長期砷暴露的大鼠尿液代謝組學(xué)研究

王曉飛 沈運(yùn)旺 朱玨 張博

摘?要?慢性無機(jī)砷暴露可引發(fā)多種疾病和損害， 但其所涉及的生物學(xué)過程尚未完全闡明。全球約有超過2億人面臨飲用水砷污染的威脅。本研究以自由飲水的方式對健康大鼠進(jìn)行無機(jī)砷的長期暴露， 并對大鼠尿液的代謝組變化進(jìn)行系統(tǒng)分析。結(jié)果表明， 長期砷暴露大鼠的尿液代謝組與對照組具有顯著區(qū)別， 且高劑量砷暴露對大鼠尿液代謝組產(chǎn)生的影響更顯著。本研究共鑒定出36種差異代謝物， 其中14種與氨基酸代謝相關(guān)的代謝物發(fā)生了顯著變化， 涉及到色氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、賴氨酸降解、β-丙氨酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝; 11種與脂類代謝相關(guān)的代謝物， 涉及到的代謝通路有鞘脂代謝、脂肪酸代謝; 同時發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的表達(dá)與翻譯后修飾也受到干擾。這些生物學(xué)過程的改變均可作為砷毒性機(jī)理的關(guān)鍵分子事件。

關(guān)鍵詞?砷暴露; 代謝組學(xué); 尿液; 長期暴露; 液相色譜-質(zhì)譜

1?引 言

砷廣泛存在于環(huán)境中， 無機(jī)砷具有極大毒性， 已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為I類致癌物。飲用水砷污染是人類暴露于砷的主要途徑[1，2]， 在全球范圍內(nèi)有超過2億人的飲用水中含有較高濃度的砷。高砷地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查表明， 慢性無機(jī)砷暴露與多種疾病風(fēng)險的增高具有相關(guān)性[3～5]， 近期的研究發(fā)現(xiàn)， 即使普通環(huán)境劑量的飲水砷暴露也存在一定的健康風(fēng)險[6，7]。近年來快速展的組學(xué)技術(shù)已被應(yīng)用于砷毒性的研究中， 基于動物模型的蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)， 砷暴露能夠損害心血管系統(tǒng)的發(fā)育和正常功能[8]。在低劑量砷暴露人群的尿液代謝組學(xué)研究中， 發(fā)現(xiàn)五價無機(jī)砷暴露量的升高與男性不育呈現(xiàn)相關(guān)性， 并且砷可能引發(fā)氧化應(yīng)激增強(qiáng)和擾亂性激素代謝過程[7]。

代謝組學(xué)技術(shù)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分， 基于現(xiàn)代色譜-質(zhì)譜聯(lián)用平臺對代謝物進(jìn)行研究， 通過分析生物體中代謝物的變化， 揭示生命活動規(guī)律[9，10]。代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于污染物毒性研究， 可以直接觀察到與污染物相關(guān)的代謝物變化， 進(jìn)而在小分子層面揭示污染物的毒性機(jī)理[11～13]。代謝組學(xué)技術(shù)在毒性機(jī)理研究中仍存在許多挑戰(zhàn)， 如代謝組學(xué)技術(shù)研究方法的多樣性[14]、追蹤代謝物變化所影響的特定代謝途徑和毒性效應(yīng)仍具有挑戰(zhàn)性[15，16]、代謝物濃度的巨大差異帶來的檢測困難， 以及由于鑒定能力和數(shù)據(jù)庫不完善帶來的大量代謝物質(zhì)譜信息數(shù)據(jù)浪費(fèi)[17]。

