沈耀川,鄭 歆,余巧龍,陳 昕

(中國人民解放軍第一七四醫(yī)院口腔科,廈門 361000;*通訊作者,E-mail:dentistchenxin@163.com)

舌鱗狀細胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,也是最常見的口腔癌,約占口腔癌的1/3-1/2[1,2]。近年來舌癌的發(fā)病率越來越高,人們對其關(guān)注度也隨之增加。舌癌對患者生存率及面容、口腔頜面部功能等影響均較大。目前以手術(shù)、化療和放療等為主的傳統(tǒng)治療方法未能取得令人滿意的療效[3-5]。舌癌組織中的血管密度可能影響其生長速度及預后。NRP-1最早是作為神經(jīng)細胞導向調(diào)節(jié)因子受體被發(fā)現(xiàn),是一類在脊椎動物中高度保守的分子量為130-140 kDa的糖蛋白[6-8]。近年來大量研究結(jié)果顯示,人類的許多腫瘤組織上都有NRP-1的表達,包括前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤和胰腺癌,而在相應的正常組織中幾乎不表達[9-11]。NRP-1作為血管生長因子的共受體,在腫瘤血管新生方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。NRP-1在對各種腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展有重要作用。目前,已有相關(guān)文獻報道,舌癌組織中有NRP-1的高表達[12,13],但尚沒有NRP-1對舌鱗狀細胞癌細胞的生物學特性影響的相關(guān)基礎(chǔ)研究。本研究旨在初步探討NRP-1在舌鱗狀細胞癌TCa8113細胞的表達及其對TCa8113細胞增殖遷移等生物學特性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)液(Gibco);LB培養(yǎng)基(Solarbio);阿霉素(北京中碩科技有限公司);胎牛血清FBS(Gibco);Lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific);全自動細胞計數(shù)儀(Countstar-全自動細胞計數(shù)儀);Transwell細胞培養(yǎng)小室(Corning);高速離心機(Thermo Fisher Scientific);生物顯微鏡(EVOS);NRP-1抗體(2 mg/ml,GeneTex)。

1.2 細胞系與細胞培養(yǎng)

TCa8113細胞野生型細胞(WT-TCa8113)和NRP-1敲低TCa8113細胞(NRP-1KD-TCa8113)購自上海豐暉生物科技有限公司。用含10% FBS和1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液,于37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 NRP-1單克隆抗體與NRP-1結(jié)合能力的鑒定

首先,利用Western blot檢測WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113兩株細胞中NRP-1的表達情況。接著使用共聚焦顯微鏡檢測NRP-1抗體與T-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113兩株細胞的結(jié)合能力。取對數(shù)生長期的WT-TCa8113細胞和NRP-1KD-TCa8113細胞,蛋白酶消化后,PBS稀釋成單細胞懸液并加入到含有細胞爬片的6孔板中,制備細胞爬片。待細胞爬片制備完成后,加入熒光素BRITC標記的NRP-1抗體與細胞共同孵育30 min。孵育后,除去培養(yǎng)液,PBS輕輕洗滌3次以除去游離和非特異性結(jié)合的抗體。共聚焦熒光顯微鏡下觀察NRP-1單克隆抗體在WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113兩株細胞中的結(jié)合情況。

1.4 實驗設計及分組

實驗設計共設置2個時間點,每個時間點分三組。PBS組(陰性對照組)采用WT-TCa8113細胞系,加100 μl PBS處理;NRP-1 antibody組采用WT-TCa8113細胞系,加100 μl NRP-1單克隆抗體處理;NRP-1 knockdown組采用NRP-1KD-TCa8113細胞系,加100 μl PBS處理。即本研究通過構(gòu)建NRP-1敲低TCa8113細胞系和使用NRP-1單克隆抗體兩種方法抑制TCa8113細胞的NRP-1功能,再通過比較兩種方法抑制NRP-1功能后,對WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細胞12 h和24 h兩個時間點的增殖、遷移、凋亡及對化療藥物敏感性的影響。

