基于基因芯片技術(shù)研究焦慮抑郁障礙對女性高血壓患者基因表達(dá)譜的影響

郜 琳，王 倩，劉永政

(秦皇島市第一醫(yī)院 1.老年病二科；2.心血管病一科，河北 秦皇島066000)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，全球大約三分之一的成年人伴有血壓升高，其中一半的人將罹患中風(fēng)或心臟疾病[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，社會(huì)節(jié)奏不斷加快，越來越多的人患有焦慮抑郁障礙(ADC) 等精神疾病。研究表明，ADC與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。流行性病學(xué)調(diào)查表明，焦慮使非高血壓人群患高血壓風(fēng)險(xiǎn)增加約2倍，抑郁使非高血壓人群患高血壓風(fēng)險(xiǎn)增加約3.5倍[3]。為了進(jìn)一步探索ADC在高血壓中的潛在機(jī)制，我們選取女性高血壓伴或不伴ADC患者作為研究對象，通過基因芯片檢測，從而進(jìn)一步了解ADC對高血壓患者基因表達(dá)譜的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年10月至2017 年10 月在我院門診和住院診治的老年女性原發(fā)高血壓并患ADC的患者(平均年齡：65±1.0歲)10例作為研究對象(ADC組)。同時(shí)，選取同期老年女性原發(fā)高血壓不伴ADC的患者(平均年齡：65±1.0歲)10例作為對照組(Control 組)。原發(fā)性高血壓根據(jù)WHO原發(fā)性高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。排除既往有惡性腫瘤，急性心肌梗死，心功能不全，心臟瓣膜病，藥物或酒依賴，精神病病史及病情嚴(yán)重者。兩組患者對試驗(yàn)操作和目的均充分了解并簽署了知情同意書。

1.2 ADC診斷方法

在患者就診時(shí)，3名經(jīng)過嚴(yán)格訓(xùn)練的專業(yè)人員分別對病人進(jìn)行問卷調(diào)查，利用HADS量表對患者的精神狀態(tài)進(jìn)行評估。ADC診斷符合中國精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)第3版診斷標(biāo)準(zhǔn)(CCMD-3)[5]。HADS由焦慮(HADS.A) 14 項(xiàng)評分和抑郁(HADS.D) 17 項(xiàng)評分兩部分組成。項(xiàng)目評分為0-3分，焦慮和抑郁總分為21分。本研究選取>8分作為篩選臨界值(>8分認(rèn)為有焦慮或抑郁癥狀，記為ADC陽性)。

1.3 方法

確診后次日7時(shí)，分別采集Control 組和ADC組患者空腹血液標(biāo)本10 ml，并分裝為2管(其中1管用于基因檢測，另一管用于PCR驗(yàn)證)，保存于-80℃冰箱中備用。北京博朗生物科技公司進(jìn)行基因芯片制備、RNA 標(biāo)記、芯片雜交和芯片掃描實(shí)驗(yàn)。

在本研究中，我們利用String在線工具(https://string-db.org/cgi/input.pl)分析差異表達(dá)基因間的可能內(nèi)部聯(lián)系。差異表達(dá)基因的基因本體論(GO)分析被用于注解基因和基因產(chǎn)物，包括生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)三大類信息[6]。京都基因與基因組百科全書(KEGG)是基于基因功能的系統(tǒng)性分析，包括一系列基因組和酶的方法[7]。String在線工具10.0版本包括取自2031個(gè)器官的9,643,763種蛋白[8]。String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)被用于評估和檢測蛋白與蛋白間的相互作用，包括直接和間接的聯(lián)系。為了評估不同差異表達(dá)蛋白間的相互聯(lián)系，我們根據(jù)通路和功能富集分析，使用String在線工具建立了差異表達(dá)蛋白間的蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示。各組間差異采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片結(jié)果

與Control 組比較，ADC組共有287基因表達(dá)上調(diào)，141個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。根據(jù)差異倍數(shù)(Fold Change,FC)，分別將表達(dá)差異最大的10個(gè)基因篩選出來(見表1，2)。

2.2 差異表達(dá)基因的GO分析

通過利用STRING數(shù)據(jù)庫 (https://string-db.org/cgi/input.pl)去評估和預(yù)測Control 組和ADC組差異表達(dá)基因可能存在的直接或間接的聯(lián)系。結(jié)果表明，BP共涉及9種：腎素-血管緊張素對血液量的調(diào)節(jié)、肽激素處理、醛固酮生產(chǎn)的腎素-血管緊張素調(diào)節(jié)、血管大小調(diào)節(jié)、全身動(dòng)脈血壓調(diào)節(jié)、腎素-血管緊張素對全身動(dòng)脈血壓的調(diào)節(jié)、血液中血管緊張素水平的調(diào)節(jié)、血管緊張素成熟過程、β-淀粉樣蛋白代謝過程(圖1A)。CC為膜筏(圖1B)。MF主要以基因產(chǎn)物生物活性為特征，包括特異性綁定到配體或結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)中MF為：緩激肽受體結(jié)合，受體結(jié)合(圖1C)。