代謝物是連接環(huán)境風(fēng)險因素與生物體健康的橋梁。如血液和尿液中的代謝物變化可以反映個體在分子層面對環(huán)境脅迫的響應(yīng)， 高通量代謝組學(xué)能夠篩選代謝物的變化[6，7，18，19]， ?進(jìn)而全面了解環(huán)境脅迫對生物體代謝通路的影響。該策略已應(yīng)用于小鼠、蛤和跳蚤的砷暴露代謝干擾效應(yīng)研究[20～23]。 在現(xiàn)有的砷毒性研究中， 多采用急性和高劑量的砷暴露模式， 尚不能真實(shí)反映出人飲水型長期砷暴露的實(shí)際情況。本研究對大鼠進(jìn)行長期的無機(jī)砷飲水暴露， 覆蓋了大鼠幼年至成年期， 分析了尿液代謝組， 基于代謝組學(xué)的高分析通量和差異代謝物的篩選功能， 將砷暴露與尿液代謝物的相應(yīng)變化關(guān)聯(lián)， 結(jié)合相關(guān)代謝通路分析探究了長期無機(jī)砷暴露的毒性機(jī)理， 以期對長期砷暴露的健康風(fēng)險評估提供參考。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司）-Q Exactive質(zhì)譜儀（美國Thermo公司）聯(lián)用代謝組學(xué)檢測平臺。 甲醇（色譜純， 德國Merck公司）; 甲酸（質(zhì)譜純， 百靈威J&K公司）; NaAsO2（純度>98.5%， 比利時Acros公司）; 去離子水由Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?動物實(shí)驗(yàn)分組與染毒方法?SD（Sprague-Dawley）雄性大鼠（4周齡， 體重80 g）購自上海SLAC動物實(shí)驗(yàn)中心。大鼠飼養(yǎng)于溫度為（26 ± 2）℃、相對濕度為50%±5%、12/12 h晝夜循環(huán)的動物房內(nèi)， 所有大鼠自由攝取食物和飲用水。經(jīng)過一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)和檢疫后， 大鼠隨機(jī)分成3組， 每組10只。暴露組大鼠分別飲用濃度為1.0和25.0 mg/L的NaAsO2溶液， 對照組大鼠飲用去離子水。

經(jīng)過150天暴露后， 利用代謝籠收集大鼠尿液， 在4℃以12000 g離心10 min， 于80℃儲存， 待分析。

2.2.2?尿液檢測?（1）樣品制備?從80℃取出尿液， 依次在20℃和4℃下逐步解凍。每種樣品中取出500 μL尿液， 加入等體積的去離子水， 在4℃以12000 g離心10 min， 取上清液， 待測。同時， 從每種樣品中取出20 μL混勻， 作為質(zhì)量控制（QC）樣品。（2）液相色譜分離條件?利用UPLC/Q Exactive-MS聯(lián)用平臺采集尿液代謝指紋圖譜， 使用Waters公司的ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm × 2.1 mm × 1.8 μm）; 流動相A為含有0.1%甲酸的水溶液， 流動相B為含有0.1%甲酸的甲醇溶液， 梯度洗脫條件：初始流動相為0.1% B， 維持1 min， 4 min時升至6.0% B， 15 min時升至50% B， 21 min時升至99.9% B并維持2.5 min， 隨后快速恢復(fù)初始0.1% B， 并保持1.5 min; 進(jìn)樣體積為10 μL; 流速為400 μL/min; 柱溫為40℃。（3）質(zhì)譜條件?采用電噴霧離子源（ESI）， 同時在正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)， Full MS分辨率為17500， 掃描范圍為m/z 100～1000。載氣為氮?dú)猓?正、負(fù)模式下噴針電壓均為3500 V， 離子傳輸毛細(xì)管溫度為320℃; 鞘氣和輔助氣流量分別為50和12.5 L/min。隨機(jī)進(jìn)樣， 每種樣品檢測2次， 以消除人為或儀器造成的系統(tǒng)誤差， QC樣品每隔10種樣品檢測1次。Full MS/dd-MS2模式用于獲得標(biāo)志物的二級質(zhì)譜結(jié)構(gòu)信息， NCE設(shè)置為30%。

2.2.3?尿液代謝組檢測數(shù)據(jù)分析?將UPLC/Q Exactive-MS聯(lián)用平臺采集到的代謝物指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compound Discoverer 2.1軟件進(jìn)行峰對齊、代謝物離子信息提取與鑒定， 得到包含代謝物分子量、分子式、離子峰面積的信息表。數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化后導(dǎo)入SIMCA-P（Version 14.1 MKS Umetrics）， 首先進(jìn)行主成分分析（PCA）， 基于QC樣品聚合情況考察儀器方法的穩(wěn)定性， 隨后進(jìn)行正交-偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）， 并通過SPSS（Version 24， IBM）和MetaboAnalyst 4.0（https：//www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。差異代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：VIP值（Variable Importance in the Projection）≥1.5， 兩組間變化倍數(shù)≥2（暴露組vs對照組）， p<0.05（暴露組vs對照組）。將滿足上述條件的代謝物導(dǎo)入HMDB（http：//www.hmdb.ca/）進(jìn)行檢索， 排除非內(nèi)源性物質(zhì)和非大鼠物種來源物質(zhì)， 并對其生物學(xué)意義進(jìn)行分析。

