿菌菌株胞外多糖體外抗氧化活性主成分分析

本試驗(yàn)選擇主成分分析法綜合評(píng)價(jià)菌株體外抗氧化活性。 參考王鵬等[18]的研究方法依據(jù)SPSS20.0 軟件中的主成分分析方法，通過對(duì)所選取的6 個(gè)抗氧化試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析， 從而可以在這些指標(biāo)中間選用幾個(gè)重要且相對(duì)獨(dú)立的綜合指標(biāo)來進(jìn)行產(chǎn)高抗氧化性多糖菌株的篩選。各指標(biāo)及數(shù)據(jù)見表3。

圖6 不同ABAP 濃度HT-29 細(xì)胞存活率Fig.6 Different ABAP concentrations of HT-29 cell survival rate

圖7 8 株乳桿菌胞外多糖作用下氧化損傷HT-29 細(xì)胞存活率Fig.7 Survival rate of oxidative loss of HT-29 cells by EPS from 8 strains Lactobacillus

表3 8 株菌株胞外多糖抗氧化原始指標(biāo)及數(shù)據(jù)Table 3 Antioxidant raw indicators and data of EPS from 8 strains Lactobacillus

因?yàn)槊總€(gè)指標(biāo)單位不同， 需要標(biāo)準(zhǔn)化表3 中數(shù)據(jù)。根據(jù)各指標(biāo)特征值的特征向量、標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)以及綜合得分計(jì)算公式可以計(jì)算8 株菌株胞外多糖抗氧化性的綜合得分并排名，綜合得分越高，說明該菌株胞外多糖具有更高的抗氧化性。 綜合得分及排名如表4。 由表4 可知，8 株菌株的胞外多糖的抗氧化性綜合得分排名順序依次為Y42、Y4、Y3、Y41、Y44、Y35、Y16、LGG，其中Y42 排名第一位， 說明Y42 產(chǎn)生的胞外多糖具有最強(qiáng)的抗氧化活性。

表4 8 株菌株胞外多糖抗氧化性綜合得分及排名Table 4 Antioxidant comprehensive score and ranking of EPS from 8 strains Lactobacillus

2.4 HT-29 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)及活性測定

2.4.1 不同濃度Y42 菌株胞外多糖對(duì)氧化損傷HT-29 細(xì)胞的保護(hù)作用 如圖8 所示， 當(dāng)ABAP濃度為70 mmol/L 時(shí)， 經(jīng)過不同濃度Y42 菌株胞外多糖處理的HT-29 細(xì)胞的存活率與未經(jīng)多糖處理的對(duì)照組相比顯著提高 （P＜0.05）， 表現(xiàn)出Y42 菌株胞外多糖對(duì)HT-29 細(xì)胞的保護(hù)作用。 隨著胞外多糖濃度的不斷降低，HT-29 細(xì)胞的存活率也逐漸降低。 胞外多糖作用質(zhì)量濃度為500 μg/mL，HT-29 細(xì)胞存活率為77.01%±5.01%，胞外多糖作用質(zhì)量濃度為50 μg/mL EPS 的試驗(yàn)組細(xì)胞存活率最低（63.81%±2.00%）。 為了對(duì)比不同濃度的Y42 菌株胞外多糖的抗氧化效果， 選擇胞外多糖作用質(zhì)量濃度為500 μg/mL 和50 μg/mL 作為后續(xù)試驗(yàn)的作用濃度。

2.4.2 HT-29 細(xì)胞過氧化氫酶（CAT）活性 Y42菌株EPS 作用于HT-29 后產(chǎn)生的CAT 相對(duì)表達(dá)量如圖9 所示，通過與空白組相比，CAT 相對(duì)表達(dá)量由小到大依次為氧化組＜50 μg/mL EPS＜500 μg/mL EPS， 其中500 μg/mL EPS 作用的HT-29細(xì)胞中CAT 的表達(dá)量與其它兩組具有顯著差異（P＜0.05），達(dá)到145.01%±3.98%，說明胞外多糖作用濃度越高，細(xì)胞中的CAT 表達(dá)量越高，并且高于空白組約45%。