表1 Control 組和ADC組差異表達(dá)基因(上調(diào))

2.3 差異表達(dá)基因的KEGG分析

結(jié)果表明，明顯富集的信號通路為：腎素-血管緊張素系統(tǒng)(圖1D)。

表2 Control 組和ADC組差異表達(dá)基因(下調(diào))

圖1 差異表達(dá)基因的GO分析和KEGG分析

利用String在線工具，分析Control 組和ADC組差異表達(dá)基因。(A)GO分析的BP分類 (B) GO分析的CC分類 (C) GO分析的MF分類(D) 不同組的KEGG信號通路分析。

2.4 差異表達(dá)基因蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

所有差異表達(dá)基因總共包括13個(gè)節(jié)點(diǎn)，6條線。 所有差異表達(dá)基因共有6種配對關(guān)系。該配對關(guān)系分別為：ACE-AGTR1(0.955)，ACE-REN(0.955)，AGTR1-REN(0.947)，AGTR1-CD4(0.912)，NPPA-REN(0.702)，NPPA-ACE (0.596)(圖2)。

3 討論

高血壓是一種以動(dòng)脈收縮壓和舒張壓升高并伴心、腦、腎和視網(wǎng)膜等器官受累為特征的全身性疾病。高血壓對患者的生命安全有極大的威脅，是心血管疾病死亡的主要原因[9]。隨著生活節(jié)奏的加快，人們的心理負(fù)擔(dān)、生活壓力不斷加大，從而導(dǎo)致利用String數(shù)據(jù)庫，分析Control 組和ADC組差異表達(dá)蛋白間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。每個(gè)彩色圓球代表一種蛋白，每一條直線代表某兩個(gè)蛋白間的相互聯(lián)系。

圖2 差異表達(dá)基因的PPI分析

高血壓的發(fā)病率也逐年遞增。在環(huán)境因素刺激下，患者將反復(fù)出現(xiàn)明顯的精神緊張、焦慮、煩躁等情緒波動(dòng)，較大的情緒變化促使大腦皮層異常興奮，交感神經(jīng)活動(dòng)增強(qiáng)，抑制平衡失調(diào)，從而使小動(dòng)脈收縮，周圍血管阻力上升，血壓升高[9]。獨(dú)立研究、系統(tǒng)綜述及薈萃分析證據(jù)表明，焦慮是慢性身體疾病發(fā)生發(fā)展的一個(gè)獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，其與高血壓、糖尿病、冠狀動(dòng)脈性心臟病等多種慢性疾病都有著密切的聯(lián)系[10-12]。研究表明，ADC將導(dǎo)致自主神經(jīng)功能的改變，包括激活交感神經(jīng)和抑制副交感神經(jīng)，從而升高血壓。此外，ADC將導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺軸功能紊亂，進(jìn)而引起促腎上腺皮質(zhì)激素對促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的反應(yīng)性增強(qiáng)，增加促腎上腺皮質(zhì)激素和皮質(zhì)醇的分泌與釋放，最終導(dǎo)致心排出量增加，血壓升高[13]。

在本研究中，我們收集符合條件的高血壓患者作為研究對象，同時(shí)利用HADS量表對患者的精神狀態(tài)進(jìn)行評估。此外，我們采用基因芯片技術(shù)對Control 組和ADC組差異表達(dá)基因進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與Control 組比較， ADC組共有287基因表達(dá)上調(diào)，141個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。然后，我們根據(jù)FC分別將表達(dá)差異最大的10個(gè)基因篩選出來，并利用String在線工具對這20個(gè)基因關(guān)系進(jìn)行分析。

結(jié)果顯示，腎素-血管緊張素對血液量的調(diào)節(jié)，醛固酮生產(chǎn)的腎素-血管緊張素調(diào)節(jié)，血管大小調(diào)節(jié)，血液中血管緊張素水平的調(diào)節(jié)，以及腎素-血管緊張素系統(tǒng)等與高血壓伴ADC明顯相關(guān)。在這表達(dá)明顯差異的基因中，REN、ACE是2個(gè)與高血壓密切相關(guān)的基因。

過去研究發(fā)現(xiàn)，ACE(血管緊張素Ⅰ 轉(zhuǎn)換酶)基因與冠心病、心肌梗死、原發(fā)性高血壓、糖尿病腎病等疾病密切相關(guān)。胡福莉等指出，ACE基因插入缺失多態(tài)性與高血壓左室肥厚有關(guān)[14]。本試驗(yàn)通過基因芯片檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ADC組較Control 組REN明顯上調(diào)，ACE明顯下調(diào)，這可能預(yù)示著ADC在加重高血壓患者病情過程中是通過調(diào)節(jié)REN和ACE基因的表達(dá)。