3?結(jié)果與討論

3.1?砷暴露劑量的選擇

全球天然水體中砷濃度范圍為0.0005～5.0 mg/L， 如印度西孟加拉邦地區(qū)的地下飲用水中砷濃度達(dá)到了3.7 mg/L[24，25]。飲用水中砷的主要存在狀態(tài)有As和As [26]， 且As的毒性遠(yuǎn)大于As[27]， 為了更真實(shí)地反映飲水砷暴露的健康影響， 選擇NaAsO2溶液作為砷暴露源。在本研究中選用25.0 mg/L NaAsO2作為最高暴露劑量， 相當(dāng)于14.4 mg/L的砷暴露量， 依據(jù)動物與人類間劑量轉(zhuǎn)換算法[28]， 這相當(dāng)于人類暴露于2.3 mg/L的砷; 為了反映人類常規(guī)飲水砷暴露狀態(tài)， 選用1.0 mg/L NaAsO2作為低暴露劑量組。同樣， 25.0 mg/L NaAsO2暴露量（相當(dāng)于4.0 mg/kg bw）約為大鼠口服半致死量（41.0 mg/kg bw）的1/10[29]。因此， 本研究中使用的暴露劑量涵蓋了環(huán)境砷暴露最高水平、常規(guī)飲水砷暴露水平和大鼠NaAsO2的半致死量， 與環(huán)境相關(guān)并具有毒理學(xué)意義。

3.2?代謝組學(xué)分析

在正、負(fù)離子2種掃描模式下同時對樣品中的代謝物進(jìn)行檢測， 盡可能獲得所有代謝物的信息。圖1為大鼠尿液代謝組輪廓的代表性指紋圖譜， 可以看出譜圖中含有豐富的代謝物信息。

在代謝組學(xué)分析過程中， 通常伴隨著顯著的質(zhì)譜信號漂移， 為了消除這種變化， 常添加一種或多種內(nèi)標(biāo)校正信號[30]， 或采用QC樣品評估信號漂移狀態(tài)并進(jìn)行信號校正[31，32]。本研究采用statTarget工具對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行校正（QC-RFSC）[32]。QC樣品（n=9）檢測均勻覆蓋全部樣品分析序列， 通過對所有QC樣品數(shù)據(jù)中代謝物離子的保留時間和信號強(qiáng)度進(jìn)行分析， 可以檢驗(yàn)方法的可靠性及LC-MS平臺的穩(wěn)定性。采用PCA方法對所有樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識別， 結(jié)果如圖2所示， QC樣品聚合良好， 表明本研究中代謝組學(xué)分析方法穩(wěn)定可靠， 數(shù)據(jù)質(zhì)量滿足進(jìn)一步多變量組學(xué)分析的要求。

在代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析中， 正交-偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）作為偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）的改進(jìn)方法， 常被用于區(qū)分兩組或多組數(shù)據(jù)， 與PLS-DA相比， OPLS-DA模型的假陽性率更低， 結(jié)果更準(zhǔn)確[33]。分別對暴露組與對照組進(jìn)行OPLS-DA分析和置換檢驗(yàn)。如圖3所示， OPLS-DA分析表明， 2種劑量組與對照組均能夠?qū)崿F(xiàn)良好的聚類區(qū)分， 模型經(jīng)過驗(yàn)證可靠， 表明長期飲水砷暴露對大鼠的尿液代謝組產(chǎn)生了顯著影響。

