楊肖肖 鄭娜娜 鐘連生 潘志強 郁澤宇

1 徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚性病科 221002；2 徐州醫(yī)科大學麻醉學重點實驗室221002；3徐州醫(yī)科大學形態(tài)學科研實驗中心 221002

神經(jīng)痛是帶狀皰疹最重要且嚴重的癥狀之一，主要與神經(jīng)系統(tǒng)受損有關，其發(fā)生發(fā)展機制尚未完全明確。疼痛相關基因表達變化則是疼痛發(fā)生的根本原因，而表觀遺傳修飾則是調(diào)控基因表達的重要因素[1]。常見的表觀遺傳修飾有DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA 調(diào)控等[2]。DNA 甲基化是在轉錄水平調(diào)控基因表達的表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉移酶（DNA methyl transferases，DNMTs）催化CpG 島的第5 位胞嘧啶（5C）生成5 甲基胞嘧啶（5mC）[3]。DNA 甲基化修飾可調(diào)控疼痛相關基因的表達，與疼痛發(fā)生發(fā)展密切相關[4-5]。GCH1基因是近年來發(fā)現(xiàn)的與神經(jīng)病理性疼痛關系較為密切的基因，參與調(diào)控機體多個系統(tǒng)的生理和病理過程。本研究以帶狀皰疹神經(jīng)痛患者為研究對象，初步探討全基因組以及GCH1 基因甲基化修飾是否與帶狀皰疹神經(jīng)痛發(fā)生相關。

對象與方法

1.病例來源：選擇2017年6-10月在徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚科確診為帶狀皰疹的患者36例，均有明顯神經(jīng)痛癥狀，疼痛程度以影響睡眠為標準。所有患者均給予靜脈滴注阿昔洛韋抗病毒、口服甲鈷胺營養(yǎng)神經(jīng)及外用爐甘石洗劑治療，如有繼發(fā)細菌感染則外用夫西地酸乳膏抗感染，且均未使用加巴噴丁等止痛藥物，治療后疼痛完全緩解者（不影響正常睡眠）方能入組。所有患者均無其他伴有疼痛癥狀的疾病及神經(jīng)系統(tǒng)相關的疾病，如肌張力障礙、阿爾茲海默癥、帕金森病等，無嚴重心、肝、腎等系統(tǒng)性疾病。36 例患者中男21 例，女15例，年齡（65.14±1.57）歲，從發(fā)病到治療前血樣采集時間為（4.61±0.26）d，從發(fā)病到治療后血樣采集時間為（3.03±2.26）d。選擇同期于本院體檢、年齡和性別具有可比性的健康人36例作為對照組，其中男20例，女16例，年齡（63.39± 1.62）歲。抽取患者治療前、經(jīng)治療疼痛完全緩解后及健康體檢者外周血液2 ml 于無核酶的EP 管中，-80 ℃冰箱保存。本實驗獲得徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批文號：XYFY2018-KL031-01），所有受試者均簽署知情同意書，自愿加入本研究。

2.主要試劑及儀器：基因組DNA 提取試劑盒（上海賽百盛基因技術有限公司），甲基化DNA 富集（IP）試劑盒（美國Zymo Research 公司），定量PCR 引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]，SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒（日本Takara 公司），鼠抗5mC 單克隆抗體（美國Active Motif 公司），辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠二抗（上海碧云天生物技術有限公司南通分公司）。非接觸式超聲破碎儀Bioruptor（比利時Diagenode 公司），NanoDrop 2000核酸濃度測定儀（美國Thermo公司）。

3.血液DNA 提?。翰捎蒙虾Ｙ惏偈⒒蚣夹g有限公司樹脂型基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，嚴格按照說明書操作。