1.5 細胞計數(shù)儀檢測抑制NRP-1功能對細胞增殖的影響

取對數(shù)增長期的WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細胞分別稀釋成2×105/ml。按1.4的分組將兩株組細胞分成6組并接種到12孔板,每組設3個復孔。分別在培養(yǎng)后12 h和24 h兩個時間點使用細胞計數(shù)儀測細胞數(shù)量,每次測量前均使用胰蛋白酶進行消化并用槍頭吹打混勻。

1.6 Transwell檢測抑制NRP-1功能對細胞遷移能力的影響

按1.4的分組將WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113兩株組細胞細胞稀釋成2×105/ml,并分成6組,分別取100 μl加入transwell上腔,下腔放入600 μl含有0.5% BSA的DMEM培養(yǎng)液。于37 ℃,5% CO2條件下培養(yǎng),分別在培養(yǎng)后12 h和24 h兩個時間點收集下腔的細胞做細胞計數(shù)。

1.7 流式細胞儀檢測抑制NRP-1功能對細胞凋亡的影響

取對數(shù)生長期的WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細胞稀釋成10×104/ml,轉(zhuǎn)移至6孔板中培養(yǎng)。按1.4的分組將上述兩株組細胞分成6組并做相應處理,于37 ℃、5% CO2條件培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后12 h和24 h兩個時間點收集細胞并用500 μl binding buffer重懸細胞后,加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI染色液,混勻后室溫孵育15 min。孵育完畢收集細胞用預冷500 μl PBS重懸后流式細胞儀檢測,計算總細胞量和凋亡細胞量。

1.8 細胞計數(shù)儀檢測抑制NRP-1功能對細胞化療藥物敏感性的影響

取對數(shù)生長期的WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細胞按1.4的分組將兩株組細胞分成6組并做相應處理。用含有不同濃度的表阿霉素(EPI)的培養(yǎng)基稀釋成2×105/ml,每組細胞的EPI終濃度分別為0.001,0.01,0.1,0.2,0.5,1 μg/ml。于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)后12 h和24 h兩個時間點使用細胞計數(shù)儀計算凋亡細胞和總細胞數(shù)。分別計算各組細胞在不同濃度EPI處理下的細胞凋亡率。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 NRP-1敲低細胞株及NRP-1抗體結(jié)合能力的鑒定

Western blot結(jié)果顯示,野生型細胞WT-TCa8113組在130 kDa附近出現(xiàn)一明顯特異性條帶,與NRP-1理論分子量復合。而NRP-1敲低組NRP-1KD-TCa8113組的NRP-1蛋白表達量較野生型細胞明顯降低。結(jié)果表明,成功構(gòu)建NRP-1敲低的TCa8113細胞株,且敲低效率較明顯(見圖1)。

共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示,在WT-TCa8113組中,可見明顯紅色熒光在細胞表面集聚,而NRP-1KD-TCa8113組則沒有(見圖2)。結(jié)果表明,NRP-1抗體可在活體細胞中與TCa8113細胞膜上的NRP-1結(jié)合。

圖1 Western blot檢測WT-TCa8113和NRP-1KD-TCa8113細胞株NRP-1蛋白表達量Figure 1 Western blot analysis of NRP-1 expression in WT-TCa8113 and NRP-1KD-TCa8113 cell lines

圖2 共聚焦顯微鏡分析NRP-1抗體與TCa8113細胞膜表面的NRP-1的結(jié)合能力Figure 2 Confocal microscopy analysis of the binding ability of NRP-1 antibody to TCa8113 cells

2.2 細胞計數(shù)儀檢測抑制NRP-1功能對細胞增殖的影響

以PBS組作為陰性對照,分別比較NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組培養(yǎng)12 h和24 h后的細胞數(shù),評估兩者抑制NRP-1功能后對TCa8113細胞增殖的影響,結(jié)果見表1。在0 h時,三組細胞數(shù)無統(tǒng)計學差異(P=0.716)，均約為2×105/ml。而培養(yǎng)12 h后,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組的細胞數(shù)開始較PBS組少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。培養(yǎng)24 h后,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組的細胞數(shù)與PBS組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)果表明,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組抑制NRP-1功能后,能夠抑制TCa8113細胞增殖,因此可推測,NRP-1具有促進TCa8113細胞增殖的作用。

