尹 思,杜 恒*,趙為公,麻少輝,張 明,管 民,劉 淼

(1西安交通大學第一附屬醫(yī)院骨科,西安 710065;2西安交通大學第一附屬醫(yī)院影像科;3河南省人民醫(yī)院影像科;*通訊作者,E-mail:drdu168@126.com)

椎間盤是人體內(nèi)最大的無血供組織,椎間盤的營養(yǎng)通路主要有兩種方式:一是終板營養(yǎng)途徑,椎體內(nèi)血管的營養(yǎng)物質(zhì)通過骨髓腔-血竇-軟骨終板擴散到椎間盤,營養(yǎng)髓核及纖維環(huán)內(nèi)層,此途徑是椎間盤營養(yǎng)的主要途徑[1];二是纖維環(huán)營養(yǎng)途徑,營養(yǎng)物質(zhì)從纖維環(huán)表面的血管擴散進入纖維環(huán)外層,營養(yǎng)范圍相對較局限[2]。大量研究證實椎間盤營養(yǎng)障礙會導致椎間盤退變的發(fā)生,影響椎間盤營養(yǎng)的因素主要有椎體的血液供應和軟骨終板的生理狀態(tài)等[3,4]。

動態(tài)增強MRI(DCE-MRI)是近年來被廣泛采用研究終板營養(yǎng)途徑的彌散過程,進而反映椎間盤的營養(yǎng)機制的重要技術(shù),它是通過測量順磁性對比劑進入椎間盤的快慢及多少定量觀察椎間盤的強化程度,可以直觀反映椎間盤的營養(yǎng)物質(zhì)通過椎體、軟骨終板及髓核組織的整個彌散過程,具有無創(chuàng)、可重復、可定量分析等優(yōu)點[5-7]。本實驗通過對正?；铙w成年山羊腰椎進行DCE-MRI研究,選用不同類型的對比劑定量觀察研究山羊腰椎椎體、軟骨終板和髓核組織的彌散途徑和特性,為椎間盤營養(yǎng)途徑和機制的深入研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 倫理學聲明

動物實驗已被西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準實施,審查批件號:2015倫審科字第G-8號,并遵守相關(guān)實驗動物飼養(yǎng)與使用指南。實驗過程中遵守實驗動物倫理原則,盡可能減少實驗動物的痛苦,并妥善處理動物尸體。

1.2 實驗動物

選取來自同一畜牧區(qū)相同品種的成年雌性山羊8只,24月齡,體質(zhì)量為35-45 kg,平均(41.1±5.8)kg,由西安交通大學醫(yī)學院動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(陜)2007-001。經(jīng)檢驗檢疫合格,無任何畜類疾病及傳染病,標準飼養(yǎng)條件下適應性飼養(yǎng)2周。

1.3 主要試劑與儀器

硫酸阿托品注射液(2 ml ∶1 mg，天津藥業(yè)集團新鄭股份有限公司)；地西泮注射液(2 ml ∶10 mg，上海旭東海普藥業(yè)有限公司)；速眠新Ⅱ注射液(1.5 ml ∶0.2 g，軍需大學獸醫(yī)研究所)；丙泊酚注射液(200 mg，北京費森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司)；釓貝葡胺(Gd-BOPTA)注射液(相對分子量1 058.17，離子型；5.290 g，Bracco S.P.A,意大利)；釓雙胺(Gd-DTPA-B)注射液(相對分子量573.66，非離子型；5.74 g，GE Healthcare，愛爾蘭)。1.5T雙梯度磁共振系統(tǒng)(Intera Achieva，Philips公司，荷蘭)。

1.4 DCE-MRI掃描

實驗前山羊禁飲食24 h,術(shù)前30 min肌注阿托品0.05 mg/kg和地西洋10 mg。實驗開始時山羊肌肉注射速眠新Ⅱ(0.3 ml/kg)。選擇耳緣靜脈安置靜脈留置針,滴注丙泊酚注射液(2 mg/kg)維持鎮(zhèn)定,滴速根據(jù)山羊麻醉深度調(diào)整。

將山羊置于側(cè)臥位,用魚肝油體表定位,分別標記腰1、腰6椎體棘突。在腰椎背側(cè)放置裝有純凈水的50 ml注射器作為水模。采用SENSE相共振體線圈包裹羊腰椎,側(cè)臥位,先行T2WI-TSE-SPAIR掃描(TR/TE=3 500 ms/60 ms,層厚/層間距=4.0 mm/0.6 mm,掃描時間為211 s)。然后進行矢狀位T1-TSE-SPIR平掃(TR/TE=400 ms/7.8 ms,層厚/層間距=4.0 mm/0.6 mm)。