4.斑點雜交法（dot-blot）檢測全基因組甲基化水平：采用核酸濃度測定儀分別測出每組DNA 濃度，將每組DNA配制為等濃度；取300 ng DNA加入0.1 mol/L氫氧化鈉3 μl和滅菌水配成14 μl體系混合液；PCR 儀上 99 ℃ 5 min 處理后，冰浴 2 min，加入6.6 mol/L醋酸銨1 μl，配制成15 μl體系；各組取5 μl 在尼龍膜上點樣，紫外交聯(lián)10 min；置入封閉液中封閉4 h；加入鼠抗5mC 一抗（1∶5 000 稀釋）4 ℃孵育過夜；第2天復溫30 min后用1×TBS漂洗3 次，每次5 min；加入辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠二抗（1∶1 000稀釋）37 ℃孵育2 h后漂洗3次，每次5 min；加入電化學發(fā)光（ECL）液，凝膠成像儀曝光。掃描條帶，用ImageJ 分析灰度值用于半定量分析。

5.GCH1基因甲基化水平檢測：

（1）全基因組DNA片段化：使用非接觸式全自動超聲破碎儀Bioruptor破碎基因組DNA，冷卻超聲波水槽；將 100 μl DNA 置于 1.5 ml EP 管；每次 6 個樣本，每個樣本持續(xù)30 min；取2 μl 超聲后的DNA進行電泳檢測，超聲后小于500 bp 片段化DNA 即下游實驗所需。

（2）GCH1 基因甲基化DNA 富集：采用甲基化DNA 富集試劑盒。取160 ng DNA，加入DNA 變性緩沖液配成50 μl 體系，98 ℃，5 min，變性；待變性后的DNA與250 μl MIP緩沖液、15 μl Zymo磁珠蛋白A、1.6 μl鼠抗5mC單克隆抗體混合物混勻，37 ℃孵育1 h；500 μl MIP 緩沖液洗滌磁珠，棄廢液，重復該操作1 次；500 μl DNA 洗脫緩沖液洗滌磁珠，棄廢液；15 μl DNA 洗脫緩沖液重懸磁珠，PCR 儀75 ℃孵育5 min 后，置于磁力架上2 min，收集液體即為DNA，-20 ℃冰箱保存待用。

（3）GCH1 基因甲基化富集定量PCR 擴增：針對GCH1 基因啟動子CpG 含量較高區(qū)域（-490 ～273）設計擴增引物，正向引物：5′-CCAAGAGTCTG AAGTCACATT-3′，反向引物：5′-CAGGAGCTGGGA TCTCAGTG-3′，目標片段大小為217 bp。定量PCR擴增等質(zhì)量 DNA，反應體系 10 μl，包括 SYBR Premix 及GCH1 基因啟動子區(qū)特異擴增引物。反應條件：94 ℃預變性1 min，94 ℃變性15 s，54 ℃退火42 s，72 ℃延伸43 s，45 個循環(huán)。每個樣本重復3 次。相對表達量（RQ）= 2-ΔΔCT，△△Ct=（實驗組output DNA Ct 值 - 實驗組input DNA Ct 值）-（對照組 output DNA Ct 值 - 對照組 input DNA Ct 值），input DNA 為甲基化試劑盒處理前，output DNA 為甲基化試劑盒處理后。

6.統(tǒng)計與分析：采用 GraphPad Prism v7.00 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并生成統(tǒng)計圖表。計量資料均采用±s表示，帶狀皰疹患者治療前后比較采用配對t檢驗，患者組與健康對照組比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

結 果

1.全基因組甲基化水平檢測結果：患者治療前組、治療后組及健康對照組全基因組甲基化相對水平（5mC 灰度值）分別為 135.94 ± 2.52、144.76 ±3.48、146.84±3.39，治療前組顯著低于健康對照組（t= 2.580，P＜ 0.05）和治療后組（配對t= 2.056，P＜0.05），而后兩組相比差異無統(tǒng)計學意義（t=0.429，P＞ 0.05）。見圖1。

2.GCH1基因甲基化定量PCR 結果：熒光定量PCR 擴增曲線顯示，甲基化試劑盒處理前，治療前后及健康對照組PCR 擴增CT 值無顯著差異；甲基化試劑盒處理后，與治療后及健康對照組相比，治療前組擴增CT 值顯著增加。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.6%瓊脂糖凝膠電泳，得到大小217 bp 的目標條帶（圖2）。熒光定量PCR 結果統(tǒng)計分析表明，治療前組、治療后組及健康對照組GCH1 基因甲基化相對水平分別為0.65±0.17、0.89±0.13 和0.97±0.07，治療前組顯著低于健康對照組（t=4.648，P＜ 0.01）和治療后組（配對t=3.977，P＜ 0.05），而后兩組差異無統(tǒng)計學意義（t=0.506，P＞ 0.05）。見圖3。

