茹鑫

（上?？底R食品科技有限公司，上海 201103）

茶葉作為中華民族的傳統(tǒng)飲品已有上千年的歷史，并且被廣泛認為是一種具有保健功效的重要飲品[1-2]。長期以來，人們對茶葉的利用方式主要以泡制飲用為主。近年來，隨著食品加工技術(shù)的發(fā)展，茶葉的利用方式呈現(xiàn)多元化發(fā)展，從單一的飲用逐漸發(fā)展到飲用、食用、日用，有大量關(guān)于茶葉中功能成分在醫(yī)藥、日化、輕化、食品、油脂、保健等諸多方面的研究[3-9]。茶葉中含有較多的可利用成分，但是茶飲料、速溶茶等深加工所提取的成分只占茶葉的一部分，而茶渣中仍然含有膳食纖維、蛋白質(zhì)、茶多糖、茶黃素等各種營養(yǎng)成分，具有很高的利用價值[10-13]。隨著人們健康觀念的不斷提升，逐漸認識到膳食纖維具有獨特的生理作用，在保持消化系統(tǒng)健康方面有著突出效果，在預(yù)防慢性疾病方面越來越受到研究的重視，并已發(fā)展成為一種極為重要的功能性食品原料[14-15]。茶渣中含有大量的膳食纖維，制成茶葉膳食纖維產(chǎn)品的消化特性及其保健功效將直接影響其在食品中的應(yīng)用。因此，文章選用經(jīng)過浸提后的綠茶作為原料，將其粉碎成膳食纖維粉，并對其組成成分進行分析。然后采用胃蛋白酶-胰酶兩步測試法建立體外消化模型以模擬體內(nèi)消化環(huán)境，從而對茶葉膳食纖維粉在人體內(nèi)的消化特性進行初步探討，最后通過測試排便和腸道運動情況的動物實驗來評價其通便功能，期望能夠通過這些研究幫助茶葉膳食纖維粉應(yīng)用于具有通便和減肥功能的食品設(shè)計中，實現(xiàn)茶葉資源更進一步地利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉：市售綠茶（武陽早，浙江）；活性炭粉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司 （F20110506）；全麥粉（市售，山東濰坊全麥粉）；胃蛋白酶：美國Sigma公司，酶活≥250 units/mg；胰蛋白酶，美國Amresco公司；阿拉伯樹膠粉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司（F20101026）；復(fù)方地芬諾酯片：山東仁和堂藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字（H37021525，批號1506）；手術(shù)剪、眼科鑷、直尺、注射器、電子天平；雄性SPF級昆明鼠：上海市斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司動物，動物合格證號：（SCXK（滬）2013-0016）。

墨汁的配制：準(zhǔn)確稱取阿拉伯樹膠10 g，加水80 mL，煮沸至溶液透明，稱取活性炭5 g加至上述溶液中煮沸三次，待溶液涼后加水定容到100 mL，于冰箱中4℃保存，用前搖勻。

復(fù)方地芬諾酯混懸液的配制 （濃度為0.5 mg/mL）：取復(fù)方地芬諾酯片10 mg，用研缽研碎呈粉末后加水至20 mL臨用前配制。

1.2 方法

1.2.1 茶葉膳食纖維粉的制備[16]

取一定量優(yōu)質(zhì)綠茶，加入10倍水量，升溫至80℃水提1次，提取時間為40 min；經(jīng)過螺桿擠壓機（壓力0.5 MPa，時間15 s）后，再經(jīng)過干燥機（溫度120℃，干燥時間4 h）將茶葉的水分干燥到10%后，經(jīng)球磨機將茶葉粉碎后過篩得到茶葉膳食纖維粉。

1.2.2 茶葉膳食纖維粉的基本成分檢測

水分參照GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測定》方法測定；粗多糖參照SN/T 4260—2015《出口植物源食品中粗多糖的測定 苯酚—硫酸法》測定；蛋白質(zhì)參照GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》方法測定；茶多酚參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》測定；總膳食纖維、可溶性膳食纖維和不可溶性膳食纖維參照GB 5009.88—2014《食品中膳食纖維的測定》方法測定。

1.2.3 茶葉膳食纖維粉的消化特性研究

針對茶葉膳食纖維粉中的主要成分蛋白質(zhì)和膳食纖維，按照人體的基本消化流程，先胃蛋白酶作用后胰蛋白酶作用的順序，優(yōu)化蛋白酶的適宜量，經(jīng)類似腸胃蠕動的慢搖動方式進行體內(nèi)消化環(huán)境模擬。茶葉膳食纖維粉在胃、腸模擬體系消化之后，沉淀物經(jīng)65℃恒重干燥后研磨、取樣，以全麥蛋白為標(biāo)準(zhǔn)對比茶葉膳食纖維粉中蛋白質(zhì)的消化情況。