將提取的代謝物離子信息表導(dǎo)入MetaboAnalyst 4.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 對暴露組和對照組中代謝物離子強(qiáng)度變化倍數(shù)（FC）及t檢驗(yàn)的p值進(jìn)行比較（圖4）， 結(jié)果表明， 暴露組與對照組的大鼠尿液中存在大量的差異代謝物（圖4中紅色圓點(diǎn)， FC>2且p<0.05）， 且高劑量比低劑量暴露組中存在更多的差異性代謝物離子。依據(jù)變量在OPLS-DA區(qū)分投影中的重要性（VIP）、兩組間變化倍數(shù)及差異顯著性， 最終篩選出36種差異代謝物（表1， 低劑量組14種， 高劑量組32種， 2種劑量組中同時鑒定到10種）。差異代謝物在暴露組與對照組尿液中的變化熱圖（圖6）顯示， 13種差異代謝物在砷暴露組大鼠尿液中的含量顯著上調(diào)， 23種代謝物含量顯著下調(diào)。將差異代謝物導(dǎo)入MetaboAnalyst 4.0， 經(jīng)Pathway Analysis和Statistical Analysis分析， 表明差異代謝物涉及氨基酸代謝、谷胱甘肽代謝、嘌呤代謝、鞘脂代謝和氨?；?tRNA生物合成等通路（圖5）。

3.3?基于代謝組學(xué)分析的砷暴露毒性效應(yīng)

3.3.1??長期砷暴露引起生物體整體代謝異常?砷暴露會擾亂機(jī)體內(nèi)氧化/抗氧化平衡， 造成機(jī)體氧

化損傷[34，35]， 影響細(xì)胞生長[36]、DNA修復(fù)[37]和表達(dá)調(diào)節(jié)[38～41]。流行病學(xué)研究表明， 砷暴露是糖尿病[42～44]和心血管疾病[45～47]等代謝類疾病的危險因素。尿液中包含了大量代謝物信息， 尿液代謝組學(xué)研究已被廣泛應(yīng)用于污染物毒理研究中[18，48，49]， 對大鼠尿液進(jìn)行代謝組分析， 能夠準(zhǔn)確地反映出生物體整體代謝輪廓的變化。本研究發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)過長期的砷暴露， 大鼠尿液中有14種與氨基酸代謝相關(guān)的代謝物發(fā)生了顯著變化（4種含量上升、10種含量下降）， 在25.0 mg/L暴露組鑒定出12種， 1.0 mg/L暴露組鑒定出8種， 涉及到的氨基酸通路有色氨酸代謝（Tryptophan metabolism）、精氨酸和脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism）、賴氨酸降解（Lysine degradation）、β-丙氨酸代謝（β-Alanine metabolism）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（Cysteine and methionine metabolism）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（Glycine， serine and threonine metabolism）（圖5）; 同時， 也鑒定出11種與脂類代謝相關(guān)的代謝物（6種含量上升、5種含量下降）， 其中在25.0 mg/L暴露組鑒定出10種， 1.0 mg/L暴露組鑒定出2種， 涉及到的代謝通路有鞘脂代謝（Sphingolipid metabolism）、脂肪酸代謝。慢性砷暴露已被證明與糖尿病和心血管疾病密切相關(guān)， 這些疾病的典型特征是生物體內(nèi)糖類、脂類和氨基酸的代謝紊亂[50，51]。以上結(jié)果表明， 長期砷暴露能夠引起生物體整體代謝異常， 并且高劑量（25.0 mg/L）暴露比低劑量（1.0 mg/L）暴露產(chǎn)生的代謝影響更顯著。