1.5 釓貝葡胺DCE-MRI掃描

常規(guī)掃描之后行DCE-MRI掃描,經(jīng)耳緣靜脈留置針快速推注釓貝葡胺,劑量為0.3 mmol/kg,推注完后以20 ml生理鹽水沖管。以推注完對比劑時刻作為0 min,分別于0 min,5 min,10 min,30 min,1 h,1.5 h,2 h,2.5 h掃描,序列為矢狀位T1-TSE-SPIR,參數(shù)與平掃時完全相同。全部試驗用時5-7 h。掃描結(jié)束后拔出氣管插管,經(jīng)靜脈留置針靜滴生理鹽水100 ml,約5 min后山羊清醒。

1.6 釓雙胺DCE-MRI掃描

將參加上述實驗的山羊飼養(yǎng)1周后,行釓雙胺DCE-MRI掃描,具體步驟同上。掃描結(jié)束后拔出氣管插管,經(jīng)靜脈留置針靜滴生理鹽水100 ml,術(shù)后觀察直至山羊清醒。

1.7 DCE-MRI圖像處理

掃描結(jié)束后選取腰椎正中矢狀位層面進行ROI測量。感興趣區(qū)(region of interest,ROI)分別選取相應椎間隙上下椎體中心區(qū)域、上下軟骨終板區(qū)、髓核共5個區(qū)域。按照觀察部位形態(tài),椎體和終板區(qū)ROI選取矩形,像素數(shù)目分別為80和12個;髓核區(qū)ROI選取橢圓形,像素數(shù)目為16個。在水模區(qū)選取矩形ROI,像素數(shù)目為100個。選取ROI時避免容積效應影響。在相同的窗寬窗位下分別測量不同時間點掃描野內(nèi)顯示清晰的分布在椎體、軟骨終板和髓核的5個ROI信號強度值(見圖1)。繪制椎體、軟骨終板區(qū)及髓核時間-信號強度曲線。

測量要求:測量各ROI在增強前、增強后0 min,5 min,10 min,30 min,1 h,1.5 h,2 h,2.5 h的信號強度值。增強前后不同時間點觀察圖像均選擇正中矢狀層面;測量時保證窗寬窗位相同;每次將ROI置于相同的位置;如遇ROI確定有困難,可與其他序列對比校正。

以平掃時ROI的信號強度(signal intensity,SI)為增強前,增強后某一時間點的信號強度為SI增強后,計算增強率=(SI增強后-SI增強前)/SI增強前×100%,繪制各ROI時間-增強率曲線。

椎體區(qū)ROI為大面積矩形;軟骨終板區(qū)ROI為小面積矩形;髓核區(qū)ROI為橢圓形圖1 山羊椎體、終板及髓核ROI選擇示意圖Figure 2 The selection of ROI in the vertebrae, cartilage endplate and nucleus pulpous of the goats

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 山羊腰椎椎體時間-增強率曲線

靜注Gd-BOPTA后,山羊腰椎椎體中心區(qū)域信號強度從0 min開始迅速上升,至5 min時達到高峰(增強率216.1%±23.3%)后緩慢下降,于1.5 h時(增強率81.0%±7.00%)再次開始逐漸緩慢上升直至2.5 h。而靜注Gd-DTPA-B后,山羊腰椎椎體中心區(qū)域信號強度也從0 min開始迅速上升,上升幅度較Gd-BOPTA低,至5 min時達到高峰(增強率119.1%±6.81%)后緩慢下降,直至2.5 h時趨于平緩(見表1)。兩組對比劑在山羊椎體中不同時間點的增強率之間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。兩組對比劑在山羊椎體中增強率的最高峰值之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。山羊腰椎椎體時間-增強率曲線見圖2。

2.2 山羊軟骨終板區(qū)時間-增強率曲線

靜注Gd-BOPTA后,山羊軟骨終板區(qū)時間-增強率曲線與椎體時間-增強率曲線趨勢大致相同,至5 min時上升至最高峰(增強率168.7%±39.4%),而后下降趨勢較為平緩。靜注Gd-DTPA-B后,軟骨終板區(qū)信號強度從0 min開始上升,但至10 min時上升至最高峰(增強率81.6%±16.8%),其最高信號強度較椎體低,而后下降趨勢也較為平緩。

表1 兩組對比劑在山羊椎間盤不同部位不同時間增強率對比

Table 1 The signal intensities of regions of interest in the vertebrae, cartilage endplate and nucleus pulposus at different time points with two contrast agents

