超高效合相色譜-四極桿飛行時間質譜聯(lián)用技術快速分析廣西莪術化學成分

韋明思 谷筱玉 袁銘 王暉 黃天述 劉佳琪 申玲玲 譚曉杰

摘?要?采用超臨界流體萃取（SFE）技術提取廣西莪術根莖，應用超高效合相色譜-四極桿飛行時間質譜聯(lián)用技術（UPC2-QTOF-MS）分析其提取物，結合UNIFI軟件的內置中藥數據庫和自建的姜黃屬植物化學成分數據庫篩查，快速分離鑒定廣西莪術SFE提取物中的化學成分。本研究初步鑒定出廣西莪術SFE提取物中47種化合物，其中42種是倍半萜類化合物。47種化合物中有8組同分異構體化合物，共37種化合物。UPC2采用Torus Diol 130 色譜柱分離，流動相A為CO2，流動相B為甲醇/異丙醇（3∶1， V/V）+0.1%甲酸，進行梯度洗脫，在7 min內實現(xiàn)了47種化合物的分離。本方法無需復雜的樣品前處理過程，分析速度快、試劑用量少、成本低、環(huán)保，是一種全面高效的分析方法，為中藥的化學成分分析提供了新方法。

關鍵詞?超高效合相色譜-四極桿飛行時間質譜聯(lián)用; 廣西莪術; 同分異構體; 超臨界流體萃取

1?引 言

中藥是發(fā)現(xiàn)新的生物活性物質的重要來源[1]，是典型的復雜物質體系[2]。當前亟需新的分析方法和技術快速鑒定中藥中具有生物活性的化學成分[3～5]。色譜-質譜聯(lián)用技術越來越多地用于中藥成分的研究，如超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯(lián)用技術（UPLC-QTOF-MS），促進了中藥成分的研究[6～10]。

高效分離是準確進行中藥化學成分鑒定的關鍵。以低黏度、高傳質以及溶劑化能力強的超臨界流體為流動相的超臨界流體色譜（Supercritical fluid chromatography， SFC）具有高效分離和分析速度快等特點[11]。因此，SFC可作為氣相色譜（GC）和液相色譜（LC）的互補技術[12]。超高效合相色譜（Ultra-performance convergence chromatography， UPC2）結合了SFC和UPLC及亞2 μm色譜柱技術的優(yōu)點，提高了儀器的分析通量、重現(xiàn)性和精密度[13]。UPC2在復雜樣品的分析中表現(xiàn)出強大的分離能力[14]，已被用于食品、藥品和環(huán)境的分析研究[15～17]。超高效合相色譜-四極桿飛行時間質譜聯(lián)用（UPC2-QTOF-MS）結合了具有強大分離能力的UPC2和能提供高分辨、高靈敏度、精確質量數和豐富結構信息的QTOF-MS，將會在復雜樣品分析中表現(xiàn)出巨大潛力。目前，UPC2-QTOF-MS技術主要應用于食品科學領域的研究[18～20]。

廣西莪術（Curcuma kwangsiensis S. G. Lee & C. F. Liang）的根莖具有行氣破血、消積止痛的功效[21]，主要活性成分是二苯庚烷類化合物和萜類化合物[22～24]。 其中廣西茂術的糖類化合物也有生物活性作用[25，26]。廣西莪術的活性成分表現(xiàn)為抗炎、抗腫瘤、抗增殖和免疫刺激活性[25～29]。

氣相色譜-質譜（GC-MS）是分析廣西莪術揮發(fā)油中化學成分的常用方法[30]。GC-MS適用于分析可氣化且熱穩(wěn)定的化合物，對難氣化或熱不穩(wěn)定的化合物需化學衍生化處理。在分析中藥化學成分時，常會同時分離鑒定多種非目標未知化合物，當其難以氣化或熱不穩(wěn)定時，化學衍生化的前處理結果較差，無法進行GC-MS分析。因此，GC-MS分析中藥的化學成分會受到一定的限制。全二維高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯(lián)用（RPLC×RPLC-Q-TOF-MS）分析廣西莪術根莖時共分離鑒定出105種化合物[31]。雖然RPLC×RPLC具有超強的分離能力，但僅1D LC的運行時間為120 min，分析時間長，不適于中藥的質量控制和日常分析。因此，需要建立一種快速、靈敏、高效和全面的分離鑒定中藥化學成分的新方法。