3.3.2?長期砷暴露擾亂氧化/抗氧化平衡， 引起核苷酸代謝紊亂?砷暴露能夠引起生物體產(chǎn)生多種損傷， 其毒性機(jī)理在分子層面還未完全明確， 氧化/抗氧化失衡導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是被廣泛接受和深入研究的方向之一[52]; 長期砷暴露引起的氧化/抗氧化失衡是眾多砷毒害的誘因， 進(jìn)而造成致癌、遺傳毒性、生殖毒性、皮膚損傷、代謝系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)病變等[34]。在砷暴露大鼠尿液中鑒定出涉及谷胱甘肽代謝通路的代謝物有精胺（Spermine）、亞精胺（Spermidine）和焦谷氨酸（Pyroglutamic acid）， 且含量均下降。這表明砷暴露可能破壞了大鼠體內(nèi)的谷胱甘肽代謝循環(huán)（機(jī)體內(nèi)維持氧化/抗氧化平衡的重要生物學(xué)過程）[53，54]， 進(jìn)而對大鼠機(jī)體產(chǎn)生氧化損傷。另外， 暴露組中5種與核苷酸代謝相關(guān)的代謝物產(chǎn)生了顯著變化（2種含量上升， 3種含量下降）， 其中， 次黃嘌呤（Hypoxanthine， 下降）和黃嘌呤（Xanthine， 上升）是尿酸（Uric acid， 上升）合成的前體， 尿酸是嘌呤氧化的最終產(chǎn)物， 這表明長期砷暴露可能通過擾亂機(jī)體內(nèi)氧化/抗氧化平衡， 干擾核苷酸代謝， 并影響機(jī)體內(nèi)正常的生物學(xué)過程。

3.3.3?長期砷暴露干擾蛋白質(zhì)表達(dá)與翻譯后修飾?氨基酸的tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)及蛋白質(zhì)翻譯后修飾對于蛋白質(zhì)的合成和功能化具有重要意義。與對照組相比， 砷暴露組中蛋氨酸（Methionine）和N-乙?；?賴氨酸（N6-acetyllysine）的含量分別顯著上升和下降。蛋氨酸與氨酰-tRNA的生物合成過程相關(guān)， N-乙?；?賴氨酸是一種乙?；被?， 賴氨酸乙?；且环N重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾， 這說明長期砷暴露擾亂了大鼠體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)和翻譯后修飾過程。

4?結(jié) 論

利用代謝組學(xué)技術(shù)對不同劑量長期飲水砷暴露大鼠尿液的代謝組進(jìn)行了對比分析， 發(fā)現(xiàn)長期砷暴露對大鼠體內(nèi)整體代謝產(chǎn)生了顯著影響， 在低劑量和高劑量暴露組中分別鑒定出14種和32種差異代謝物， 其中10種差異代謝物在2種劑量組中均被鑒定出， 這表明長期高劑量砷暴露對機(jī)體代謝產(chǎn)生的干擾更顯著。對差異代謝物涉及的代謝通路進(jìn)行分析， 結(jié)果表明， 長期砷暴露會導(dǎo)致氨基酸和脂類代謝異常及核苷酸代謝紊亂， 并干擾蛋白質(zhì)的表達(dá)與翻譯后修飾。以上通路的改變均可作為砷毒性機(jī)理的關(guān)鍵分子事件， 以此為靶點(diǎn)， 結(jié)合常規(guī)毒理學(xué)研究方法和多組學(xué)聯(lián)用技術(shù)， 對這些生物學(xué)過程中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行深度研究， 有助于對砷毒性分子機(jī)制的深度解析。

References

1?Rodríguez-Lado L， Sun G， Berg M， Zhang Q， Xue H， Zheng Q， Johnson C A. Science， 2013， 341（6148）： 866-868

2?Karn S K. Environ. Pollut.， 2015， ?207： 434-435

3?Pham L H， Nguyen H T， Tran C V， Nguyen H M， Nguyen T H， Tu M B. Environ. Geochem. Hlth.， 2017， 39（3）： 517-529

4?Naujokas M F， Anderson B， Ahsan H， Aposhian H V， Graziano J H， Thompson C， Suk W A. Environ. Health Perspect.， 2013， 121（3）： 295-302

5?Jomova K， Jenisova Z， Feszterova M， Baros S， Liska J， Hudecova D， Rhodes C J， Valko M. J. App. Toxicol.， 2011， 31（2）： 95-107

6?Shen H， Xu W， Zhang J， Chen M， Martin F L， Xia Y， Liu L， Dong S， Zhu Y G. Environ. Sci. Technol.， 2013， 47（15）： 8843-8851

7?Xu W， Bao H， Liu F， Liu L， Zhu Y G， She J， Dong S， Cai M， Li L， Li C， Shen H. Environ. Health， 2012， 11（1）： 46

8?Huang Q， Xi G， Alamdar A， Zhang J， Shen H. Environ. Pollut.， 2017， 229： 210-218

