高效液相色譜法提取和分析β-胡蘿卜素

陳君堯

（武漢輕工大學生物與制藥工程學院 湖北武漢 430000）

1 前言

β-胡蘿卜素是一種非常常見的類胡蘿卜素。β-胡蘿卜素的顏色是黃色和橙色，很容易從水果和其他植物中提取。

β-胡蘿卜素不僅在食品技術(shù)中有許多用途，更重要的是，它對人體也有許多益處，因此，在研究中變得越來越重要。從食品科學的角度研究β-胡蘿卜素可以全面了解其成分、組成元素、化學性質(zhì)和營養(yǎng)價值。

β-胡蘿卜素是一種抗氧化劑，但是對于吸煙者來說，他們攝入的β-胡蘿卜素的高含量可能會增加患癌癥的風險。因此，適量的β-胡蘿卜素有利于人體健康。

β-胡蘿卜素可以在人體內(nèi)轉(zhuǎn)化為維生素A，而維生素A 是必需的維生素。維生素A 有許多重要用途，也有一些研究證實，通過飲食攝入β-胡蘿卜素中的維生素A 可以應(yīng)用于人體的許多方面。例如，維生素A 有利于皮膚健康和黏液膜、免疫系統(tǒng)和視力；也有一些研究證明，每天攝入適量的β-胡蘿卜素可以減少癌癥和心血管疾病。

β-胡蘿卜素的另一個益處是其可以延遲認知辨別能力的下降。在人們的身體中，氧化應(yīng)激是導致認知能力下降的主要原因，研究證實了這一點。在這種情況下，β-胡蘿卜素是一種抗氧化劑，可以防止認知能力的惡化，因為補充抗氧化劑可以調(diào)節(jié)機體的活性氧種類和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡[1]。因此，越來越多的研究者將使用不同的抗氧化劑。本實驗采用高效液相色譜法對β-胡蘿卜素進行了分析。

高效液相色譜（HPLC）是分析化學中的一項現(xiàn)代技術(shù)。它用于檢測混合物的不同成分，依靠泵的功率使樣品混合物通過填充有固體吸附材料的柱，樣品中的不同組分與吸附材料有不同程度的反應(yīng)，這將導致不同組分在管，最終結(jié)果是組件彼此分離[2]。此外，高效液相色譜根據(jù)物質(zhì)的極性或是否為親水性組分離不同的物質(zhì)。目前，高效液相色譜法已在許多應(yīng)用中得到應(yīng)用，例如，藥物、分離生物樣品的研究和醫(yī)學方面。在食品研究領(lǐng)域，高效液相色譜法也被廣泛應(yīng)用于食品成分的研究，如脂質(zhì)、維生素、氨基酸和無機陰離子等，是食品分析研究的熱點[3]。

2 材料與方法

2.1 材料

實驗器材:電動攪拌器；燒杯；錫箔；磁力攪拌器；真空過濾器；布氏漏斗；Whatman 42 號濾紙；收集瓶；100 mL 容量瓶；250 mL 圓底瓶；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；超聲波??；高效液相色譜瓶；50 mL 容量瓶；25 mL容量瓶。

2.2 實驗方法

在電動攪拌器中對胡椒粉進行均質(zhì)化，并在干凈、干燥的燒杯中稱取5 g 勻漿，燒杯確保用錫箔包裹。將 62 mL 萃取溶劑（甲醇）、2.5 g 無水硫酸鹽和0.5 g 碳酸鎂添加到勻漿中，并將所有成分混合5 min。在這一步中使用了磁力攪拌器，必須在煙霧柜中進行。在此過程中，燒杯被錫箔覆蓋，勻漿通過裝有Whatman 42 號濾紙的Buchner 漏斗真空過濾。在這個過程中，收集瓶和布氏漏斗的頂部被錫箔覆蓋。當沒有更多的濾液通過時，用2×10 mL 等份提取溶劑清洗濾餅。

