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      江蘇地區(qū)金黃色葡萄球菌耐藥及分子分型研究

      2019-08-08 00:45:10陽2談忠鳴錢慧敏孔筱筱
      中國人獸共患病學報 2019年7期
      關鍵詞:葡菌蘇南地區(qū)種數

      洪 捷,曹 陽2,談忠鳴,錢慧敏,董 晨,顧 玲,孔筱筱,周 璐

      金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)是導致社區(qū)感染和院內感染的一種重要病原菌。SA廣泛分布于健康人的皮膚表面和鼻咽等部位,并可感染人引起多種侵襲性疾病和毒素性疾病[1]??股厥侵委熂毦腥镜闹饕幬铮S著抗生素廣泛使用,SA對各類抗生素的敏感性逐漸降低。在我國,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)檢出率較高,最高占SA感染總數的50%以上[2]。多數MRSA對目前臨床應用的絕大多數抗生素均耐藥,且其感染長發(fā)生于免疫缺陷、大面積燒傷、大手術后及老年患者,容易造成流行和暴發(fā),病死率可高達50%。

      SA對不同的抗生素有不同的耐藥機制,對β-內酰胺類藥物的耐藥,主要通過mec基因復合體調控合成新的青霉素結合蛋白以及合成β-內酰胺酶阻止藥物到達作用靶點兩種方式[3]; 對于四環(huán)素類藥物耐藥,主要通過tetM基因加速藥物自核糖體解離以及tetK基因編碼外排泵蛋白加速藥物外排的方式來實現(xiàn)[4];對大環(huán)內酯類藥物的耐藥,主要通過erm基因修飾靶位核糖體而阻止藥物與之結合、產生滅活酶滅活大環(huán)內酯類抗生素以及esr基因調控加速藥物泵出的方式[5]。

      本文通過研究2017年全省范圍內收集的227株金黃色葡萄球菌,檢測其對15種抗生素的耐藥性,檢測7種耐藥基因的攜帶率,同時采用MLST方法對金葡菌進行分子分型,分析不同地區(qū)、不同來源的金葡菌的耐藥性、耐藥機制和分子流行病之間的特征關系。

      1 材料與方法

      1.1對象 本研究中的227株金黃色葡萄球菌均為2017年通過國家致病菌識別網收集,菌株來自全省13個設區(qū)市的26家哨點醫(yī)院,其中蘇中地區(qū)40株,蘇北地區(qū)87株,蘇南地區(qū)100株,藥敏質控株糞腸球菌ATCC29212和金黃色葡萄球菌ATCC29213均購自中國藥品生物制品檢定所。

      1.2 方 法

      1.2.1藥物敏感性檢測 采用微量肉湯稀釋法檢測金葡菌對抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)。檢測使用的藥敏板為商品化的致病菌識別網定制板條,檢測的抗生素包括苯唑西林、頭孢西丁、青霉素、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、萬古霉素、替考拉寧、慶大霉素、左氧氟沙星、利福平、復方新諾明、達托霉素、利奈唑胺和呋喃妥因,藥敏板購自上海星佰生物科技有限公司。藥敏結果判讀根據美國國立臨床標準實驗室委員會(CLSI)2018 M100手冊要求。

      1.2.2DNA提取 將菌株接種于營養(yǎng)瓊脂,37 ℃培養(yǎng)16~18 h,挑取足量的菌落重懸于無菌的生理鹽水中,然后使用商品化的核酸提取試劑盒(QIAamp○RDNA Mini Kit)提取DNA。

      1.2.3耐藥基因檢測 甲氧西林耐藥基因(mecA)、四環(huán)素耐藥基因(tetK、tetM)、紅霉素耐藥基因(ermA、ermB、ermC)、克林霉素耐藥基因(linA)的引物序列參照文獻[6-7],由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,90 V,50 min在凝膠成像儀下判讀結果。

      1.2.4MLST分子分型 7個管家基因(arcC、aroE、glpF、gmK、pta、tpi、yqiL)的引物序列參照金黃色葡萄球菌MLST數據庫(https://pubmlst.org/saureus/),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測序結果上傳到金黃色葡萄球菌MLST數據庫進行在線分析,獲取每個菌株7個管家基因的等位基因編號(allelic profile),根據等位基因編號得出序列型(Sequence type,ST)。與數據庫比對后數據庫中沒有的ST型,則為新發(fā)現(xiàn)的ST型。最后根據已獲得的ST型使用eBURST分析軟件進行聚類分析。

      1.3數據處理 將數據錄入SPSS24.0系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析,分類資料采用卡方檢驗,非參數資料采用秩和檢驗,以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義??ǚ椒指畈捎肂onferroni校正P值。

      2 結 果

      2.1金葡菌的標本來源 2017年1月至12月,共收集227株金黃色葡萄球菌,其中分離自無菌部位樣本67株(包括血液、腦脊液等),占29.5%,分離自開放部位樣本160株(包括分泌物、膿液、糞便、痰液等),占70.5%。