9?Weng R， Shen S， Tian Y， Burton C， Xu X， Liu Y， Chang C， Bai Y， Liu H. Sci. Rep.， 2015， 5： 11864

10??YANG Xiu-Juan， YANG Zhi-Jun， LI Shuo， DENG Yi， YANG Yan-Ze， MAN Qiong， LI Peng-Jie. Chinese Journal of Chromatography， 2019， 37（1）： 71-79

楊秀娟， 楊志軍， 李 碩， 鄧 毅， 楊延澤， 曼 瓊， 李鵬杰. 色譜， 2019， 37（1）： 71-79

11?Vlaanderen J J， Janssen N A， HoeK， G， Keski-Rahkonen P， Barupal D K， Cassee F R， Gosens I， Strak M， Steenhof M， Lan Q， Brunekreef B， Scalbert A， Vermeulen R C H. Environ. Res.， 2017， 156： 341-348

12?Wang Z， Xu X， He B， Guo J， Zhao B， Zhang Y， Zhou Z， Zhou X， Zhang R， Abliz Z. Ecotoxicol. Environ. Safe.， 2019， 169： 232-239

13?Chen C H S， Yuan T H， Shie R H， Wu K Y， Chan C C. Environ. Inter.， 2017， 102： 87-96

14?Karu N， Deng L， Slae M， Guo A C， Sajed T， Huynh H， Win E， Wishart D S. Anal. Chim. Acta， 2018， 1030： 1-24

15?Wishart D S， Mandal R， Stanislaus A， Ramirez-Gaona M. Metabolites， 2016， 6（1）： 10-26

16?Aretz I， Meierhofer D. Int. J. Mol. Sci.， 2016， 17（5）： 632-64

17?Wishart D S. Bioanalysis， 2009， 1（9）： 1579-1596

18?Zhang J， Liu L， Wang X， Huang Q， Tian M， Shen H. Environ. Sci. Technol.， 2016， 50（11）： 5953-5960

19?Wang X， Liu L， Zhang W， Zhang J， Du X， Huang Q， Tian M， Shen H. Environ. Pollut.， 2017， 229： 168-176

20?Nagato E G， Jessica C， Lankadurai B P， Poirier D G， Reiner E J， Simpson A J， Simpson M J. Chemosphere， 2013， 93（2）： 331-337

21?Lu K， Ryan P A， Schlieper K A， Graffam M E， Levine S， Wishnok J S， Swenberg J A， Tannenbaum S R， Fox J G. Environ. Health Perspect.， 2014， 122（3）： 284-291

22?Shi X， Wei X， Koo I， Schmidt R H， Yin X， Kim S H， Vaughn A， McClain C J， Arteel G E， Zhang X， Watson W H. J. Proteome Res.， 2013， 13（2）： 547-554

23?Wu H， Zhang X， Wang Q， Li L， Ji C， Liu X， Zhao J， Yin X. Ecotoxicol. Environ. Saf.， 2013， 90： 1-6

24?Sefaur R， Sinha A C， Pati R， Mukhopadhyay D. Environ. Geochem. Hlth.， 2013， 35（1）： 119-132

25?Mandal B K， Chowdhury T R， Samanta G， Basu G K， Chowdhury P P， Chanda C， Lodh D， Karan N K， Dhar R K， Tamili D K， Das D， Saha K C， Chakraborti D. Curr. Sci.， 1996， 70（11）： 976-986

26?Nordstrom D K. Science， 2002， 296（5576）： 2143-2145

27?Herreweghe S V， Swennen R， Vandecasteele C， Cappuyns V. Environ. Pollut.， 2003， 122（3）： 323-342

28?Reaganshaw S， Nihal M， Ahmad N. FASEB J.， ?2008， 22（3）： 659-661

29?Zhang W， Feng H， Gao Y， Sun L， Wang J， Li Y， Wang C， Zhao L， Hu X， Sun H， Wei Y， Sun D. Biol. Trace Elem. Res.， 2013， 151（2）： 269-276

30?Veenstra T D. Genome Med.， 2012， 4： 40

31?Dunn W B， Wilson I D， Nicholls A W， Broadhurs D. Bioanalysis， 2012， 4（18）： 2249-2264