此外,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組對比,在12 h和24 h兩個時間點,NRP-1 knockdown組的細胞數(shù)均小于NRP-1 antibody組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示通過shRNA方法構(gòu)建NRP-1低表達細胞株對NRP-1功能抑制可能更徹底,故對細胞抑制作用更明顯。

表1 抑制NRP-1功能對細胞增殖的影響(×105/ml)

Table 1 Effect of NRP-1 function inhibition on cell proliferation(×105/ml)

分組0 h12 h24 hPBS組2.03±0.183.79±0.355.93±0.44NRP-1 antibody組2.14±0.222.96±0.48?3.71±0.57??NRP-1 knockdown組2.18±0.272.41±0.22?#2.66±0.29??#

與PBS組比較,*P<0.05,**P<0.01;與NRP-1 antibody組比較,#P<0.05

2.3 Transwell檢測抑制NRP-1功能對細胞遷移能力的影響

用Transwell檢測NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組細胞的遷移能力,結(jié)果見圖3。NRP-1antibody組和NRP-1 knockdown組的細胞遷移能力在12 h和24 h兩個時間點下室細胞量與相應時間段的PBS陰性對照組有顯著差異。12 h時,PBS組,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組下室細胞量分別為428±56,235±43和197±27個。方差分析三組間均數(shù)具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。其中NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組細胞數(shù)比PBS組少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

與PBS組比較，**P<0.01圖3 NRP-1抗體和NRP-1敲低對細胞遷移的影響 (n=3)Figure 3 Effect of NRP-1 antibody and NRP-1 knockdown on cell migration (n=3)

在24 h時,PBS組、NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組下室細胞量分別為587±61,398±42和244±37個。方差分析三組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。其中PBS組細胞數(shù)比NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組多,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)果表明,用NRP-1 antibody和NRP-1 shRNA抑制NRP-1功能后,能夠抑制TCa8113細胞遷移能力。

此外,NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組對比,在12 h和24 h兩個時間點的細胞數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。

2.4 流式細胞儀檢測抑制NRP-1功能對細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測NRP-1antibody組和NRP-1 knockdown組的細胞凋亡情況見圖4。12 h時PBS組、NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組細胞凋亡率分別為(8.2±1.5)%,(14.9±2.4)%和(24.2±5.8)%,方差分析三組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。其中NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組比PBS組細胞凋亡率低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

與PBS組比較，**P<0.01圖4 NRP-1抗體和NRP-1敲低對細胞凋亡的影響 (n=3)Figure 4 Effect of NRP-1 antibody and NRP-1 knockdown on apoptosis (n=3)

24 h時PBS組、NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組細胞凋亡率分別為(10.0±3.7)%,(20.9±3.8)%和(35.4±6.3)%,方差分析三組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。其中NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組比PBS組細胞凋亡率低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

此外,NRP-1antibody組和NRP-1 knockdown組12 h時凋亡率差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.082);24 h時兩組凋亡率差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.086)。

2.5 抑制NRP-1功能對細胞耐藥的影響

細胞對化療藥物的敏感性一定程度可以反映細胞的耐藥程度,本實驗通過各組細胞的半數(shù)凋亡率的化療藥物濃度來評估NRP-1對細胞耐藥的影響,利用IC50Calculator計算軟件計算各組的IC50,結(jié)果見圖5。藥物培養(yǎng)12 h,PBS組、NRP-1 antibody組和NRP-1 knockdown組的半數(shù)凋亡率的化療藥物濃度分別為(0.48±0.14)μg/ml,(0.19±0.06)μg/ml和(0.11±0.03)μg/ml,NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組與PBS組對比,P值分別為0.016和0.006,差異有統(tǒng)計學意義。NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組對比,兩者半數(shù)凋亡濃度無統(tǒng)計學差異(P=0.107)。