1.2.3.1 胃腸消化模擬實驗[17]

胃部消化模擬：取pH=2的磷酸緩沖溶液20 mL于250 mL錐形瓶，準(zhǔn)確加入茶葉膳食纖維粉樣品（或全麥粉對比樣品）2 g，加入適宜量胃蛋白酶；用1 mol/L的HCL或1 mol/L的NaOH調(diào)pH至2；再加入0.5 mL氯霉素（0.5 mg/mL乙醇），抑制細菌生長；加鋁箔后置于全溫搖瓶柜中37℃，120 r/min消化 4 h。

小腸消化模擬：胃部模擬消化后樣品用2 mL NaOH（0.6 mol/mL）中和；加入 10 mL pH=6.8 的磷酸緩沖溶液；再用1 mol/L的HCL或1 mol/L的NaOH調(diào)pH至6.8；加入適宜量胰蛋白酶后，置于全溫搖瓶柜中37℃，120 r/min消化6 h。

1.2.3.2 蛋白消化率的測定

消化后的樣品經(jīng)8000 rpm離心，除去上清液，沉淀物經(jīng)65℃，24 h干燥恒重。干燥樣品研磨后，稱重。樣品消化前和消化后的殘渣中的蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測定。

蛋白質(zhì)消化率=（消化前樣品蛋白質(zhì)含量－消化后沉淀物蛋白質(zhì)含量）/消化前樣品蛋白質(zhì)含量

1.2.4 茶葉膳食纖維粉的通便功能研究

采用 《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范實施手冊》（2003年出版）“通便功能檢驗方法”。受試物茶葉膳食纖維粉人體擬服用劑量為4 g/d（折合不溶性膳食纖維約為2 g/d），以此折算小鼠劑量，實驗設(shè)置劑量序列為人體劑量的5倍、10倍、30倍3個劑量處理組，目的是觀察人體等量劑量同時，了解對于小鼠各個劑量是否有相似的功能作用。

1.2.4.1小腸推進實驗

經(jīng)口灌胃給予造模藥物復(fù)方地芬諾酯，建立小鼠小腸蠕動抑制模型，計算一定時間內(nèi)小腸的墨汁推進率，來判斷模型小鼠胃腸蠕動功能。小白鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，受試品低、中、高三組劑量組，每組10只。茶葉膳食纖維粉雙蒸水配制后灌胃給予，給藥體積為20 mL/kg，空白對照組和模型對照組同樣途徑同樣體積給雙蒸水。

（1）小鼠體重和每日進食量測定

每天于第一次灌胃前稱量小鼠體重 （精確到0.1 g），據(jù)此計算每日灌胃量。每天固定給每籠小鼠一定量的鼠糧（50.0 g），于次日同一時間稱量剩余鼠糧重量（精確到0.1 g），即可算出小鼠每日進食量。

（2）小鼠便秘模型建立

給茶葉膳食纖維粉7 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對照組和三個劑量組灌胃給予復(fù)方地芬諾酯（5 mg/kg·BW），給藥體積為 10 mL/kg，空白對照組給同體積雙蒸水。

（3）指標(biāo)測定的方法

給復(fù)方地芬諾酯后0.5 h，劑量組分別給予含相應(yīng)受試樣品的墨汁 （含5%的活性炭粉、10%阿拉伯樹膠），空白和模型對照組給墨汁灌胃。25 min后立即脫頸椎處死動物，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉成直線，測量腸管長度為“小腸總長度”，自幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”。按下式計算墨汁推進率：

墨汁推進率按下式進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換獲得X，式中：P為墨汁推進率，用小數(shù)表示。

1.2.4.2 排便時間、糞便粒數(shù)和糞便重量的測定

經(jīng)口灌胃給予造模藥物復(fù)方地芬諾酯，建立小鼠便秘模型，測定小鼠的首粒排黑便時間、6 h內(nèi)排便粒數(shù)和排便重量，來反應(yīng)模型小鼠的排便情況。小白鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，受試品低、中、高三組劑量組，每組10只。茶葉膳食纖維粉經(jīng)雙蒸水配制后灌胃給予，給藥體積為20 mL/kg，空白對照組和模型對照組同樣途徑同樣體積給雙蒸水。

（1）小鼠體重和每日進食量測定

每天于第一次灌胃前稱量小鼠體重 （精確到0.1 g），據(jù)此計算每日灌胃量。每天固定給每籠小鼠一定量的鼠糧（50.0 g），于次日同一時間稱量剩余鼠糧重量（精確到0.1 g），即可算出小鼠每日進食量。