32?Luan H， Ji F， Chen Y， Cai Z. Anal. Chim. Acta， 2018， 1036： 66-72

33?Max Bylesj， Rantalainen M， Cloarec O， Nicholson J K， Holmes E， Trygg J. J. Chemometr.， 2010， 20（8-10）： 341-351

34?BAI Cai-Jun， LIU Dan， LI Bing. Practical Preventive Medicine， 2012， 19（2）： 314-316

白彩軍， 劉 丹， 李 冰. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2012， 19（2）： 314-316

35?Shi H， Shi X， Liu K J. Mol. Cell. Biochem.， 2004， 255（1-2）： 67-78

36?Zhong F， Zhang S， Shao C， Yang J， Wu X. Pathol. Oncol. Res.， 2010， 16（3）： 413-420

37?ZHANG Ai-Hua， LI Jian， PAN Xue-Li， JIANG Xian-Yao， CEN Du-Cai， HUANG Xiao-Xin. Chinese Journal of Endemiology， 2005， 24（2）： 121-123

張愛華， 李 健， 潘雪莉， 蔣憲瑤， 岑篤才， 黃曉欣. 中華地方病學(xué)雜志， 2005， 24（2）： 121-123

38?Chanda S. Toxicol. Sci.， 2006， 89（2）： 431-437

39?Ali S， Ali S. BMC Med. Genomics， 2010， 3（1）： 35

40?Wang L， Kou M C， Weng C Y， Hu L W， Wang Y J， Wu M J. Arch. Toxicol.， 2012， 86（6）： 879-896

41?Davey J C， Nomikos A P， Wungjiranirun M， Sherman J R， Ingram L， Batki C， Lariviere J P， Hamilton J W. Environ. Health Perspect.， 2008， 116（2）： 165-172

42?Peng Q， Harlow S D， Park S K. Int. J. Hyg. Environ Heal.， 2015， 218（4）： 407-413

43?Sung T C， Huang J W， Guo H R. Biomed. Res. Int.， 2015： ?368087

44?Pan W C， Seow W J， Kile M L， Hoffman E B， Quamruzzaman Q， Rahman M， Mahiuddin G， Mostofa G， Lu Q， Christiani D C. Am. J. Epidemiol.， 2013， 178（10）： 1563-1570

45?Li X， Li B， Xi S， Zheng Q， Wang D， Sun G. Environ. Health， 2013， 12（1）： 37

46?Manoochehr M， Dariush S， Sonia O， Shabnam J. J. Res. Med. Sci.， 2013， 18（5）： 408-412

47?Tsuji J S， Perez V， Garry M R， Alexander D D. Toxicology， 2014， 323： 78-94

48?Zhang J， Shen H， Xu W， Xia Y， Barr D B， Mu X， Wang X， Liu L， Huang Q， Tian M. Environ. Sci. Technol.， 2014， 48（20）： 12265-12274

49?Lee S H， Woo H M， Jung B H， Lee J， Kwon O S， Pyo H S， Choi M H， Chung B C. Anal. Chem.， 2007， 79（16）： 6102-6110

50?SONG Xuan-Bo， ZHAO Li-Jun， WEI Yu-Dan. Chinese Journal of Endemiology， 2018， 37（2）： 165-168

宋選波， 趙麗軍， 魏玉丹. 中華地方病學(xué)雜志， 2018， 37（2）： 165-168

51?HAN Xiao-Fei， HUANG Yu-Hong， WANG Long-Xing， YANG Qian-Xu， XIAO Hong-Bin， ZHANG De-Qin. Chinese J. Anal. Chem.， 2010， 38（5）： 697-701

韓曉菲， 黃宇虹， 王龍星， 楊乾栩， 肖紅斌， 張德芹. 分析化學(xué)， 2010， 38（5）： 697-701

52?Hughes M F， Beck B D， Chen Y， Lewis A S， Thomas D J. Toxicol. Sci.， 2011， 123（2）： 305-332

53?Leeuwenburgh C， Heinecke J W. Curr. Med. Chem.， 2001， 8（7）： 829-838

54?Xiong Y， Xiong Y， Zhou S， Sun Y， Zhao Y， Ren X， Zhang Y， Zhang N. Rejuv. Res.， 2017， 20（2）： 85-92