不同濃度胰島素原對大鼠肝臟細(xì)胞胰島素敏感性的影響及意義

邵 紅，杜 娟，王 銳，黃 毅

(1.吉林省人民醫(yī)院,吉林 長春130021;2.長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校)

高胰島素血癥和胰島素抵抗(IR)導(dǎo)致2型糖尿病(T2DM)發(fā)病的分子病理學(xué)機(jī)制成為國內(nèi)外研究的難點和熱點。觀察發(fā)現(xiàn)，臨床應(yīng)用放免法測定胰島素，其測定值包括真胰島素、胰島素原(PI)及胰島素中間代謝物。但是T2DM和糖耐量異常(IGT)的患者及動物模型中出現(xiàn)的高胰島素血癥，主要是PI增高引起，真胰島素水平并不增高，掩蓋了機(jī)體真胰島素分泌不足的變化。隨著醫(yī)學(xué)檢驗的發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)能分別測定真胰島素和PI，并推測高PI可能在DM及其并發(fā)癥中有重要作用。此外，高PI水平還與高血壓、冠心病、血脂異常等多種疾病密切相關(guān)，但病因尚不完全清楚，有作者認(rèn)為胰島素降解過快可能是IR的重要原因[1]。本研究采用大鼠肝臟細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察不同濃度PI引起胰島素抵抗的作用，旨在探討PI導(dǎo)致T2DM的分子病理學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器DMEM培養(yǎng)液(Thermo Fisher Scientific,USA)，小牛血清(Gibco，Australia)，PBS(國產(chǎn))，肝細(xì)胞消化液及純化液(Invitrogen，USA)，胰島素原(上海)，人胰島素(Lilly，USA)，青霉素(國產(chǎn))，鏈霉素(國產(chǎn))，Ⅳ型膠原酶(Sigma，USA)，14C-2-脫氧葡萄糖(Sigma，USA)。液體閃爍儀(Beckman LS1801，USA)，Gamma-C12計數(shù)器(DPC，German)，800型離心機(jī)(上海)。

1.2 大鼠原代肝細(xì)胞培養(yǎng)參照文獻(xiàn)方法[2,3]。健康雄性SD大鼠2只，吉林大學(xué)實驗動物中心提供，體重180-200 g，分籠飼養(yǎng)，各12小時的明暗交替照明，標(biāo)準(zhǔn)飲水和飲食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物被處死前禁食水12小時。乙醚吸入麻醉，仰臥位固定，麻醉起效后，無菌條件下打開腹腔，取肝臟組織。本實驗程序遵守動物福利道德原則。用膠原酶法分離純化肝臟細(xì)胞，置于培養(yǎng)瓶中，沖洗，消化，轉(zhuǎn)移到EP管中離心，所獲得的肝細(xì)胞加入DMEM和小牛血清培養(yǎng)液中，青霉素10 U/ug，鏈霉素10 μg/uL，37℃ CO2孵箱孵育3小時。貼壁細(xì)胞用PBS沖洗，倒置顯微鏡下觀察，具有肝細(xì)胞形態(tài)，臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞活性大于85%，用不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將細(xì)胞濃度調(diào)至2×106/ml 。

1.3 分組根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，分離后的肝細(xì)胞接種在2塊24孔培養(yǎng)板，濃度為每孔2×105個細(xì)胞,(1)胰島素組：含有5×107mol/L真胰島素培養(yǎng)液，(2)PI-L組：用含有濃度為1×108mol/L PI的培養(yǎng)液，(3)PI-M組：用含有濃度為3×108mol/L PI的培養(yǎng)液，(4)PI-H組：用含有濃度為7×108mol/L PI的培養(yǎng)液，以上4組細(xì)胞均在37℃，5% CO2孵箱孵育16小時。

1.4 大鼠肝細(xì)胞的胰島素敏感性測定4組肝細(xì)胞孵育后棄去培養(yǎng)液，分別用DMEM洗滌2次，加入含100 ng/mL胰島素的DMEM培養(yǎng)液1 ml，在37℃，5% CO2孵箱孵育30 min，加入14C-2-脫氧葡萄糖，1.51×104Bq，終濃度6 μmol/L，孵育后用液體閃爍儀測定14C-2-脫氧葡萄糖摻入率。

1.5 大鼠肝細(xì)胞的胰島素酶(IDE)活性測定4組細(xì)胞分別用0.05% 的膠原酶PBS緩沖液消化，然后加入10倍體積的低離子強(qiáng)度緩沖液，0℃作用30 min，用吸頭反復(fù)吹打細(xì)胞，使細(xì)胞碎裂，溶解物離心后，取上清，用放射酶分析法測定IDE活性。用Gamma計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)，為消除細(xì)胞數(shù)目不同對測定值的影響，IDE活性用酶比活性表示，即單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的酶活性，即mol/s/mg 蛋白表示。