清洗濾餅的濾液轉(zhuǎn)移到干凈、干燥的250 mL 圓底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸發(fā)至干燥。將旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的溫度控制在30℃～40℃，保持儀器不受光照。用超聲波浴將殘余物重新溶解在10 mL 甲醇中。最后，將溶液樣品注入高效液相色譜小瓶中，并在高效液相色譜中分析，條件為:波長450 nm、流動相（乙腈）∶四氫呋喃（THF）∶水為 85∶12.5∶2.5、流速 2.0 mL/min，在此條件下β-胡蘿卜素的保留時間應(yīng)約為10 min。

2.3 樣品制備

稱取12.5 mg β-胡蘿卜素，溶解于最小體積的THF 中，用50 mL 容量瓶添加樣品，用THF 將 50 mL容量瓶定容，并用錫箔覆蓋。從儲備溶液中取出0.25 mL、0.50 mL、0.75 mL、1.00 mL 等分試樣，并將其轉(zhuǎn)移到單獨的25 mL 容量瓶中。用THF 將25 mL容量瓶定容，并用錫箔覆蓋4 個容量瓶，用上述高效液相色譜法對這些標準品進行分析。

3 實驗結(jié)果

標準溶液配置的濃度詳見表1，用高效液相色譜法測定的4 個濃度梯度和1 個樣品的含量詳見表2，β-胡蘿卜素標準線圖詳見圖1。

表1 標準溶液的濃度

表2 高效液相色譜法測定的4 個濃度梯度和1 個樣品的含量

（續(xù)表2）

圖1 β-胡蘿卜素標準線

未知濃度溶液的計算如下:

Y=1 016.5X+5.086 6，X 為樣品濃度，Y 為樣品峰面積=1 316.045，M 為坡度=1 016.500，C 為截距=5.086，Y=MX+C

重新排列得到結(jié)果如下:

X=（Y-C））/M 即 X=（1316.045-5.086））/1016.500=1.290 mg/L

參考值為100 g，但本實驗中，將5 g 樣品放入燒杯中，因此，需要將實驗值返回到參考值，并且2 個砝碼之間的差值的倍數(shù)為100/5=20。因此，最終計算結(jié)果需要乘以20。所以，未知溶液濃度的最終結(jié)果為 1.290×20=25.806 mg/100g。

4 討論與分析

4.1 批判性分析

在本實驗中，主要的誤差是光、氧、熱不能在實驗室中完全分離，β-胡蘿卜素對光、氧、熱、不穩(wěn)定，因此，本實驗中的所有玻璃容器在整個過程中都被錫箔覆蓋。當實驗過程進行到真空過濾時，實驗員將燒杯的錫箔取出，通過布氏漏斗對勻漿進行真空過濾，由于光線的照射，使得β-胡蘿卜素的濃度低于正常值。此外，當使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器干燥圓底燒瓶時，助手應(yīng)在此過程中除去錫箔。幸運的是，標準函數(shù)中的確定系數(shù)非常接近1（R2=0.995 3），這意味著4 個梯度標準數(shù)據(jù)非常匹配。

在第2 個實驗中，主要的誤差來自于溶液的定容和光照。由于透視上的差異，在這個過程中，改變了溶液體積，這可能導致標準溶液濃度的偏差。另一個產(chǎn)生誤差的原因是，當溶液轉(zhuǎn)移到HPLC 小瓶時，β-胡蘿卜素溶液的梯度濃度被倒入不同的燒杯中，在此期間，標準溶液暴露在光下。

4.2 方法比較

測定β-胡蘿卜素的方法還有很多，例如，紫外分光光度法和紙色譜法。

4.2.1 紫外分光光度法

對于紫外分光光度法而言，該方法檢測β-胡蘿卜素的優(yōu)點在于，它能夠以簡單、快速的方式檢測成分，同時不會污染環(huán)境和降低成本；更重要的是，其具有較高的重現(xiàn)性和重復性，但主要缺點是精度不夠高[4]。