      2.2金葡菌耐藥性 227株金黃色葡萄球菌對青霉素、紅霉素、頭孢西丁、苯唑西林、克林霉素、左氧氟沙星、四環(huán)素、慶大霉素的耐藥率較高,而對替考拉寧、利福平、復方新諾明、達托霉素、利奈唑胺以及呋喃妥因多呈敏感,耐藥率均低于10%,且所有菌株均對萬古霉素敏感。所有菌株的具體耐藥情況見表1。

      227株金葡菌中,耐三類以上抗生素的菌株,即多重耐藥菌株98株,占43.1%。有1株對10種抗生素耐藥,對全部15種抗生素均敏感的菌株有10株。

      表1 金黃色葡萄球菌的耐藥性

      Tab.1 Drug resistance ofStaphylococcusaureus

      抗菌藥物耐藥菌株數(n)耐藥率/%苯唑西林11751.5頭孢西丁12755.9青霉素20891.6四環(huán)素5323.3紅霉素15668.7克林霉素9943.6萬古霉素00替考拉寧73.0慶大霉素4519.8左氧氟沙星7533.0利福平31.3復方新諾明156.6達托霉素10.4利奈唑胺20.9呋喃妥因94.0

      無菌部位分離的菌株平均耐藥數為3.82種,開放部位分離的菌株平均耐藥數為4.12種,兩組菌株在耐藥種數和不同抗生素耐藥率均不存在統(tǒng)計學差異(均P>0.05)。蘇北地區(qū)菌株平均耐藥種數為4.49種,蘇南地區(qū)平均耐藥種數為3.74種,蘇中地區(qū)平均耐藥種數為3.75種,蘇北地區(qū)耐藥種數高于蘇南地區(qū)菌株(Z=-2.206,P=0.027)。且蘇北地區(qū)菌株克林霉素耐藥率要高于蘇中(χ2=5.643,P=0.018)和蘇南地區(qū)(χ2=5.523,P=0.019)。

      2.3MRSA與MSSA檢出情況 本研究以更穩(wěn)定的苯唑西林代替甲氧西林,將耐苯唑西林的金葡菌判定為耐甲氧西林金葡菌(MRSA),共檢出117株MRSA,檢出率為51.5%。

      無菌部位標本檢出MRSA35株,開放部位標本檢出82株,不同部位標本MRSA檢出率無統(tǒng)計學差異(χ2=1.109,P=0.292)。蘇北地區(qū)檢出MRSA 45株,蘇中地區(qū)菌株檢出22株,蘇南地區(qū)檢出50株,3個地區(qū)之間MRSA檢出率無統(tǒng)計學差異(χ2=0.288,P=0.866)。MRSA平均耐藥種數4.81種(不計算苯唑西林),甲氧西林敏感金葡菌(methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus, MSSA)平均耐藥種數2.14種,MRSA耐藥種數高于MSSA(Z=-11.172,P<0.001)。且MRSA的慶大霉素耐藥率高于MSSA(χ2=5.141,P=0.023)。

      2.4耐藥基因攜帶情況 227株金黃色葡萄球菌中,mecA、tetK、tetM、ermA、ermB、ermC、linA耐藥基因的攜帶情況見表2,每株菌平均攜帶耐藥基因1.51個。7種耐藥基因都不攜帶的菌株有51株,共有16株菌最多攜帶4種耐藥基因,最常見的4種耐藥基因攜帶譜為mecA+tetK+ermB+ermC。

      表2 耐藥基因攜帶情況

      Tab.2 Carriage of durg-resistance genes

      耐藥基因菌株數量(n)攜帶率/%mecA10747.1tetK3214.1tetM219.3ermA3214.1ermB3716.3ermC10144.5linA156.6None5124.2

      無菌部位分離的菌株平均攜帶耐藥基因數為1.58個,開放部位分離的菌株平均攜帶耐藥基因數為1.48個。不同部位分離到的菌株耐藥基因數不存在統(tǒng)計學差異(Z=-0.709,P=0.478)。MRSA菌株平均攜帶耐藥基因數為2.15個,MSSA菌株平均攜帶耐藥基因數為0.83個,MRSA攜帶的耐藥基因數要高于MSSA(Z=-8.750,P<0.001)。蘇北地區(qū)菌株平均攜帶耐藥基因數為1.55個,蘇南地區(qū)為1.35個,蘇中地區(qū)為1.80個,蘇中菌株耐藥基因攜帶數要高于蘇南地區(qū)(Z=-2.048,P=0.041)。

      2.5金葡菌MLST分子分型 在227株金葡菌中發(fā)現(xiàn)了60個ST型,其中有29個為新發(fā)現(xiàn)ST型,包含59株菌,占比26.0%。新ST型數據信息已經上傳數據庫并獲得新的ST型編號,分別為ST4842-ST4870。主要ST型分布情況見圖1。

      將所有ST型數據錄入eBurst軟件進行聚類分析,設定群所需最小相同等位基因數為6,取樣自展值設置為1000,結果見圖2。共有31個ST型分別以ST5,ST59,ST398,ST630和ST4495為節(jié)點聚類成5個簇,分別為CC5、CC59、CC398、CC630和C4495,成簇菌株138株,占比61.7%。