討 論

圖1 帶狀皰疹神經(jīng)痛患者組治療前后全基因組甲基化相對水平（5mC灰度值） 治療前患者組全基因組甲基化水平低于健康對照組和治療后組。a：P ＜0.05

圖2 帶狀皰疹神經(jīng)痛患者組治療前后GCH1基因啟動子甲基化定量 PCR 產(chǎn)物電泳圖 M 為 DL500 DNA Marker ，1、4 為健康對照組，2、5為治療前組，3、6為治療后組，7為空白對照；1 ～ 3為甲基化試劑盒處理前，4 ～6為甲基化試劑盒處理后

圖3 帶狀皰疹神經(jīng)痛患者組治療前后GCH1基因甲基化相對水平 治療前GCH1 基因甲基化水平顯著低于健康對照組和治療后組。a：P ＜ 0.01，b：P ＜ 0.05

近年來研究表明[6]，疼痛的發(fā)生發(fā)展過程中表觀遺傳學發(fā)揮著重要調(diào)控作用，表觀遺傳是指DNA 序列不發(fā)生變化但基因表達受環(huán)境等因素的影響而發(fā)生可遺傳的改變。神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持與疼痛相關基因的轉錄和表達水平密切相關[7-8]，而DNA 甲基化則是調(diào)控基因轉錄和表達水平的重要表觀遺傳修飾方式之一[3]。DNA 甲基化能通過引起染色質(zhì)結構、DNA構象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變來調(diào)控基因的表達[9]。真核生物較為普遍的DNA 甲基化修飾是DNA胞嘧啶第5位碳原子（5C）的甲基化（5mC），它作為穩(wěn)定的表觀遺傳標記常存在于CpG 或CPHPG（H = A,T,C）二核苷酸對，尤其是CpG 組成的 CpG 島區(qū)域[3]。基因啟動子或增強子 CpG 島甲基化，導致DNA構象發(fā)生變化，影響蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，從而影響基因轉錄水平，并進一步調(diào)控細胞分化、胚胎發(fā)育和疾病的發(fā)生發(fā)展[10]。在糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型[11]中，p2x3r 基因啟動子區(qū)域甲基化水平降低，會導致P2X3R 過表達，從而加重神經(jīng)疼痛癥狀。關于神經(jīng)病理性疼痛發(fā)病機制的研究[12]中，神經(jīng)結扎可誘導脊髓基因表達變化。脊髓神經(jīng)結扎會導致Cxcr3基因甲基化水平降低，脊髓神經(jīng)元中趨化因子受體CXCR3 表達增加，從而促進中樞敏化，促成神經(jīng)性疼痛[13]。在損傷外周神經(jīng)導致疼痛的動物模型中[14]，其脊髓內(nèi)總甲基化水平升高，給予DNA甲基化抑制劑后，脊髓內(nèi)DNA 甲基化水平降低，同時疼痛癥狀也有所緩解。上述研究提示，DNA 甲基化與神經(jīng)病理性疼痛有密切的關系。

帶狀皰疹神經(jīng)痛的發(fā)生與基因表達的變化密切相關，Jean 等[15]研究表明，在帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛小鼠模型中，水痘-帶狀皰疹病毒可誘導小鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)84個基因表達上調(diào)，116個基因表達下調(diào)，從而導致小鼠疼痛行為的發(fā)生。于雪等[16]在帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛與HLA-A等位基因相關性的研究中發(fā)現(xiàn)，HLA-A*2601、HLA-A*3004、HLA-A*3303、HLA-A*0201 與中國北方漢族人群帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛發(fā)病相關，其中HLA-A*2601、HLA-A*3004、HLA-A*3303 為帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛發(fā)病的易感基因，而HLA-A*0201 為保護性基因。此外，有研究表明[8]，COMT、OPRM1、TRPV1、MC1R、GCH1 和CACNA2D3 等均屬疼痛相關基因，其中GCH1 是與神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展較為密切的基因。梁嘯等[17]在大鼠神經(jīng)病理性疼痛動物實驗模型中檢測到大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)GCH1 疼痛相關基因表達產(chǎn)物三磷酸鳥苷環(huán)化水解酶1（GTPCH1）表達增加。構建雙向重組腺相關病毒rAAV-shGCH1 抑制 GCH1 的表達時[18]，小鼠背根神經(jīng)節(jié)處GCH1基因的表達顯著降低，同時神經(jīng)病理性疼痛的癥狀也相應緩解。這些研究結果提示，GCH1基因與神經(jīng)病理性疼痛有密切的關系，但GCH1基因甲基化水平與帶狀皰疹神經(jīng)痛的發(fā)生發(fā)展是否相關，目前國內(nèi)外未見相關報道。