其操作方法如下:

樣品在玻璃燒杯中稱取1 g，振蕩15 min，向燒杯中加入5 mL 冷丙酮，溫度控制在約4℃，最后高速離心10 min，上層分離的上清液在另一管中收集。5 mL 丙酮和再萃取將活性化合物混合并離心，然后取上清液與第1 個上清液混合，將上清液通過Whatman 第42 號濾紙，在紫外-可見分光光度計中以449 nm 波長測定提取物的吸光度。

對胡蘿卜樣品的空白溶液進行梯度濃縮稀釋處理，提取方法與上述方法相同。通過后插法將光密度值繪制為濃度對應(yīng)的標準曲線，從而計算β-胡蘿卜素的含量。

4.2.2 紙色譜法

紙色譜法利用混合物的不同極性和溶解性來實現(xiàn)分離，紙色譜法的優(yōu)點是分離效率高，但操作步驟更為復雜，在進行大量的數(shù)據(jù)分析和處理時，有許多限制因素，而且不夠精確[5]。

其操作方法如下:

將濾紙切割成12 cm×14 cm 的形狀，確保邊緣必須垂直，在紙邊緣用鉛筆畫出1.5～2 cm 的線，將胡蘿卜汁浸入毛細血管中，放在鉛筆畫的直線上，重復多次，直到直線上有一個大約2 cm 的小圓圈，將12 cm 的端部卷成圓柱形，并使用回形針固定端部。將紙卷和一定量的分離液放入燒杯中，將燒杯密封5 min，然后取出濾紙，觀察β-胡蘿卜素的運動并記錄最遠的距離，最后計算β-胡蘿卜素的距離顏色行程/溶劑前行程即Rf 值。

4.3 實驗數(shù)據(jù)的改進

實驗中存在一定的誤差，這一系列結(jié)果之間的一致性程度可以通過重復性實驗進行檢驗。重復性實驗的定義是:同一方法、同一試劑、同一樣品進行多次實驗，2 個獨立試驗結(jié)果在概率水平為95%時的最大差異，由于一個實驗的偶然性，它是需要多次進行實驗以提高準確性。重復性實驗之所以重要，是因為無論是在機器加工上還是在樣品制備過程中，通常都會有一些誤差，但重復性實驗可以大大減少這些誤差。MENT 是最佳選擇，從統(tǒng)計學的角度來看，為了減少每組數(shù)據(jù)之間和每組數(shù)據(jù)內(nèi)的誤差，進行了多次重復性實驗，同時計算平均值和標準差以確定重復性的成功，通常標準偏差值越小，重復性越好[6]。

在本實驗中，誤差可分為人為誤差和系統(tǒng)誤差兩大類。為了減少系統(tǒng)誤差，首先要做的是校準儀器。例如，在本實驗中，可以在實驗前向高效液相色譜中注入空白對照溶液，通過峰圖確定機器是否可以正常使用；另一種減小誤差的方法是多次重復實驗，因此也可以多次注入樣品溶液，并比較從機器獲得的數(shù)據(jù)。通過計算標準差，可以選擇最小值的數(shù)據(jù)，這是一種減少系統(tǒng)誤差的方法。

對于人為錯誤，這可以通過團隊來減少錯誤的發(fā)生。例如，在這個實驗中，β-胡蘿卜素樣品溶液可以被同一個團隊多次配置，每個團隊成員都將被分配任務(wù)，并且團隊成員可以互相監(jiān)督以遵守實驗的步驟，每個步驟都將遵循實驗規(guī)則，避免了單一樣品溶液中的偶然誤差，最后通過對高效液相色譜分析數(shù)據(jù)的比較，選擇標準偏差最小的數(shù)據(jù)集作為最合適的實驗數(shù)據(jù)。