本研究應用超臨界CO2萃?。⊿FE）廣西莪術根莖，UPC2-QTOF-MS分析其提取物，建立了一種快速、高效分離鑒定中藥化學成分的新方法。本方法無需復雜的樣品前處理過程，分析速度快、全面、高效且環(huán)保。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

ACQUITY UPC2超高效合相色譜-Xevo G2-XS Q-TOF四極桿飛行時間質譜聯(lián)用儀（美國Waters公司），配有電噴霧離子源（ESI），ISM補償泵; 色譜柱：Torus DEA （100 mm×3 mm， 1.7 μm）、 Torus 1-AA （150 mm×3 mm， 1.7 μm）、Torus 2-PIC （100 mm×3 mm， 1.7 μm）、Viridis BEH （100 mm ×3 mm， 1.7 μm）、Torus Diol 130（100 mm ×3 mm， 1.7 μm）（美國Waters公司）; UNIFI 1.8.2軟件，內置中藥數據庫（美國Waters公司）; SFE-30A超臨界流體萃取儀（日本島津公司）; GRX6電熱恒溫鼓風干燥箱（上海天恒醫(yī)療器械有限公司）; FW135中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）; Milii-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

甲醇、異丙醇、甲酸（色譜純，美國Fisher公司）; 乙醇（色譜純，德國Merck公司）; ?CO2（99.999%，上海振信氣體有限公司）; 實驗用水為超純水。

2.2?實驗方法

2.2.1?樣品處理?廣西莪術根莖樣品采集自廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，經廣西壯族自治區(qū)藥用植物園蘇燕秋研究員鑒定為廣西莪術根莖。將其切成片，用電熱恒溫鼓風干燥箱（40℃）烘干，然后用中草藥粉碎機粉碎（24目）。取2.0 g干燥粉末于5 mL 萃取罐中，在超臨界流體萃取儀中進行萃取。萃取條件：萃取背壓15 MPa，萃取壓力20 MPa，改進劑為乙醇，其比例為15%，萃取溫度50℃，靜態(tài)萃取時間10 min，動態(tài)萃取時間10 min，萃取次數（靜態(tài)萃取+動態(tài)萃?。?次。獲得的提取液經0.22 μm濾膜過濾后， 待測。

2.2.2?超高效合相色譜條件?色譜柱為Torus Diol 130 （100 mm×3 mm，1.7 μm）; 流動相A為CO2，流動相B為甲醇/異丙醇（3∶1， V/V）+ 0.1%甲酸; 梯度洗脫：0～2 min，98% A; 2～4 min，98%～92% A; 4～9 min，92%～60% A; 9～9.5 min，60%～98% A; 9.5～11 min，98% A; 流速0.4 mL/min; 補償溶劑為甲醇，流速0.2 mL/min; 進樣體積為1 μL; 柱溫： 45℃; 背壓：12.41 MPa。

2.2.3?質譜條件?比較正負離子兩種掃描模式，結果正離子模式下質譜響應更強，在高能量通道下碎片信息更豐富。因此，最終選擇在正離子模式下進行實驗。離子化模式：ESI+; 毛細管電壓：2.5 kV; 錐孔電壓：40 V; 離子源溫度：120℃; 霧化氣溫度：500℃; 霧化氣流速：800 L/h; 錐孔氣流速：50 L/h。掃描模式：Full Scan/MSE; MS1和MS2掃描范圍：m/z 50～1200。

2.2.4?姜黃屬植物化學成分數據庫的建立?根據文獻[32]報道的姜黃屬植物的化學成分，建立姜黃屬植物化學成分數據庫。每種化合物條目包括化合物的名稱、化學結構、分子式、精確分子量、植物來源及其拉丁名。姜黃屬植物化學成分數據庫共收錄了211種化合物。

2.2.5?數據處理和化合物鑒定

把自建姜黃屬植物化學成分數據庫導入UNIFI軟件后，設置UNIFI數據處理的參數：保留時間范圍0～7.0 min; 在3D峰檢測中高能量的峰強度閥值設為20 counts， 低能量的峰強度閥值設為160 counts; 分子質量偏差和碎片質量偏差分別設為5.0和10.0 mDa; 質量范圍：50～1200 Da; 加合離子包括+H， +Na， +K和+NH4。亮氨酸腦啡肽[M+H]+=556.2766作為LockSpray校正標準液。UNIFI軟件可自動完成以下數據處理，包括色譜峰的提取、分子式的確定、在內置的中藥數據庫和自建姜黃屬植物化學成分數據庫內篩查、離子碎片的匹配到化學成分的初步鑒定。對未與內置的中藥數據庫和自建姜黃屬植物化學成分數據庫匹配的化學成分，可通過UNIFI軟件中的“說明”工具實現(xiàn)未知組分的鑒定，包括未知組分的分子式確定，在PubChem、ChemSpider等數據庫進行在線數據庫搜索，然后通過離子碎片匹配來確認化合物結構。

