邱丹騰 張海玲 劉樹滔* 林士森 陳玲琳 饒平凡

（1 福州大學生物工程研究所 福州350108 2 中國科學院上海生命科學研究院-浙江工商大學食品營養(yǎng)科學聯(lián)合研究中心 杭州310035）

傳統(tǒng)的微生物分離、 分析方法是建立在純培養(yǎng)技術上發(fā)展起來的，如平板涂布法、平板劃線分離法以及稀釋混合平板法。 然而這些傳統(tǒng)方法不但分離周期長、操作繁瑣，而且難以得到絕對的純種，并且對于難培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物而言，這些方法并不適用[1-2]。 隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的限制，可以從基因的水平定量分離、分析微生物，主要包括免疫磁性顆粒分離技術[3-4]、場流分離技術[5]、實時熒光定量PCR 技術[6-7]以及PCR-DGGE 技術[8-10]等，這些技術具有高效、快速、操作簡單等優(yōu)點，能夠大大提高微生物分離、 分析的效率， 縮短研究周期[11]。PCR-DGGE 技術是近年來國內(nèi)外應用較為廣泛的分子生物學技術之一， 它不僅可以通過對電泳圖譜的觀察來判定微生態(tài)系統(tǒng)的多樣性和相似性，而且還可以通過對差異條帶進行膠回收、克隆和測序完成定性分析。 然而DGGE 技術存在一定的局限性，它只能對單條帶進行測序分析，無法完全將有序列差異的DNA 片段分開，從而出現(xiàn)不同序列DNA 的共遷移現(xiàn)象，給條帶回收和測序帶來困難[11-13]。 條帶回收及其測序過程不僅試驗周期長，還費力耗材。分子生物學技術普遍存在干擾成分多， 檢測靈敏度和準確性受限以及無法回收菌體細胞，無法分析菌體表面特性，檢測樣品制備繁瑣等問題。

高效液相色譜技術是微生物分離、 分析和制備方法的一種創(chuàng)新性選擇。細菌作為帶電顆粒，具有不同的表面帶電特性， 其細胞表面的羧基、氨基、 磷酸等基團在不同的pH 條件下會發(fā)生電離，細菌可以像生物大分子一樣， 利用離子交換色譜技術進行分離[14-15]。高效液相色譜技術作為一種快速、靈敏的嶄新手段已應用于青枯菌、金黃色葡萄球菌、 致瀉性大腸桿菌以及動物腸道菌群等的初步分析，該方法不僅能以細菌細胞的種類、鞭毛長短、致病力的強弱而分離成不同的色譜組分，還能將不同生長階段的細菌細胞分離[16-20]。

本文選取紅曲作為模式體系， 通過紅曲細菌樣品制備條件優(yōu)化， 應用HPLC 技術分離紅曲生產(chǎn)菌株， 回收菌體細胞并結合PCR-DGGE 技術，利用細菌16S rDNA 對色譜分離得到的菌株進行鑒定。 探討HPLC 技術在紅曲細菌分離、分析中的應用潛力，為復雜微生物體系的分離、分析提供新思路， 為發(fā)酵食品生產(chǎn)菌株的篩選和制備提供新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

高效液相色譜儀（DL2000），日本Hitachi 公司；高速離心機（CF15RXⅡ），日本Hitachi 公司；PCR 儀 （S1000TMThermalCycler）， 美國BIO-RAD公司；變性梯度凝膠電泳儀（BIO-RAD DCodeTM），美國BIO-RAD 公司；pH 計（FE20），梅特勒-托利多（上海）有限公司；凝膠成像分析儀（JS-380A），上海培清科技有限公司； 光學顯微鏡（BM1000），南京江南永新光學儀器有限公司。

SuperQ-650C 強陰離子交換樹脂（TSKgel SuperQ-TOYOPEARL 650C），日本TOSOH 公司。

平衡緩沖液 （A 液）：20 mmol/L 哌嗪-鹽酸緩沖液（pH 8.0）；洗脫緩沖液（B 液）：20 mmol/L 哌嗪-鹽酸緩沖液（pH 8.0）+1 mol/L NaCl。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅曲細菌樣品的制備 稱取10.0 g 紅曲粉末于90 mL A 液中，攪拌30 min 后用滅菌的兩層紗布過濾， 去除大顆粒物質(zhì)。 濾液400×g 離心2 min 去除中等大小雜質(zhì)， 上清經(jīng)5 μm 濾膜抽濾后，將濾液12 000×g 離心10 min，收集沉淀，緩沖液洗滌3 次后重懸于10 mL 樣品處理液中， 即為紅曲細菌樣品。

1.2.2 紅曲細菌的HPLC 分析 色譜系統(tǒng)： 采用日本Tosch 公司的強陰離子交換樹脂TSKgel SuperQ-TOYOPEARL 650C 色譜柱 （200 mm×4.6 mm i.d）；流速1 mL/min；泵壓范圍0.5～1.5 MPa；溫度范圍23～28 ℃。