2 結(jié)果

PI-M組和PI-H組大鼠肝細(xì)胞的14C-2-脫氧葡萄糖摻入率降低，低于胰島素組，P<0.05。見表1 和圖1。 PI-M組和PI-H組大鼠肝細(xì)胞的IDE活性增高，高于胰島素組，P<0.05。見表1 和圖2。

表1 四組大鼠原代肝細(xì)胞體外培養(yǎng)胰島素敏感性及IDE活性比較

*P<0.05，與胰島素組比較

圖1 四組大鼠原代肝細(xì)胞體外培養(yǎng)胰島素敏感性比較

3 討論

本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，分離培養(yǎng)大鼠原代肝細(xì)胞，這樣實驗條件單一而固定，相比在體實驗干擾因素少。該細(xì)胞模型具有較好的穩(wěn)定性，可觀察在單純情況下IR的發(fā)生，是觀察細(xì)胞IR的理想模型。

PI是胰島素的前體物質(zhì)，由胰島β細(xì)胞合成和分泌。生理情況下，只有極少量的PI釋放入血，在正常胰腺β細(xì)胞分泌的總胰島素中，PI所占比例不超過5%，應(yīng)用刺激胰島素分泌的物質(zhì)，這一比例也無明顯增高。因此,外周血中既有胰島素和C肽,又存在PI。而高PI導(dǎo)致胰島素原前體基因幾乎只在胰島β細(xì)胞表達(dá),對維持胰島素的分泌至關(guān)重要，葡萄糖是該基因的主要生理性調(diào)節(jié)劑。慢性高血糖和高血脂可通過抑制PI前體基因表達(dá)[4],胰島β細(xì)胞釋放PI增多，血中PI水平相應(yīng)升高，促進(jìn)T2DM中β細(xì)胞的損傷。在T2DM 和IGT患者以及DM患者一級親屬中，PI明顯增高，可占總胰島素50%。有學(xué)者依據(jù)PI占總胰島素比例來統(tǒng)計IGT人群，發(fā)現(xiàn)該比例越高，2年后轉(zhuǎn)變?yōu)镈M的人數(shù)越多[5]。因此，認(rèn)為PI升高可做為預(yù)測T2DM發(fā)病的指標(biāo)，并認(rèn)為PI可能是部分T2DM病人的遺傳標(biāo)志。但是PI增高的原因尚不清楚，為探討 PI比例增高的直接原因，本研究觀察不同濃度PI引起大鼠肝細(xì)胞模型IR，與胰島素引起的IR做對比研究，探討PI升高在T2DM發(fā)病機(jī)制中的作用及其與濃度的相關(guān)性。

圖2 四組大鼠原代肝細(xì)胞體外培養(yǎng)IDE活性比較

14C-2-脫氧葡萄糖摻入率是反應(yīng)胰島素敏感性的指標(biāo)，反應(yīng)胰島素刺激的葡萄糖攝取能力，本研究結(jié)果顯示，中高劑量PI組14C-2-脫氧葡萄糖摻入率降低，PI可降低體外培養(yǎng)的大鼠原代肝細(xì)胞對胰島素的敏感性，從而引起胰島素抵抗，并且與濃度相關(guān)。

IDE是含巰基的金屬蛋白水解酶，是細(xì)胞內(nèi)催化胰島素降解的最主要的酶，可特異性催化細(xì)胞內(nèi)的胰島素或者胰島素-受體復(fù)合物的降解作用。該酶只特異性的代謝真胰島素，而對胰島素原無代謝作用，故其活性在細(xì)胞水平上影響胰島素降解速度。細(xì)胞水平的胰島素降解過快可能是胰島素抵抗的主要原因，而胰島素抵抗是糖耐量異常和T2DM的重要發(fā)病機(jī)制。還有研究也證實T2DM和非DM一級親屬中IDE活性增高，家系成員的紅細(xì)胞IDE活性增高與代謝相關(guān)，并與胰島素敏感性相關(guān)[6]。本研究觀察到IDE活性增強(qiáng)并引起PI 增高，與胰島素敏感性負(fù)相關(guān)，促進(jìn)細(xì)胞IR。IDE基因表達(dá)增強(qiáng)引起PI升高，促進(jìn)DM的發(fā)生。而IDE活性增高，說明PI促進(jìn)胰島素快速降解，與相關(guān)報道一致[5,6]。