（2）小鼠便秘模型建立

給茶葉膳食纖維粉7 d后，各組小鼠禁食不禁水16 h。模型對照組和三個劑量組灌胃給予復(fù)方地芬諾酯（10 mg/kg·BW），給藥體積為 10 mL/kg，空白對照組給同體積雙蒸水。

（3）指標(biāo)測定的方法

給予復(fù)方地芬諾酯0.5 h后，劑量組分別給予含相應(yīng)受試樣品的墨汁 （含5%的活性碳粉、10%阿拉伯樹膠），空白和模型對照給予墨汁灌胃，動物均單籠飼養(yǎng)，正常飲水進食。從灌胃墨汁開始，記錄每只小鼠首粒排黑便時間，6 h內(nèi)的排便總粒數(shù)及重量，觀察記錄糞便性狀 （大小、軟硬程度等）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS統(tǒng)計軟件用進行實驗數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，以 p＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

在小腸便秘模型成立的前提下，受試樣品組小鼠墨汁推進率顯著高于模型對照組的墨汁推進率時，可判定該項實驗結(jié)果陽性。受試樣品組小鼠首粒黑便時間明顯短于模型對照組，即可判定該項指標(biāo)結(jié)果陽性。6 h內(nèi)排黑便粒數(shù)明顯高于模型對照組，可判定該項指標(biāo)結(jié)果陽性。6 h內(nèi)排黑便重量明顯高于模型對照組，可判定該項指標(biāo)結(jié)果陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉膳食纖維粉的基本成分分析

表1顯示了茶葉膳食纖維粉的基本成分含量，其主要組成成分為蛋白質(zhì)（22.28%）和膳食纖維（58.40%），所以實驗以蛋白質(zhì)消化率作為指標(biāo)來考察茶葉膳食纖維粉的消化特性。

表1 茶葉膳食纖維粉的基本成分分析Table 1 Component analysis of tea dietary fiber powder

2.2 茶葉膳食纖維粉的消化特性研究

2.2.1 胃蛋白酶最適量的優(yōu)化

由圖1可以看出，茶葉膳食纖維粉中蛋白質(zhì)隨著胃蛋白酶的添加消化率逐漸增加，當(dāng)達到5 mg/g濃度時，相同消化條件下，消化率的增長開始趨緩。根據(jù)植物蛋白的水溶性差異，可推測：酶添加量小于5 mg/g茶粉時，消化的主要為游離水溶性蛋白，蛋白質(zhì)消化率的增加與酶的添加量呈線性正相關(guān)；酶添加量大于5 mg/g濃度時，胃蛋白酶開始水解部分纖維間蛋白，蛋白質(zhì)消化率的增加隨酶的添加量線性關(guān)系不明顯。

圖1蛋白質(zhì)消化率隨胃蛋白酶添加量變化趨勢Fig.1 Protein digestibility varied with the amount of pepsin

由圖2可以看出，當(dāng)胃蛋白酶添加量由15 mg/g增加到20 mg/g時，蛋白質(zhì)消化率的增量比胃蛋白酶添加量由10 mg/g增加到15 mg/g時下降了2.2%。當(dāng)胃蛋白酶增加到15 mg/g濃度以后，蛋白質(zhì)消化率增量已經(jīng)下降明顯，所以選擇15 mg/g濃度作為胃蛋白酶體外模擬消化最適添加量的條件。

圖2 蛋白質(zhì)消化率增量隨胃蛋白酶添加量增量變化趨勢Fig.2 The increment of protein digestibility varied with the increment of pepsin

2.2.2 胰蛋白酶最適量的優(yōu)化

由圖3和圖4可以看出，隨著胰蛋白酶的添加，茶葉膳食纖維粉中的游離蛋白以及纖維間蛋白消化率逐漸增加。當(dāng)胰蛋白酶在茶葉膳食纖維粉胃蛋白酶消化液中的添加量由15 mg/g增加到20 mg/g時，蛋白的消化率增量趨零 （增量為0.09%）。

所以，最終確定體外消化模擬實驗條件為：胃蛋白酶的最優(yōu)活性條件為pH=2，添加量15 mg/g，消化4 h；在15mg/g蛋白酶添加量的消化條件下，胰蛋白酶的最優(yōu)pH=6.8，添加量為15 mg/g，消化時間6 h，以此分別模擬在胃環(huán)境消化4 h和小腸環(huán)境消化6 h。

2.2.3 茶葉膳食纖維粉體的外消化對比

由表2可以看出，在上述最優(yōu)消化條件下，測得茶葉膳食纖維粉的蛋白消化率為39.03%，全麥粉同等條件下消化率可以達到90.49%，相比之下兩者在蛋白消化率上有非常明顯的差異。經(jīng)查閱資料，分析其原因：茶葉膳食纖維粉中大部分蛋白為谷蛋白等非水溶性蛋白，難以被胃蛋白酶消化[11]；兩者的不可溶膳食纖維含量差異明顯，不可溶膳食纖維也會對蛋白質(zhì)在胰蛋白酶消化過程產(chǎn)生不利影響[18-20]。