圖8 不同濃度菌株Y42 胞外多糖作用下氧化損傷的HT-29 細(xì)胞存活率Fig.8 Survival rate of oxidative loss of HT-29 cells by EPS from different concentrations of Y42 strain

圖9 菌株Y42 胞外多糖作用HT-29 細(xì)胞后CAT 相對(duì)表達(dá)量Fig.9 CAT relative expression of Y42 EPS in HT-29 cells

2.4.3 HT-29 細(xì)胞超氧化物歧化酶 （SOD）活性Y42 菌株胞外多糖作用于HT-29 后產(chǎn)生的SOD相對(duì)表達(dá)量如圖10 所示： 通過與空白組相比，SOD 相對(duì)表達(dá)量由小到大依次為氧化組＜50 μg/mL EPS＜500 μg/mL EPS， 加入多糖作用的兩組SOD 相對(duì)表達(dá)量分別為206.80%±10.66%和194.45%±34.3%， 均顯著高于氧化組SOD 表達(dá)量（P＜0.05）， 說明Y42 菌株胞外多糖上調(diào)了HT-29細(xì)胞內(nèi)SOD 的表達(dá)。

2.4.4 HT-29 細(xì)胞GSH-Px 酶活 不同濃度Y42菌株胞外多糖作用于HT-29 后產(chǎn)生的GSH-Px的活性如圖11 所示：GSH-Px 的活性由小到大依次為氧化組＜空白組＜ABAP+50＜ABAP+500，經(jīng)過ABAP 刺激后的氧化組酶活明顯下降（P＜0.05）；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時(shí)，GSH-Px 活性分別為（116.23±8.92）U/mgprot，顯著高于（P＜0.05）多糖濃度為50 μg/mL 時(shí)GSH-Px 活性（81.36±2.00）U/mgprot，并且500 μg/mL 的多糖作用后GSH-Px 酶活性顯著高于空白組 （67.27±12.53）（P＜0.05），酶活增強(qiáng)了42.20%。

圖10 菌株Y42 胞外多糖作用HT-29 細(xì)胞后SOD 相對(duì)表達(dá)量Fig.10 SOD relative expression of Y42 EPS in HT-29 cells

圖11 菌株Y42 胞外多糖作用HT-29 細(xì)胞后GSH-Px 酶活性Fig.11 GSH-Px enzyme activity in HT-29 cells treated with Y42 EPS

2.5 Y42 胞外多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)的測定

2.5.1 Y42 胞外多糖DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱純化 雖然在提取多糖的過程中已經(jīng)采用TCA 方法將蛋白除去， 乙醇沉淀將部分雜質(zhì)除去得到粗多糖， 但粗多糖通常由不同電荷的胞外多糖組分組成， 因此采用柱層板進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。 Y42 胞外多糖DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱純化結(jié)果如圖12 所示， 分離出兩個(gè)組分EPS 42-1 和EPS 42-2。 在48 號(hào)管之前采用的流動(dòng)相為超純水，洗脫出來的糖為中性多糖[24]，說明EPS42-1 組分為中性多糖。 48 管之后流動(dòng)相為NaCl， 濃度為1 mol/L， 洗脫出來的糖為酸性多糖[19]，說明組分EPS 42-2 為酸性多糖。

2.5.2 單糖組成分析 將單糖標(biāo)準(zhǔn)品和Y42 胞外多糖分別衍生化后，得到了如圖13、圖14 的色譜圖。并獲得單糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表5 所示。

將Y42 菌株EPS 水解物衍生化后的高效液相色譜圖（圖14）與標(biāo)準(zhǔn)圖譜（圖13）比較，確定Y42 菌株胞外多糖主要由5 種單糖組成， 結(jié)合各標(biāo)準(zhǔn)糖的峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算出菌株Y42 胞外多糖中各單糖的物質(zhì)的量比及含量， 如表6 所示，其中甘露糖含量最多，葡萄糖醛酸含量最少。