藥物培養(yǎng)24 h,PBS組、NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組的半數(shù)凋亡率的化療藥物濃度分別為(0.23±0.08)μg/ml,(0.12±0.04)μg/ml和(0.06±0.02)μg/ml,NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組與PBS組對比,P值分別為0.035和0.007。結(jié)果表明兩種方法抑制NRP-1功能均能增加細胞對化療藥物的敏感性,使細胞凋亡率增加。NRP-1抗體組和NRP-1 knockdown組對比,兩者半數(shù)凋亡濃度無統(tǒng)計學差異(P=0.081)。

圖5 不同處理組處理12 h和24 h后的細胞凋亡率 (n=3)Figure 5 Apoptosis rate after treatment for 12 h and 24 h in different treatment groups (n=3)

3 討論

口腔頜面部惡性腫瘤的發(fā)病率居全身惡性腫瘤的第六位,而其中至少有80%是鱗狀細胞癌[14]。口腔舌鱗狀細胞癌惡性程度較高,且易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,預后較差,術(shù)后常繼發(fā)畸形,對患者生活質(zhì)量造成極大影響[15,16]。而傳統(tǒng)放化療對舌癌效果不佳,故研究新的治療方式尤為重要。惡性腫瘤的快速生長,需要大量血管為其提供豐富的營養(yǎng),通過抑制腫瘤內(nèi)血管生成,從而抑制腫瘤生長,是治療舌癌的重要思路之一[17]。而NRP-1具有獨特的分子結(jié)構(gòu),其作為Sema3A和VEGF165等細胞因子的多功能受體,并受多種miRNA分子的負向調(diào)控,在神經(jīng)發(fā)育、血管生成、腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)免疫等方面發(fā)揮著重要作用,特別是其在腫瘤血管新生及腫瘤轉(zhuǎn)移方面中的作用[18-20]。NRP-1有可能成為未來口腔癌靶向治療的新靶點、新方向。

目前已有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),NRP-1在人舌癌組織及細胞系TCa8113中呈高表達,提示可能和舌癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[12,21]。但是目前仍沒有NRP-1對人舌癌組織及細胞系TCa8113細胞生物學功能的相關(guān)基礎(chǔ)研究,NRP-1對舌癌TCa8113細胞生物學特性的影響尚不清楚。本研究以舌癌TCa8113細胞為研究對象,采用敲低NRP-1或NRP-1抗體兩種方法抑制TCa8113細胞NRP-1的功能,與野生型細胞比較,從而探討NRP-1對TCa8113細胞的生物學特征的影響。本實驗中,使用兩種方法抑制NRP-1功能后,TCa8113細胞的增殖能力均顯著降低,而凋亡率則顯著增加,說明NRP-1對TCa8113的發(fā)生發(fā)展有促進作用。在抑制NRP-1功能后,流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,細胞發(fā)生凋亡,且多集中在早期凋亡。該結(jié)果與NRP-1在其他腫瘤中的作用相同。唐子春等[22]利用慢病毒介導的RNA干擾技術(shù),特異性抑制NRP-1基因在人舌鱗狀細胞株SCC25中的表達,結(jié)果提示NRP-1基因沉默可顯著降低腫瘤細胞的體外遷徙能力。本研究在TCa8113細胞中也得到相同結(jié)果。

舌癌的原發(fā)或繼發(fā)耐藥是導致療效差及復發(fā)率與死亡率高的重要原因[23]。近年來,探究舌癌的耐藥機制、如何克服或逆轉(zhuǎn)耐藥成為口腔舌癌治療的研究熱點。目前有研究報道,NRP-1可能與各類腫瘤的耐藥相關(guān)[24-26]。在本研究中,兩種方法抑制NRP-1功能后,細胞對化療藥物的敏感性明顯增加,NRP-1或可成為逆轉(zhuǎn)舌癌耐藥的一個重要靶點?；蚩赏ㄟ^NRP-1單克隆抗體抑制NRP-1功能,從而提高舌癌對化療藥物的敏感性。

本研究首次從細胞水平上探討NRP-1對口腔舌癌TCa8113細胞生物學特性的影響研究,但相關(guān)的機制仍未探究,后期仍需要更深入探究NRP-1影響TCa8113細胞生物學特性的機制。