3?結果與討論

3.1?色譜條件的優(yōu)化

考察了Waters Acquity UPC2 Torus DEA （100 mm×3 mm， 1.7 μm）、Torus 1-AA （150 mm×3 mm， 1.7 μm）、Torus 2-PIC （100 mm×3 mm， 1.7 μm）、Viridis BEH （100 mm×3 mm， 1.7 μm） 和 Torus Diol 130（100 mm×3 mm， 1.7 μm） 5種色譜柱的分離效果，結果表明，Torus Diol 130 色譜柱的分離效果最好。因此，選用Torus Diol 130 色譜柱進行后續(xù)實驗。采用梯度洗脫，調節(jié)流動相的比例，確定的最佳梯度洗脫條件如2.2.2節(jié)所述。應用Waters ISM補償泵補充溶劑，增強化合物的離子化，補償溶劑為甲醇，流速為0.2 mL/min。UPC2的背壓為12.41 MPa。由色譜圖（圖1）可知，UPC2分離廣西莪術化學成分的時間為7 min，運行時間短，體現(xiàn)了UPC2快速分離復雜中藥化學成分的能力。

3.2?應用UNIFI軟件鑒定廣西莪術化學成分的方法

LC-MS聯(lián)用鑒定中藥化學成分的傳統(tǒng)方法是通過手動提取每個色譜峰，然后由精確分子量推測出可能的分子式，檢索在線數據庫，最后由二級碎片離子推出可能的裂解途徑，進而確定化學結構，這種方法費時、低效[33]。本研究應用UNIFI軟件完成姜黃屬植物化學成分數據庫的建立和導入，自動進行分子式的確定、峰的提取、數據庫篩查、數據處理以及化合物鑒定，進行中藥的化學成分鑒定，快速、簡單、高效。

3.2.1?建立姜黃屬植物化學成分數據庫?姜黃屬植物包括廣西莪術、蓬莪術（Curcuma phaeocaulis Valeton）、溫郁金（Curcuma wenyujin）、姜黃（Curcuma longa L.）和郁金（Curcuma aromatica Salisb.）等植物。通過檢索PubChem、ChemSpider等數據庫并結合文獻收錄的姜黃屬植物的化學成分[32]，建立姜黃屬植物化學成分數據庫，該數據庫共收錄了211種化合物，包括二苯庚烷類、單萜、倍半萜、二萜、多糖和酚酸類等化合物。姜黃屬植物化學成分數據庫的基本結構及其包含的信息包括化合物的名稱、化學結構、分子式、精確分子量、植物來源及其拉丁名。

藥用植物親緣學理論認為，親緣相近的藥用植物所含的化學成分通常也相似，同一屬的藥用植物含有許多相同化學成分[34]。據此， 廣西莪術的化學成分與姜黃屬中其它藥用植物會有許多相同的化學成分。有的化學成分實際上存在于廣西莪術中，不過尚未有文獻報道其在廣西莪術中有分布，但已有文獻報道其在姜黃屬其它植物中有分布[33]。因此，建立姜黃屬植物化學成分數據庫作為篩查數據庫，擴大了化合物的篩查范圍，但篩查范圍又比在線數據庫小很多，這樣有助于快速全面鑒定廣西莪術中的化學成分。

3.2.2?UNIFI軟件自動進行數據處理和化學成分鑒定?使用UNIFI軟件的內置中藥數據庫（1.8.2版）和自建的姜黃屬植物化學成分數據庫共同作為篩選數據庫。UNIFI數據處理的參數如2.2.5節(jié)所述。通過UNIFI軟件的工作流程快速篩選出目標組分。UNIFI軟件自動完成色譜峰的提取識別、分子式的確定、對中藥數據庫和姜黃屬植物化學成分數據庫的篩查以及將軟件計算的理論碎片和儀器采集的碎片離子進行匹配，給出碎片離子的可能化學結構。對與中藥數據庫和姜黃屬植物化學成分數據庫中化合物結構匹配的組分，僅需要判斷Mass Fragment自動給出碎片的合理性，便可初步鑒定目標組分。

