超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測(cè)定榛子中乙烯利的殘留

趙立蘋 林 芳

（通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)（上海）有限公司 上海 200233）

1 前言

乙烯利作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，具有植物激素促進(jìn)乳液分泌，加速成熟、脫落、衰老及促進(jìn)開(kāi)花的生理效應(yīng)。一定條件下，乙烯利不僅能釋放出乙烯，還能誘導(dǎo)植株產(chǎn)生乙烯，被廣泛運(yùn)用在農(nóng)業(yè)種植和生產(chǎn)方面，可以促進(jìn)果實(shí)成熟、植株矮化、提高產(chǎn)量。乙烯利不僅對(duì)人體的皮膚、眼睛有刺激作用，對(duì)粘膜有酸蝕作用，同時(shí)也可對(duì)水體造成污染。過(guò)量乙烯利被食用后可加速消化道衰老，造成消化道潰瘍，對(duì)大腦和腎臟也有一定的損害。GB 2763—2016《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[1]中對(duì)谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、干制水果、堅(jiān)果和調(diào)味料都規(guī)定了乙烯利的最大殘留量（MRL）。

乙烯利是一種極性較強(qiáng)的化合物，食品中乙烯利的檢殘留測(cè)方法主要有氣相色譜法[2,3]、離子色譜法[4-6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-9]。氣相色譜法中需要用到重氮甲烷甲基化試劑，操作要求較高且不方便，離子色譜法和液質(zhì)聯(lián)用研究對(duì)象集中在水果和蔬菜方面，針對(duì)堅(jiān)果類樣品研究較少。本文建立了一種超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)試榛子中乙烯利的殘留研究方法，該方法操作簡(jiǎn)單，可用于批量樣品中乙烯利的殘留檢測(cè)，為堅(jiān)果類樣品的研究提供了方便。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（Waters ACQUITY UPLC H-Class，Xevo TQ-s micro 型三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀）；SF-TGL-16M 型高速離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；XW-80A 型漩渦器（上海青浦滬西儀器廠）；WS-150D 型振蕩搖床（德國(guó) WIGGENS 公司）；950DAE 超聲儀（美國(guó) ETL TESTING 公司）；DC24H-RT 型氮?dú)鉂饪s儀（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；JA2003A 型電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；Milli-Q 型超純水儀（密里博中國(guó)有限公司）。OASIS WAX（3cc，60 mg，美國(guó) Waters 公司）；針式聚四氟乙烯濾膜:0.45 μm（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）100 μL、1 000 μL 移液槍（德國(guó) eppendorf 公司）。

乙烯利標(biāo)準(zhǔn)品（CAS No.16672-87-0，純度97.0%，AccuStandard）；Formic acid 甲酸（HPLC 級(jí)，美國(guó) DiKMA公司，純度 99.0%）；Methanol 甲醇（HPLC 級(jí)，美國(guó)DiKMA 公司，純度 99.9 %）；Acetonitrile 乙腈（HPLC級(jí)，美國(guó) DiKMA 公司，純度 99.9%）；Acetone 丙酮（HPLC 級(jí)，上海 ANPEL 公司，純度 99.5%）；Ammonium hydroxide 氨水（AR 級(jí)，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為一級(jí)水，符合相關(guān)國(guó)家要求。

精確稱取乙烯利標(biāo)品10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，配制成含乙烯利1.0 mg/mL的溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至1.0 μg/mL。分別準(zhǔn)確移取 50 μL、100 μL、150 μL、200 μL 和500 μL 1.0 μg/mL 于 10 mL 容量瓶中，用 0.1%甲酸水定容至刻度，搖勻，配制成 5 μL、10μL、15 μL、20 μL和50 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

2.2 儀器條件

2.2.1 液相色譜條件

2.2.2 質(zhì)譜條件

電離模式:電噴霧正離子源模式（ESI+）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；脫溶劑溫度:500℃；脫溶劑氣流速:1 000 L/Hr；毛細(xì)管電壓:3.0 kV；離子源溫度:150℃；孔電壓:36.0 V；駐留時(shí)間:0.054 s；監(jiān)測(cè)離子對(duì)分別為 m/z145＞91、m/z145＞81，2 者的碰撞能分別為 12 V和 18 V，其中，m/z145＞91 為定量離子。

2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

榛子去殼，粉碎，混勻，稱取1.0 g（精確至0.01 g）榛子于50 mL 離心管中，加入40 mL 0.1%甲酸水搖勻，超聲提取30 min，10 000 rpm 離心 2 min。準(zhǔn)確移取 2 mL 上清液過(guò) WAX 柱（3 cc，60 mg，使用前用3 mL 甲醇，3 mL 水活化），上樣后分別用 3 mL 水和3 mL 甲醇淋洗，最后用5 mL 10%氨化甲醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，在40°C 下氮吹洗脫液至干，用2 mL 0.1%甲酸-水溶液復(fù)溶，過(guò)0.45 μm 濾膜，上機(jī)測(cè)試。