圖12 菌株Y42 胞外多糖DEAE-Sepharose Fast Flow 洗脫層析Fig.12 Chromatography of eluted of Y42 strain EPS on DEAE-Sepharose Fast Flow ion column

圖13 混合標(biāo)準(zhǔn)品單糖高效液相色譜圖Fig.13 HPLC chromatogram of mixed standard monosaccharides

圖14 菌株Y42 胞外多糖高效液相色譜圖Fig.14 HPLC chromatogram of EPS of Y42 strain

2.5.3 紅外光譜分析 Y42 菌株EPS 的紅外光譜如圖15 所示，在3 396.94 cm-1處顯示出的寬而強(qiáng)的吸收峰是由于羥基O-H 鍵的伸縮振動(dòng)造成的，這說明在Y42 菌株EPS 中存在大量的羥基；在2 937.86 cm-1處所對(duì)應(yīng)的位置是烷基C-H 鍵的伸縮振動(dòng)；在1 640 cm-1～1 645 cm-1范圍內(nèi)的1 644.21cm-1處所對(duì)應(yīng)的位置是是C-O 伸縮振動(dòng)； 在1 450 ～1 200 cm-1范圍內(nèi)，1 407.52 cm-1和1 233.43cm-1所對(duì)應(yīng)的位置是C-H 的變角振動(dòng)，這種振動(dòng)和C-H 的伸縮振動(dòng)可以形成糖環(huán)的特征吸收；950～1 200 cm-1處所對(duì)應(yīng)的位置是C-O-C和C-O-H 連接的位置[20]，在814.53 cm-1處的吸收峰存在α-葡萄糖苷鍵[7]，在350～600 cm-1處的條帶屬于吡喃糖環(huán)的骨架模式[21]。

表5 單糖標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 5 Standard curve of monosaccharide standard substance

表6 菌株Y42 胞外多糖中單糖含量及物質(zhì)的量比Table 6 Content and molar ratio of monosaccharide in exopolysaccharide of strain Y42

圖15 菌株Y42 胞外多糖紅外光譜圖Fig.15 FT-IR spectrum of EPS of Y42 strain

3 討論

3.1 乳桿菌胞外多糖抗氧化活性的評(píng)價(jià)

本研究通過DPPH 自由基清除、ABTS 自由基清除、羥自由基清除、鐵離子還原、氧自由基吸收及對(duì)ABAP 氧化損傷HT-29 細(xì)胞的保護(hù)試驗(yàn)，評(píng)價(jià)8 株乳桿菌胞外多糖抗氧化活性。 不同抗氧化試驗(yàn)獲得的結(jié)果具有一定差異性。 采用主成分分析法綜合評(píng)價(jià)不同抗氧化試驗(yàn)的結(jié)果， 確定菌株Y42 所產(chǎn)胞外多糖具有較好的抗氧化活性。

Liu 等[22]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)副干酪乳桿菌胞外多糖101EP 和植物乳桿菌胞外多糖102EP 在10 mg/mL 時(shí)，DPPH 清除自由基活性分別為91.82%和81.15%。 MSR Rajoka 等[23]從人乳汁中分離得到的乳酸菌EPSs 在DPPH 試驗(yàn)中使用的濃度范圍在0.2～4 mg/mL，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時(shí)，自由基清除率最高在30%左右。 本研究中的結(jié)果與此相似，略有偏差原因可能是菌株不同。