洗脫方法：紅曲細菌樣品進樣后，0～10 min 用A 液平衡，使樣品中的細菌充分吸附到色譜柱上；10～20 min 進行0～25%的B 液線性梯度洗脫；20～40 min 進行25%～50%的B 液線性梯度洗脫；40～80 min 進行50%～100%的B 液線性梯度洗脫；80～100 min 完全用B 液洗脫，將殘留在樹脂上的細菌全部洗脫下來。

檢測條件： 采用HPLC 紫外檢測池對通過色譜柱的細菌進行在線檢測，檢測波長260 nm。

1.2.3 洗脫組分的鏡檢 采用滅菌的試管重復多次收集洗脫峰， 分別于4 ℃下12 000×g 離心5 min，取少許沉淀涂片鏡檢，采用結晶紫染色法，在油鏡（100X）下觀察。

1.2.4 洗脫組分的DGGE 分析 洗脫組分基因組DNA 的提取： 使用Bioteck 公司土壤基因組DNA快速提取試劑盒的操作步驟對細菌DNA 進行提取， 并采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對基因組DNA的提取效果進行驗證。

洗脫組分16S rDNA 基因V3 區(qū)的巢式PCR擴增：首先，以提取的基因組DNA 為模板，采用通用引物27F （5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’）對細菌16S rDNA 進行擴增。 PCR 反應體系（50 μL）：PCR Mix 25 μL，模板1 μL，引物各1 μL，去離子水22 μL。PCR 反應程序：94 ℃預變性4 min；接著30 個循環(huán)：94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min 30 s；最后72 ℃終延伸10 min。

接著，以擴增的16S rDNA 為模板，采用通用引物341F-GC （5’-CGC CCG CCG CGC GCG CGG CGG GCG GGG CGG GGG CAC GGG GGG CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’）和518R （5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’）對V3 可變區(qū)進行擴增。 PCR 反應體系 （25 μL）：PCR Mix 12.5 μL，模板0.5 μL，引物各0.5 μL，去離子水11 μL。PCR 反應程序：95 ℃預變性5 min；接著30 個循環(huán)：94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃終延伸10 min。 以上產(chǎn)物均用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

洗脫組分的DGGE 電泳： 采用BIO-RAD 公司的DCodeTM 基因突變檢測系統(tǒng)對V3 區(qū)PCR產(chǎn)物進行檢測： 使用梯度制膠器制備變形梯度30%～60%的8%的聚丙烯酰胺凝膠。 待膠完全凝固后， 將膠板安裝進60 ℃緩沖液的電泳槽內(nèi)，分別加入8 μL 的PCR 產(chǎn)物。電泳條件為200 V、6.5 h、60 ℃。 電泳完畢后，用EB 染色，清水漂洗，置于凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.2.5 洗脫組分的16S rDNA 測序及系統(tǒng)發(fā)育學分析 將DGGE 圖譜單一條帶對應的洗脫峰細菌16S rDNA 送上海生工生物技術有限公司測序，測得的序列與GeneBank 數(shù)據(jù)庫做相似性分析，并采用MEGA5.1 軟件中的Neighbor-Joining 方法構建進化樹。

2 結果與討論

2.1 紅曲細菌的色譜分析

本研究采用HPLC 方法對紅曲細菌進行分離、分析。 試驗結果如圖1 所示，紫外檢測圖譜上共出現(xiàn)5 個明顯的洗脫峰， 分別為P1、P2、P3、P4、P5。 根據(jù)洗脫時間的不同，對各洗脫峰進行重復多次收集。 260 nm 紫外檢測波長下，除了核酸有吸收外，其余組分也有響應值，例如細菌表面脫落蛋白、表面蛋白以及表面多糖等。 因此，為了確認洗脫峰是否為細菌組分， 需要進一步做相關的細菌鑒定分析。

2.2 洗脫組分的確認

圖1 紅曲細菌的HPLC 色譜圖Fig.1 Chromatograms of the bacteria obtained from Red Kojic Rice

為了確認收集到的洗脫組分是否為細菌，對5 個洗脫峰進行顯微鏡檢查，結果如圖2 所示，表明收集到的各洗脫峰組分為細菌， 包括桿菌和球菌。

圖2 洗脫組分鏡檢圖Fig.2 Microscope graph of the eluted fractions

2.3 洗脫組分的DGGE 分析

2.3.1 基因組DNA 的提取 提取的各洗脫峰的細菌基因組DNA， 在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測，電泳結果如圖3，表明提取的基因組DNA 純度較好，濃度較高，可以作為PCR 擴增模板。

圖3 細菌峰基因組DNA 電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis （1.0%）of genome DNA of eluted fractions

2.3.2 16S rDNA 可變區(qū)V3 的巢式PCR 擴增 分別采用細菌通用引物27F 和1492R 對各洗脫峰進行細菌16S rDNA 的擴增，341F-GC 和518R 對其中V3 可變區(qū)進行擴增。電泳結果見圖4、圖5，可以看出，在1 500 bp 位置附近有明亮的特異性條帶，符合16S rDNA 基因片段大小，表明16S rDNA 擴增效果較好；以該16S rDNA 為模板，擴增的V3可變區(qū)產(chǎn)物，其電泳條帶在250 bp 附近，符合目標片段大小且不存在非特異性條帶， 可作為DGGE 分析的樣品。