3 結(jié)果和討論

3.1 質(zhì)譜條件的選擇

對(duì)1 mg/L 的乙烯利標(biāo)準(zhǔn)溶液在不接色譜柱的條件下，用電噴霧正離子模式（ESI+）進(jìn)行母離子全掃描，確定乙烯利正離子模式的[M+H]+為m/z145；利用手動(dòng)優(yōu)化模式對(duì)子離子、孔電壓和碰撞能等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確認(rèn)優(yōu)化后的參數(shù)為m/z145＞91、m/z 145＞81 時(shí)，2 個(gè)離子對(duì)信號(hào)最強(qiáng)。根據(jù)優(yōu)化后的最佳質(zhì)譜條件建立ESI（+）的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方法。

3.2 流動(dòng)相的選擇

表1 0.01 ng 乙烯利在不同流動(dòng)相的響應(yīng)值及信噪比（S/N）

3.3 前處理方式的選擇

3.3.1 提取溶液的選擇

因乙烯利極性較強(qiáng)，所以選擇了極性較強(qiáng)的溶劑作為提取液，研究了10%丙酮-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸-甲醇/水（1：1）、甲醇:水（1：1）對(duì)加標(biāo)樣品（添加量為 0.2 mg/kg）的提取效率。結(jié)果表明，在4 種提取液種采用0.1%甲酸水溶液的提取效率最高，確定提取液為0.1%甲酸水溶液，詳見(jiàn)表2。

3.3.2 WAX 凈化柱洗脫液的優(yōu)化

乙烯利是一種極性較強(qiáng)的弱陰離子化合物，選用OASIS WAX 弱陰離子交換SPE 柱子進(jìn)行凈化。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化氨化甲醇溶液中氨水濃度及洗脫體積。對(duì)樣品中添加了乙烯利 0.2 mg/kg，做 1%、5%和10%氨化甲醇濃度水平分別在洗脫2.0 mL、5.0 mL和10.0mL 洗脫溶劑的交叉試驗(yàn)，以回收率表示。選擇出最優(yōu)的凈化洗脫條件（表3）。由表3可知，采用5 mL 10%氨化甲醇作為洗脫液體積時(shí)，可得到預(yù)期的洗脫效果，所以確定采用5 mL 10%氨化甲醇作為洗脫溶劑。

表2 乙烯利添加量0.2 mg/kg 時(shí)不同提取液的提取率

表3 0.2 mg/kg 加標(biāo)在不同氨化甲醇中濃度用不同洗脫體積條件的回收率（%）

3.4 線性范圍和方法的檢出限

將配制 5μg/L、10μg/L、15 μg/L、20 μg/L 和 50 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液注入超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)試，以峰面積對(duì)乙烯利的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參考GB/T 27417—2017 《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[10]中空白偏差法評(píng)估方法檢出限和定量限。具體操作如下:分別在10 個(gè)空白樣品中加入乙烯利標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成含有5 μg/L 的樣品溶液，分別注入超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)試，得乙烯利含量，計(jì)算乙烯利含量的3 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差即為方法檢出限，10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差即為方法定量限，結(jié)果詳見(jiàn)表4。由表4可知，乙烯利在 5～50 μg/L 時(shí)，標(biāo)注曲線的相關(guān)系數(shù)r 大于0.995，方法的檢出限為0.04 mg/kg，定量限為0.13 mg/kg。

3.5 準(zhǔn)確度和精密度

在榛子樣品進(jìn)行乙烯利標(biāo)準(zhǔn)溶液的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平分別為 0.2 mg/kg、0.4 mg/kg 和 1.0 mg/kg，采用相應(yīng)處理方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6 次，乙烯利在榛子樣品中的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差詳見(jiàn)表5。由表5可知，乙烯利在榛子樣品中的回收率為90.0%～102.0%，RSD 為4.9%～8.2%，可以滿足定量分析的要求，說(shuō)明所建立的方法是可行的。

表4 乙烯利的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）

表5 榛子樣品中不同濃度水平乙烯利的回收率和精密度（RSD）

4 結(jié)語(yǔ)

本文采用0.1%甲酸水溶液作為提取劑，經(jīng)WAX柱凈化，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)試，建立了榛子堅(jiān)果樣品中乙烯利殘留的檢測(cè)法方法。該方法操作簡(jiǎn)便，C18 分析柱更方便實(shí)驗(yàn)室的日常操作，具有提取溶劑環(huán)保，對(duì)環(huán)境污染小，回收率好，精密度高等特點(diǎn)，適用于堅(jiān)果中乙烯利殘留的檢測(cè)。