ABTS 自由基清除能力試驗(yàn)也是評(píng)價(jià)抗氧化特性常見的方法， 樣品的ABTS 自由基清除值越高，代表抗氧化性越強(qiáng)。 Luo 等[24]采用ABTS 方法評(píng)價(jià)了純化后的石斛莖中提取粗水溶性多糖DNP4-2 的抗氧化性，發(fā)現(xiàn)該多糖對(duì)ABTS 自由基清除能力良好；Ayesha 等[25]采用駱駝奶分離出的乳酸菌的EPS 制備低脂肪奶酪， 發(fā)現(xiàn)最終CEPS+干酪的ABTS 自由基清除率增加超過60%。Yang等[26]從山楂中提取了一種新的多糖組分（CCPP-1）， 隨著CCPP-1 的濃度增加，ABTS 的清除能力逐漸增強(qiáng)，最強(qiáng)達(dá)到99%，接近Vc 的ABTS 清除能力。

羥基自由基對(duì)敏感的生物分子可造成嚴(yán)重的損傷[27]。 Li 等[28]研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌WBIN03（BEPS）和植物乳桿菌R315（L-EPS）的胞外多糖具有一定的羥自由基清除能力。 Wang 等[29]純化植物乳桿菌70810 胞外多糖（r-EPS1 和r-EPS2），具有一定的羥自由基清除能力。 與本試驗(yàn)各菌株胞外多糖也體現(xiàn)一定羥自由基清除能力， 說明本試驗(yàn)中8 株菌株的胞外多糖具有抗氧化性。

體外理化試驗(yàn)雖然能體現(xiàn)胞外多糖的抗氧化性， 但是這些抗氧化指標(biāo)并不一定能準(zhǔn)確反映細(xì)胞生理?xiàng)l件，也忽略了生物有效性和代謝問題。而動(dòng)物試驗(yàn)耗時(shí)長成本高， 因此細(xì)胞抗氧化試驗(yàn)是一種較好的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法， 可以體現(xiàn)活性氧、抗氧化劑與細(xì)胞之間的相互關(guān)系。細(xì)胞抗氧化試驗(yàn)反映了抗氧化物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的吸收、 代謝和分布等方面， 比化學(xué)抗氧化方法更具有生物相關(guān)性， 能更好地預(yù)測物質(zhì)在體內(nèi)的抗氧化活性。Seth A[30]的試驗(yàn)結(jié)果表明，鼠李糖乳桿菌LGG 產(chǎn)生的可溶性蛋白能夠通過加強(qiáng)Caco-2 單層細(xì)胞中緊密連接蛋白和屏障功能從而減輕過氧化氫對(duì)細(xì)胞的損傷，從而提高細(xì)胞的存活率。 Mu 等[31]的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H2O2損傷的HT-29 細(xì)胞模型可以較好地評(píng)價(jià)植物乳桿菌Y44 抗氧化活性。 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同菌株胞外多糖預(yù)處理HT-29 細(xì)胞，會(huì)不同程度保護(hù)細(xì)胞免受ABAP 損傷。

任何評(píng)估抗氧化能力的方法都與其相應(yīng)的抗氧化機(jī)制密切相關(guān)。 通常很難在單一測定系統(tǒng)中評(píng)估其抗氧化活性， 必須使用某種分析方法對(duì)不同方法獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[36]。 主成分分析是一種采用少量綜合指標(biāo)來代替原來多個(gè)指標(biāo)大部分信息的一種降維的分析方法， 除去一些不相關(guān)的指標(biāo)，保留重要信息，具有減少計(jì)算工作量、減少原始數(shù)據(jù)信息損失、 簡化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)以及避免主觀隨意性等優(yōu)點(diǎn)[32]。 本研究采用主成分分析方法綜合分析不同菌株胞外多糖抗氧化活性， 確定菌株Y42 胞外多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性。 仍需進(jìn)一步對(duì)不同化學(xué)抗氧化方法與細(xì)胞抗氧化方法的相關(guān)性展開研究， 找到幾種不同方法相結(jié)合的快速有效的抗氧化研究方法。