3.2.3?鑒定未與篩選數據庫匹配的未知化合物?對未與內置中藥數據庫和姜黃屬植物化學成分數據庫匹配的組分，可通過精確質量數和元素組成分析，推測可能的分子式，再以分子式在PubChem、ChemSpider等數據庫進行在線搜索，得到可能的化學成分，并進行質譜碎片自動匹配，從而實現(xiàn)未知組分的鑒定。對未與篩選數據庫匹配且并未在在線數據庫檢索到的化學成分，需根據其精確分子質量、質譜碎片以及同類化合物的特征碎片推斷其結構。

3.3?廣西莪術的化學成分鑒定

應用UNIFI軟件鑒定廣西莪術化學成分的方法，得到其化學組分，并通過與文獻報道的化學成分的分子式、化學結構和質譜數據相比較，對一些化合物進行了進一步驗證。本實驗初步鑒定廣西莪術干燥根莖的SFE提取物中共47種化學成分，其中42種是倍半萜類化合物， 有8組同分異構體共37種化合物，結果見表1。

應用GC-MS方法分析6個不同產地廣西莪術的揮發(fā)油，GC運行時間約50 min，各產地廣西莪術的化學成分種類和含量都有非常大的差別，所含的化學成分都是單萜和倍半萜類化合物，其中廣西玉林福棉區(qū)的樣品測出的化合物種類最多，為40種[35]。應用RPLC×RPLC-Q-TOF-MS分析廣西莪術根莖的超聲提取物，初步鑒定出105種化學成分，但分離時間太長，僅1D LC的運行時間就達到120 min[31]。以上兩種方法與本方法分離鑒定廣西莪術的化學成分的種類有區(qū)別。一種原因是不同地區(qū)不同時間采集的廣西莪術樣品所含的化學成分有不同。正如Zhang等[35]用同樣的樣品制備和分析方法分析不同產地的廣西莪術，發(fā)現(xiàn)無論是它們的化學成分，還是化學成分含量都有明顯的區(qū)別。另一種原因是樣品提取的方法不一樣，導致提取物中的化學成分不完全相同。還有一種原因是分析方法不同，可能也會導致分離鑒定的化學成分不一樣。GC-MS無法分離鑒定高沸點、難氣化或熱不穩(wěn)定的化合物。二維色譜比一維色譜具有更強的分離能力，可分離出比一維色譜更多的化合物。

對復雜中藥中化學成分的分析，RPLC×RPLC-Q-TOF-MS比UPC2-QTOF-MS具有更高的峰容量，但UPC2-QTOF-MS比RPLC×RPLC-Q-TOF-MS的分析速度快，更適合中藥的質量控制和日常分析。應用GC-MS分析中藥中化學成分時，為了將化合物更好地分離，并得到較好的峰形，常采用程序升溫方法，但會導致分析時間較長。如應用GC-MS分析廣西莪術時，采用程序升溫方法，升溫速度為5℃/min， 柱溫從40℃升溫到280℃需要48 min[35]。本方法僅需7 min即可分離廣西莪術中的47種化合物。由此可見，UPC2-QTOF-MS方法分析復雜中藥中化學成分具有比GC-MS方法更快的速度，并且無需衍生化處理也能分析難氣化或熱不穩(wěn)定的化合物。因此，UPC2-QTOF-MS是一種快速分離鑒定中藥中化學成分的方法。

由于化學成分復雜，天然產物的分離是一個很大的挑戰(zhàn)，尤其是當同分異構體是結構類似物和立體異構體時，分離和純化難度更大[36]。大量的同分異構體分析物對色譜分離是一個巨大的挑戰(zhàn)[37]。本研究共分離鑒定出47種化學成分，其中有8組同分異構體共37種化合物，說明UPC2-QTOF-MS具有卓越的分離鑒定同分異構體的能力。

4?結 論

建立了一種應用SFE萃取廣西莪術、UPC2-QTOF-MS分析其提取物，結合UNIFI軟件的中藥數據庫和自建的姜黃屬植物化學成分數據庫篩查，快速分離鑒定廣西莪術中的化學成分的方法。本方法具有前處理簡單、分析速度快、高效全面以及綠色環(huán)保等特點，為廣西莪術中藥材及其產品的質量控制和藥效物質基礎研究提供了一種新的分離鑒定方法。UPC2-QTOF-MS也可用于其它中藥化學成分的分析。

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