圖3 蛋白質(zhì)消化率隨胰蛋白酶添加量變化趨勢Fig.3 Protein digestibility varied with the amount of trypsin

圖4 蛋白質(zhì)消化率增量隨胰蛋白酶添加量增量變化趨勢Fig.4 The increment of protein digestibility varied with the increment of trypsin

表2 茶葉膳食纖維粉和全麥粉的數(shù)據(jù)對比Table 2 The data comparison between tea dietary fiber powder and whole wheat flour

2.3 茶葉膳食纖維粉的通便功能研究

2.3.1 小鼠小腸推進率的影響

經(jīng)口給予各組小鼠受試品7 d，各組動物體重?zé)o顯著性差異。各組實驗結(jié)果見表3。

表3 茶葉膳食纖維粉對小鼠小腸推進率的影響（n=10，X±s）Table 3 Effect of tea dietary fiber powder on the small intestine advance rate of mouse （n=10，X±s）

模型對照組與空白對照組對比，小腸推進率和X值都有顯著性降低（p＜0.01），說明造模成功。與模型對照組相比，受試物茶葉膳食纖維粉中劑量組小鼠的小腸推進率 （與模型對照組比較p＜0.01）和X值都有顯著性升高（與模型對照組比較p＜0.05）；受試物茶葉膳食纖維粉低、高劑量組小鼠小腸推進率和X值均有升高的趨勢，但沒有出現(xiàn)顯著性差異（與模型對照組比較p＞0.05）。故可判定中劑量組茶葉膳食纖維粉對小鼠小腸推進結(jié)果陽性。

2.3.2 排便情況實驗

經(jīng)口給予各組小鼠不同劑量的受試品7 d，各組動物體重?zé)o顯著性差異。模型對照組與空白對照組相比，小鼠首粒排黑便時間明顯延長（與模型對照組比較p＜0.01），6 h內(nèi)排黑便粒數(shù)及重量都有顯著性降低（與模型對照組比較p＜0.05），說明造模成功。各組實驗結(jié)果見表4。

表4 茶葉膳食纖維粉對小鼠排便情況的影響（n=10，X±s）Table 4 Effect of tea dietary fiber powder on defecation situation （n=10，X±s）

與模型對照組相比，受試物茶葉膳食纖維粉中劑量組小鼠的首粒排黑時間顯著性縮短 （與模型對照組比較p＜0.05），受試物茶葉膳食纖維粉中劑量組小鼠6 h內(nèi)排黑便粒數(shù)及重量有升高的趨勢，但沒有出現(xiàn)顯著性差異 （與模型對照組比較p＞0.05）。受試物茶葉膳食纖維粉高劑量組小鼠首粒排黑便時間顯著性縮短（與模型對照組比較p＜0.01）。6 h內(nèi)排黑便粒數(shù)及重量均有顯著性升高（與模型對照組比較p＜0.01）。受試物茶葉膳食纖維粉低劑量組小鼠首粒排黑便時間有縮短的趨勢，6 h內(nèi)排黑便粒數(shù)及重量有升高的趨勢，但沒有出現(xiàn)顯著性差異 （與模型對照組比較p＞0.05）。判定高劑量組茶葉膳食纖維粉對小鼠首粒排黑便時間、6 h內(nèi)排黑便粒數(shù)及重量結(jié)果為陽性。

3 討論

（1）茶葉膳食纖維粉的主要組成成分為蛋白質(zhì)和膳食纖維，經(jīng)過和全麥粉相同消化條件下的對比實驗發(fā)現(xiàn)，在體外胃腸消化模擬實驗中茶葉膳食纖維粉中蛋白質(zhì)消化率較低，因為茶葉膳食纖維粉中不可溶膳食纖維含量過高導(dǎo)致難以消化，所以目前在茶制品生產(chǎn)中不能大量使用。

（2）下一步可以考慮采用膨化技術(shù)破壞膳食纖維晶格結(jié)構(gòu)，達到暴露蛋白質(zhì)的目的，以期可以提高茶葉膳食纖維粉中蛋白的消化率，使其可以經(jīng)人體充分消化、吸收和利用，減少食用后的不適感。

（3）經(jīng)動物實驗結(jié)果表明，小腸運動實驗為陽性，且首粒排黑便時間結(jié)果和6 h內(nèi)排便重量和糞便粒數(shù)結(jié)果為陽性，所以可以判定茶葉膳食纖維粉具有良好的通便功能，在后續(xù)的產(chǎn)品開發(fā)中，可以將茶葉膳食纖維粉應(yīng)用于具有通便和減肥功能的食品設(shè)計。