3.2 菌株Y42 胞外多糖對(duì)HT-29 細(xì)胞抗氧化相關(guān)酶系活性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)菌株Y42 胞外多糖可以上調(diào)HT-29 細(xì)胞中抗氧化酶系CAT、SOD、GSH-Px 和表達(dá)量和活性。 因此認(rèn)為菌株Y42 胞外多糖可能是通過激活HT-29 細(xì)胞抗氧化酶系活性，以及清除細(xì)胞外存在的活性氧，從而保護(hù)HT-29 細(xì)胞免受ABAP 自由基的損傷。

MU 研究發(fā)現(xiàn)[36]植物乳桿菌 Y44 可以激活Caco-2 細(xì)胞Nrf2-Keap1-ARE 信號(hào)通路并調(diào)控抗氧化酶的表達(dá)，顯著提高細(xì)胞CAT 活性（P<0.05），增強(qiáng)Caco-2 細(xì)胞抗氧化活性。本課題組將繼續(xù)研究菌株Y42 胞外多糖對(duì)HT-29 細(xì)胞Nrf2-Keap1-ARE 信號(hào)通路及抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)影響，闡明胞外多糖對(duì)HT-29 細(xì)胞自身抗氧化功能的影響。

3.3 菌株Y42 EPS 結(jié)構(gòu)分析

胞外多糖（EPS）是由單糖或糖衍生物的支鏈重復(fù)單元組成的長鏈多糖，其單糖組成、分子質(zhì)量和分支結(jié)構(gòu)決定了其功能和應(yīng)用[33]。 多糖跟蛋白質(zhì)類似，具有一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)，且單糖組成的種類繁多、糖單體間也存在著多種連接方式，所以解析多糖類結(jié)構(gòu)的難度大大超過了核酸和蛋白質(zhì)等其它的生物大分子[34]。 對(duì)于產(chǎn)胞外多糖抗氧化性最低的菌株LGG 的胞外多糖的單糖組成，通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)張娟[31]通過HPLC 得到LGG 的EPS主要含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖，其中甘露糖、鼠李糖、半乳糖占主要成分；張震[33]通過水解LGG胞外多糖后采用薄層層析TLC 和HPLC 進(jìn)行檢測， 得到LGG 胞外多糖單糖組成為鼠李糖、N-乙酰氨基葡萄糖和半乳糖。 張娟[35]發(fā)現(xiàn)LGG 胞外多糖紅外光譜在3 400 cm-1，2 939 cm-1和990～1 200 cm-1這些位置檢測到出峰， 這些峰是多糖類物質(zhì)的常見峰，分別代表O-H 鍵，-CH2基團(tuán)中的C-H鍵和多糖特征峰。 本研究發(fā)現(xiàn)菌株Y42 胞外多糖單糖組成為甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖，物質(zhì)的量比為11.30 ∶3.51 ∶10.64∶7.53∶7.19。 還需要對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)展開研究，以確定菌株Y42 胞外多糖發(fā)揮抗氧化功能的功能基因。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)比分析8 株乳桿菌菌株胞外多糖的DPPH 自由基清除率、ABTS 自由基清除率、羥自由基清除率、鐵離子還原力、氧自由基吸收能力及對(duì)ABAP 氧化損傷HT-29 細(xì)胞的保護(hù)作用，表明菌株Y42 胞外多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性。菌株Y42 胞外多糖對(duì)HT-29 細(xì)胞內(nèi)的CAT、SOD及GSH-Px 的表達(dá)都有顯著的上調(diào)作用。 菌株Y42 胞外多糖可能是通過清除活性氧、 以及促進(jìn)HT-29 細(xì)胞抗氧化酶系的表達(dá)， 起到保護(hù)HT-29細(xì)胞免受ABAP 自由基損傷。 菌株Y42 胞外多糖由中性多糖和酸性多糖2 個(gè)組分構(gòu)成， 其單糖組成為甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖，屬于吡喃糖環(huán)的骨架模式。 將進(jìn)一步研究菌株Y42 胞外多糖結(jié)構(gòu)與抗氧化功能的關(guān)系。