圖4 細菌峰16S rDNA PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis （1.0%）of 16S rDNA PCR products

圖5 洗脫峰V3 可變區(qū)PCR 產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis （1.0%）of V3 region PCR products

2.3.3 DGGE 電泳分析 理論上認為，DGGE 技術最低可檢測到只有1 個堿基差異的DNA 片段[10]，DGGE 圖譜上的每個條帶就很可能代表一種微生物，基于該原因，可以通過DGGE 圖譜檢驗高效液相色譜對紅曲細菌的分離效果。

對各洗脫峰16S rDNA V3 可變區(qū)進行DGGE 分析，結果如圖6 所示。根據(jù)DGGE 原理，5個洗脫峰中有3 個可能為單菌，分別是：P1、P2、P5，說明HPLC 技術能夠?qū)崿F(xiàn)復雜細菌樣品的純菌分離。

2.4 洗脫組分的測序及系統(tǒng)發(fā)育學分析

將DGGE 圖譜中單條帶對應的3 個洗脫峰的16S rDNA 送往上海生工生物技術有限公司測序，均測序成功。測序得到的3 個16S rDNA 序列輸入NCBI 數(shù)據(jù)庫中，利用Blastn 進行比對分析，結果見表1。鑒定結果顯示，P1的相似菌株為脂肪酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus）和人參土芽孢桿菌（Bacillus ginsengihumi），P2的相似菌株為假單胞菌屬 （Pseudomonas sp），P5的相似菌株為環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）。

為了顯示各菌株的系統(tǒng)發(fā)育關系和分類學地位， 選取其中的相似菌株脂肪酸芽孢桿菌（KC893647.1）、人參土芽孢桿菌（NR_041378.1）、假單胞菌 （KT380612.1）、 環(huán)狀芽孢桿菌（KT720033.1）以及細菌峰菌株， 用MEGA5.1 的Neighbor-Joining 法構建進化樹，結果如圖7 所示。

圖6 細菌峰V3 區(qū)DGGE 電泳圖Fig.6 DGGE pattern of PCR products of the V3 region obtained from eluted fractions

表1 紅曲細菌高效液相色譜峰的鑒定結果表Table1 Phylogenetic identification results of bacteria peaks

圖7 基于16S rDNA 序列構建進化樹Fig.7 Phylogenetic tree based on the complete 16S rDNA sequences of 3 bacterial strains obtained and 4 related strains

從系統(tǒng)進化樹可以看出， 得到的細菌峰菌株與數(shù)據(jù)庫相似菌株可分為3 個分支：P1與脂肪酸芽孢桿菌和人參土芽孢桿菌聚為一支，P2歸類于假單胞菌，P5歸類于環(huán)狀芽孢桿菌。

3 結論

采用PCR-DGGE 技術對高效液相色譜的5個細菌峰的16S rDNA V3 可變區(qū)進行分析，其中3 個洗脫峰為單條帶。DGGE 單一條帶對應樣品的16S rDNA 序列經(jīng)NCBI 序列同源性分析和進化樹構建分析，結果表明，高效液相色譜分離得到的3 個洗脫峰與數(shù)據(jù)庫中序列同源性均達到99%及以上， 分析可知得到的細菌峰菌株屬于芽孢桿菌屬和假單胞菌屬， 包括： 脂肪酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus）、人參土芽孢桿菌（Bacillus ginsengihumi）、環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）和假單胞菌（Pseudomonas sp），說明了HPLC 技術能夠作為一種快速、 簡便的方法從復雜細菌體系中分離出單菌。

HPLC 技術在紅曲細菌分離、分析方面顯示出很大的創(chuàng)新性和優(yōu)越性。 通過HPLC 與PCRDGGE 技術相結合的分析方法， 能夠?qū)崿F(xiàn)色譜分離細菌16S rDNA 全長序列的直接測序， 無需進行膠回收。 與傳統(tǒng)PCR-DGGE 技術相比，具有鑒定序列較長、準確性高、試驗周期短、樣品可回收等優(yōu)點； 克服了現(xiàn)有分子生物學技術在對微生物進行分離、分析時存在準確性受限、菌體細胞無法回收、樣品制備困難以及試驗周期長等缺點，為復雜微生物體系的分離、分析提供新的思路。

下一代測序技術的不斷進展以及價格不斷下降，對深入分析復雜微生態(tài)體系具有重要的意義。但無論是現(xiàn)有的分子生物學技術還是下一代測序技術都是對分析樣品中的DNA 分子進行分析，其分析結果直接受制于微生物樣本DNA 提取和PCR 效果，具備理想的純度、濃度和完整性樣品的總DNA 的提取是研究的前提條件和關鍵。 所以在下一步研究中， 本課題組將繼續(xù)探討液相色譜技術在高質(zhì)量DNA 提取，從而輔助高通量測序技術分離、 分析腸道菌群等復雜微生態(tài)系統(tǒng)的應用潛力。