部位-對比劑0 min 5 min 10 min 30 min 60 min 90 min 120 min 150 min椎體 Gd-BOPTA0 216.1±23.3183.8±17.8156.2±18.7126.6±14.881.0±7.00 83.7±5.9690.2±7.88 Gd-DTPA-B0 119.1±6.81??116.2±6.97?? 85.2±9.52?? 72.0±6.88??52.8±7.77?? 47.7±6.39??43.9±7.24??軟骨終板 Gd-BOPTA0 168.7±39.4153.6±32.4135.4±27.2 93.3±20.783.0±23.1111.8±29.195.4±19.9 Gd-DTPA-B0 68.6±19.2?? 81.6±16.8?? 67.5±23.2?? 69.4±19.2?51.1±20.1? 50.2±16.0??51.3±13.5??髓核 Gd-BOPTA0 6.03±11.9 8.10±12.3 16.5±17.6 36.5±14.970.5±20.0102.4±21.425.8±15.4 Gd-DTPA-B0-4.42±7.61 6.24±9.67 17.0±7.92 53.7±8.69?64.6±7.97 73.4±9.80??88.5±7.56??

Gd-BOPTA:釓貝葡胺;Gd-DTPA-B:釓雙胺;與Gd-BOPTA組比較,*P<0.05,**P<0.01

與釓雙胺組比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 兩組對比劑靜注后山羊腰椎椎體時間-增強率曲線Figure 2 The time-signal intensity curves of DCE-MRI with two contrast agents in the vertebrae of the goats

兩組對比劑在山羊軟骨終板中不同時間點的增強率之間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組對比劑在山羊軟骨終板中增強率的最高峰值之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。山羊軟骨終板區(qū)時間-增強率曲線見圖3。

2.3 山羊腰椎髓核時間-增強率曲線

靜注Gd-BOPTA后,山羊腰椎髓核時間-增強率曲線呈緩慢上升趨勢,至2 h時達到最高峰(增強率102.4%±21.4%),其后迅速下降。靜注Gd-DTPA-B后,山羊腰椎髓核區(qū)域信號強度在5 min內(nèi)顯示為負值,之后緩慢上升,直至2.5 h時達到最高峰(增強率88.5%±7.56%)。兩組對比劑在山羊腰椎髓核中的增強率僅在1 h(P<0.05)、2 h(P<0.01)和2.5 h(P<0.01)時差異有統(tǒng)計學意義,在其他時間點時兩者差異無統(tǒng)計學意義。兩組對比劑在山羊腰椎髓核中增強率的最高峰值之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.11)。山羊髓核區(qū)時間-增強率曲線見圖4。

與釓雙胺組比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 兩組對比劑靜注后山羊腰椎髓核區(qū)時間-增強率曲線Figure 4 The time-signal intensity curves of DCE-MRI with two contrast agents in the nucleus pulpous of the goats

3 討論

椎間盤是體內(nèi)最大的無血管結(jié)構(gòu),其營養(yǎng)成分主要通過血管進入椎體,再經(jīng)椎體內(nèi)部的小血管到達終板區(qū),通過終板彌散進入髓核。因此,當上述環(huán)節(jié)中的任何一環(huán)發(fā)生問題時,椎間盤的營養(yǎng)就受到影響[8]。對比劑的終板彌散特性是對比劑自然屬性和椎間盤特性共同作用的結(jié)果。靜脈注射不同性質(zhì)的對比劑彌散至椎間盤的量,不僅取決于對比劑的劑量、電磁性和分子量等屬性,也取決于椎體、終板、髓核的性狀[9,10]。本實驗選用不同類型的對比劑定量觀察軟骨終板的彌散特性,進而研究椎間盤的終板營養(yǎng)途徑的特性和其在椎間盤物質(zhì)代謝中的作用。

3.1 對比劑的劑量對終板彌散的影響

目前,對比劑已廣泛應用于DCE-MRI檢查中,以增加體內(nèi)不同組織之間的對比性[11,12]。當MRI的信號強度在原有基礎(chǔ)上提高25%以上時,才能通過肉眼區(qū)分[13]。利用DCE-MRI技術(shù)可以無創(chuàng)地定量分析椎間盤的營養(yǎng)彌散運輸過程[5-7,14]。多項報道證實利用DCE-MRI分析椎間盤的終板營養(yǎng)途徑的過程中,對比劑在到達軟骨終板區(qū)之前,主要先通過各級血管到達椎體,其椎體區(qū)域的時間-增強率曲線主要受到對比劑劑量的影響,即對比劑的劑量越大,椎體區(qū)域的強化效果就越明顯。Ibrahim等[15]在11只家兔體內(nèi)注射0.1-2.8 mmol/kg劑量的釓噴酸葡胺并觀察腰椎間盤的增強MR的影像,發(fā)現(xiàn)只有在對比劑劑量大于0.3 mmol/kg時對比增強的影像才能被檢測到。Akansel等[16]通過為18名患者分別注射0.1 mmol/kg和0.3 mmol/kg的釓特醇,檢測所有患者的腰椎間盤增強MR的信號強度,證實當對比劑劑量累積達到0.3 mmol/kg時,信號強度要顯著高于0.1 mmol/kg劑量組,而且這種信號增強的程度在終板附近比在椎間盤中央?yún)^(qū)域更為明顯。

