楊眉 雷松 陳昱 羅添友

（四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科 四川 成都 610041）

過(guò)碘酸雪夫染色（PAS染色）是腎穿刺活檢病理常用的組織化學(xué)染色之一，主要用于顯示腎小球系膜區(qū)范圍和基底膜的厚度，也可顯示腎小球內(nèi)某些滲出性蛋白、節(jié)段性硬化和結(jié)節(jié)性病灶[1-2]。手工染色易受人為環(huán)境因素影響，質(zhì)量不易控制。我科引進(jìn)全自動(dòng)特殊染色機(jī)一年多來(lái)，已做腎臟PAS染色1400余例取得良好效果，現(xiàn)介紹如下。

1.材料與方法

1.1 石蠟組織標(biāo)本

隨機(jī)選取四川大學(xué)華西醫(yī)院病理科2018年6月腎臟穿刺標(biāo)本30例，其中本院15例、外院標(biāo)本15例。

1.2 儀器與試劑

BenchMark Special Stains全自動(dòng)特殊染色機(jī)，PAS Stain Kit染液套裝（包括PAS PERIOD.ACID，PAS HEMATOXYLIN，PAS NEUTRALIZER，PAS SCHIFFS）、脫蠟液、清洗液、液體封蓋油膜。手工染色試劑均由科室自行配置。

1.3 樣本制備

腎臟穿刺組織石蠟切片2μm，65℃烤箱烤片15～20min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法：

1.4.1 BenchMark Special Stains全自動(dòng)特殊染色機(jī)染色步驟如下：65℃烤片4min，75℃烤片4min；76℃加1000μL脫蠟液和液體封蓋油膜脫蠟×4次，6min；37℃加清洗液清洗×2次；37℃加液體封蓋油膜和2000μL PAS PERIOD.ACID染色4min；45℃加清洗液和液體封蓋油膜清洗×2次；45℃加液體封蓋油膜和2000μLPAS SCHIFFS染色，20min；45℃加清洗液和液體封蓋油膜清洗×2次，9min；45℃加液體封蓋油膜和2000μLPAS HEMATOXYLIN染色，8min；沖洗；手工脫水透明，儀器染色時(shí)長(zhǎng)80min。

1.4.2 手工PAS染色方法，切片脫蠟至水，蒸餾水洗3次，入1%過(guò)碘酸液10min，蒸餾水洗3次，入Schiff試劑40～60min，熱水返紅5min，自來(lái)水洗，入蘇木素染液3min,自來(lái)水洗，入1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗3min，染色時(shí)長(zhǎng)100～120min，脫水透明封片。

2.結(jié)果

細(xì)胞核呈藍(lán)色，腎小球系膜、基底膜以及腎小管呈紫紅色。手工染色時(shí)在染色時(shí)間不延長(zhǎng)的情況下標(biāo)本著色鮮艷程度隨著染色次數(shù)的增加而降低，尤其外院標(biāo)本（兒童標(biāo)本）明顯。機(jī)器染色結(jié)果穩(wěn)定（圖1～4）。

圖1，2本院標(biāo)本同一組織視野（PAS×400）圖1手工PAS染色結(jié)果，圖2機(jī)染PAS染色結(jié)果，腎小球和腎小管基底膜結(jié)構(gòu)清晰，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較圖1更明顯。圖1、圖2分別為手工和機(jī)器試劑的第一批次染色。圖3，4 均為外院標(biāo)本同一組織視野（PAS×400）圖3手工PAS染色結(jié)果，為手工染色試劑的第一批次染色。圖4機(jī)器染色結(jié)果，為機(jī)器套裝試劑的第一批次染色。

3.討論

手工PAS染色存在的主要問(wèn)題：（1）我科腎臟穿刺標(biāo)本包括本院腎內(nèi)科及外院標(biāo)本。由于標(biāo)本類型、前期處理等存在差異因素，手工染色時(shí)不同來(lái)源的標(biāo)本染色時(shí)間不同，非本院腎內(nèi)科標(biāo)本均需要延長(zhǎng)Schiff試劑染色時(shí)間。（2）Schiff液配制繁瑣、失效較快、保存條件較嚴(yán)格[3]。（3）染液是重復(fù)使用，染色時(shí)間需要逐步延長(zhǎng)。（4）很多實(shí)驗(yàn)室自行配制的蘇木素沒(méi)有純化，試劑里面有很多雜質(zhì)及蘇木精淀，且蘇木素在使用過(guò)程中與空氣接觸會(huì)繼續(xù)氧化，產(chǎn)生氧化膜，需要定期過(guò)濾蘇木素，避免染色效果差。

BenchMark Special Stains全自動(dòng)特殊染色機(jī)具有更多優(yōu)勢(shì)：（1）全程標(biāo)準(zhǔn)化。染色機(jī)有20個(gè)可獨(dú)立控溫、運(yùn)行的玻片位，切片后可直接獨(dú)立進(jìn)行烘烤、脫蠟和組織化學(xué)染色等工作。（2）操作簡(jiǎn)單，染色自動(dòng)化。機(jī)器根據(jù)標(biāo)簽信息自動(dòng)匹配完成染色全過(guò)程。（3）染色時(shí)間較手工染色時(shí)間短。染色機(jī)可針對(duì)不同來(lái)源的標(biāo)本個(gè)性化設(shè)置不同的染色程序，通過(guò)改變溫度等方式在相同時(shí)間里完成染色且著色鮮艷，對(duì)比度明顯。（4）商品化試劑盒，放4℃冰箱保存。一套試劑可染75張切片，我們科室4～5次用完一盒試劑，如此可避免多次復(fù)溫導(dǎo)致試劑失效。染色機(jī)采用單張滴染技術(shù)，每張玻片均為新鮮試劑，保證染色質(zhì)量穩(wěn)定。

全自動(dòng)染色機(jī)還具有以下特點(diǎn)：（1）切片染色過(guò)程中滴加液體封蓋油膜，該油膜是一種低密度輕脂油，而染液多為水溶性試劑密度大于油膜，染色時(shí)油膜能夠包裹在反應(yīng)液和染液的外表層同時(shí)利用液體的張力，起到保溫的作用同時(shí)防止試劑揮發(fā)，維持整張玻片反應(yīng)體系恒定。（2）工作量大，玻片數(shù)量多時(shí)可設(shè)置過(guò)夜程序，夜間也可染色從而提高工作效率。（3）儀器可自動(dòng)識(shí)別試劑量是否足夠。（4）染色機(jī)可進(jìn)行管道沖洗，避免真菌污染和不同染色的交叉污染。（5）噴射式清洗，降低染色背景。（6）廢液排入廢液桶，集中處理，避免污染環(huán)境。但是，全自動(dòng)染色機(jī)試劑成本較高。

綜上，全自動(dòng)特殊染色機(jī)在腎臟PAS染色中流程標(biāo)準(zhǔn)化其效率、質(zhì)量、穩(wěn)定性等方面確實(shí)優(yōu)于手工操作，能夠?yàn)榕R床診斷提供可靠依據(jù)。