值得注意的是，研究帶狀皰疹神經(jīng)痛的理想標本應該是神經(jīng)組織如腦、脊髓、背根神經(jīng)節(jié)和皮損部位，但這些標本不易獲取。研究表明，在很多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，其血液相關基因可以發(fā)生明顯的甲基化變化，如，外周血特定基因甲基化可作為乳腺癌風險評估中組織樣品的替代標志物[19]；對帕金森病患者血液的53個基因標記的DNA甲基化數(shù)據(jù)整合分析，可鑒定出帕金森病血液潛在的生物標志物[20]。目前，血液Septin9 基因甲基化狀態(tài)作為結直腸癌風險評估指標，已廣泛用于非侵入性結直腸癌患者篩查[21]。

基于上述分析，本研究中，我們檢測了帶狀皰疹神經(jīng)痛患者藥物治療前后及健康體檢者臨床血液樣本全基因組及GCH1基因甲基化，初步探討其與帶狀皰疹神經(jīng)痛的關系。結果顯示，治療前帶狀皰疹神經(jīng)痛患者組全基因組及GCH1 基因甲基化水平顯著低于健康對照組及治療后組，這與以往神經(jīng)病理性疼痛模型[17]中GCH1 基因表達增加的結果相一致。然而，除了本研究中檢測的GCH1基因甲基化外，與該種疼痛癥狀發(fā)生密切相關的其他基因甲基化仍需要深入研究。

DNA 甲基化相對穩(wěn)定，但越來越多的研究顯示，DNA 甲基化作為某些疾病表觀遺傳標志物是動態(tài)變化的，既可以是即時的，也可穩(wěn)定存在并遺傳給后代。如一夜睡眠剝奪可誘導年輕健康男性血清硬脂酰輔酶A去飽和酶的DNA 甲基化和血清活性指數(shù)發(fā)生改變[22]；帕金森病患者血液全基因組部分CPG 位點的甲基化會隨著疾病的發(fā)展而動態(tài)變化[23]。而有些疾病相關基因甲基化的改變則可能需要很長時間，如孕鼠鉻限制膳食可改變成年雄性后代胰島素信號相關肝臟基因的甲基化狀態(tài)[24]；新近研究還發(fā)現(xiàn)[25]，某些特定基因甲基化表達譜還能發(fā)生明顯的隔代遺傳趨勢。本研究結果也顯示，帶狀皰疹神經(jīng)痛患者全基因組及GCH1 基因甲基化水平短時間內(nèi)即可發(fā)生變化。但本研究仍有不足之處，如未檢測疼痛與甲基化水平的關系；分組時未加設帶狀皰疹無神經(jīng)痛組，且目前尚無證據(jù)表明所用治療藥物對甲基化水平有無影響等。

綜上所述，本研究從表觀遺傳的角度切入，初步探討全基因組及GCH1 基因甲基化與帶狀皰疹神經(jīng)痛的相關性，尋求帶狀皰疹神經(jīng)痛發(fā)生發(fā)展可能的新機制。該研究將有助于深入探討表觀遺傳調(diào)控與帶狀皰疹神經(jīng)痛的相互關系，尋找與疼痛發(fā)生發(fā)展及藥物治療效果密切相關的甲基化修飾，從而尋找甲基化調(diào)控相關的特定酶類，并將其作為帶狀皰疹神經(jīng)痛治療藥物研發(fā)的分子靶點，為新型鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突