在本研究中兩種對比劑在相同的劑量下(0.3 mmol/kg),椎體區(qū)域的時間-增強率曲線峰值的到達時間基本一致,但峰值存在差異。造成這種差異的主要原因是Gd-BOPTA含有苯氧基,屬于芳香環(huán)類化合物,具有親脂性,可與血漿蛋白尤其是白蛋白發(fā)生可逆性的結(jié)合。Gd-BOPTA在人類血漿組織中的縱向弛豫率(r1)和橫向弛豫率(r2)分別為9.7,12.5/(mmol/L·s),比傳統(tǒng)的細胞外間隙對比劑高出近1倍,其弛豫率為Gd-DTPA的2倍,即一半劑量時即可達到同樣的增強效果[17]。因此,在椎體區(qū)域的時間-增強率曲線峰值上,Gd-BOPTA的最高峰值要顯著高于Gd-DTPA。

3.2 對比劑的電磁性對終板彌散的影響

軟骨終板的主要生化組成蛋白多糖是調(diào)節(jié)椎間盤物質(zhì)運輸?shù)年P(guān)鍵因素。蛋白多糖是一類含有多聚負離子的化合物,對水和陽離子具有較大的親和力。這就意味著陽性和中性的溶質(zhì)能相對自由地進入椎間盤;而含陰離子的物質(zhì)則不容易通過椎間盤。譬如葡萄糖、氧氣可以相對自由地擴散進入椎間盤;陰離子如硫離子、氯離子等則不容易擴散通過終板。軟骨終板的蛋白多糖含量的減少可引起椎間盤的營養(yǎng)運輸障礙,導致髓核中蛋白多糖的含量下降,甚至椎間盤退變的發(fā)生。而在髓核中央,由于低氧氣環(huán)境和乳酸濃度高,髓核內(nèi)的蛋白多糖帶有較多的固定負電荷,對中性或陽離子物質(zhì)具有親和力,因此中性或陽性離子可以相對容易地通過終板進入椎間盤,而陰離子則不易進入椎間盤[18,19]。

在本研究中,可觀察到以下有趣現(xiàn)象:Gd-BOPTA在椎體和軟骨終板區(qū)的時間增強率的峰值要顯著高于Gd-DTPA(約2倍左右),但在髓核中的峰值卻與后者非常接近。這恰恰說明軟骨終板和髓核基質(zhì)對于對比劑彌散作用的影響。本研究發(fā)現(xiàn)兩種對比劑在相同的劑量下椎體、軟骨終板和髓核的時間-增強率曲線存在較大差異,其原因主要在于不同對比劑之間電磁性的差異,進而導致通過軟骨終板區(qū)達到髓核的對比劑的數(shù)量不同。

3.3 對比劑的分子量對終板彌散的影響

磁共振增強對比劑分子量的大小也影響了其在椎間盤彌散速度的快慢[9,10]。一般來講,正常椎間盤中,對比劑的彌散與其分子量成反比。大分子量及半徑的物質(zhì)比小分子量物質(zhì)彌散更慢。將對比劑鏈接高分子量的溶質(zhì),會抑制其向椎間盤的彌散。Perlewitz等[20]在家兔體內(nèi)靜脈注射相同劑量的釓噴酸葡甲胺鹽(相對分子量546)及釓-聚賴氨酸螯合物(相對分子量40 000),并比較兩種對比劑在家兔椎間盤內(nèi)的彌散情況,發(fā)現(xiàn)釓-多聚賴氨酸的椎間盤增強值顯著小于釓噴酸葡胺,但在肌肉中的含量兩者之間卻無顯著差異。這可能提示溶質(zhì)的分子量大小影響它們穿透軟骨終板基質(zhì)的能力,分子量越大滲透能力越低,小分子量的營養(yǎng)物質(zhì)更容易彌散到椎間盤髓核中。本研究的結(jié)果也印證了上述觀點,Gd-BOPTA的分子量幾乎是Gd-DTPA-B的分子量的2倍左右,使得Gd-DTPA雖然在椎體和軟骨終板區(qū)的增強率的峰值只有Gd-BOPTA的一半左右,但是在髓核中的峰值幾乎相同。除了不同對比劑之間電磁性的差異以外,對比劑分子量的大小也是影響溶質(zhì)通過終板彌散的另一個重要影響因素。

本實驗利用不同對比劑通過DCE-MRI技術(shù)研究山羊腰椎椎體、軟骨終板和髓核彌散的途徑及特性,證實了溶質(zhì)的劑量、電磁性和分子量都是影響終板彌散過程的重要因素,為今后椎間盤營養(yǎng)途徑和機制的深入研究奠定了理論基礎(chǔ)。