      不同標本來源、不同地域的菌株主要ST型分布詳見表3。

      圖1 主要ST型分布Fig.1 Distribution of major STs

      圖2 全部ST型聚類Fig.2 Cluster analysis of all STs

      表3 不同標本來源、不同地域的菌株主要ST型分布

      Tab.3 Distribution of major STs from different isolates and areas

      ST型克隆群樣本來源地區(qū)菌株耐藥開放部位無菌部位蘇北蘇中蘇南MRSAMSSAST59CC5925517310255ST398CC398191179141614ST630CC630114087114ST4863?NA104617212

      *表示新發(fā)現(xiàn)ST型,NA表示未歸入克隆群

      2.6成簇克隆群和金葡菌耐藥特征的相關性 比較5個簇菌株的耐藥種數,平均耐藥基因數,抗生素耐藥率和MRSA檢出率,詳見表4。CC5菌株耐藥種數高于CC59(調整P=0.015)、CC398(調整P<0.001)、CC630(調整P=0.05)、CC4495(調整P=0.007),CC59高于CC398(調整P=0.002),CC630高于CC398(調整P=0.003)。

      CC5耐藥基因攜帶數高于CC59(調整P<0.001)、CC398(調整P<0.001)、CC630(調整P=0.037)、CC4495(調整P<0.001),CC59高于CC398(調整P=0.02),CC630高于CC59(調整P<0.001),C630高于CC4495(調整P=0.042)。

      CC4495菌株左氧氟沙星耐藥率高于CC59(χ2=9.558,P=0.003)。CC5菌株的MRSA檢出率高于CC398(χ2=14.131,P<0.001)、CC630(χ2=11.216,P=0.001),CC59高于CC398(χ2=8.122,P=0.004)。

      表4 不同簇菌株耐藥相關特征比較

      Tab.4 Comparison of drug-resistance characteristics in different clusters

      平均耐藥種數平均耐藥基因數左氧氟沙星耐藥率/%MRSA檢出率/%CC56.38a3.24a42.9ab100aCC594.41bc1.90bde17.1a82.9aCC3982.69c1.11ce41.7ab52.8bCC6304.83b2.31d41.4ab69.0bCC44953.55bc1.18e63.6b81.8ab

      注:耐藥相關特征兩兩比較,同列數字后字母不同表示比較后有統(tǒng)計學差異(P<0.05),字母相同表示比較后無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

      3 討 論

      雖然有研究[8]發(fā)現(xiàn)院內MRSA的檢出率近年來呈現(xiàn)下降的趨勢,但是金葡菌的耐藥形勢仍然不容樂觀,本研究發(fā)現(xiàn)臨床分離的多重耐藥金葡菌比例超過40%,MRSA的檢出率也超過50%,檢出率高于黎巴嫩報道的29.5%[9]和我國深圳地區(qū)的26.2%[10]。本研究中的金葡菌對多種抗生素的耐藥結果與全國多數地區(qū)沈陽[11]、珠海[12]、廣州[13]等地的臨床分離株耐藥率相近,但在江蘇省內的蘇北、蘇中和蘇南地區(qū)分離到的金葡菌菌株在耐藥種數和克林霉素耐藥率方面均存在差異,提示不同地區(qū)抗生素的使用和管理策略可能會對金葡菌耐藥率產生影響。

      本研究中金葡菌mecA和ermC攜帶率較高,均超過40%,與韓玉濤等[14]40.0%的結果相近,但高于賈珉等[15]的21.7%。而tetM、ermA、ermB攜帶率低于王冬梅等人[16]的研究結果,但高于安徽[17]報道的耐紅霉素金葡菌的攜帶率。同時本研究結果提示蘇北、蘇中和蘇南地區(qū)的金葡菌耐藥基因攜帶數和攜帶率不盡相同,因此推測不同地區(qū)金葡菌對抗生素的主要耐藥機制并不相同。本研究還檢測了克林霉素耐藥基因linA,陽性率僅為6.6%,遠低于克林霉素的耐藥率43.6%,推測克林霉素的耐藥以誘導型耐藥為主[18]。

      金葡菌目前在MLST數據庫中的ST型已經超過4 800個,而此次分離的227株金葡菌發(fā)現(xiàn)ST型60個,其中新發(fā)現(xiàn)ST型29個,呈現(xiàn)出較為豐富的種群結構特征。研究[19]發(fā)現(xiàn)ST5和ST239是我國院內分離的金葡菌最常見的ST型,在全國多個城市均有分離,同時也是院內MRSA的主要型別之一[20], 與之不同的是一項新西蘭[21]的研究發(fā)現(xiàn)當地MRSA的主要ST型為ST8、ST93和ST1。而在本研究中所發(fā)現(xiàn)的ST5和ST239均為MRSA,但是MRSA中分布最多的ST型是ST59和ST398,MSSA中分布最多的是ST398和ST4863。而ST59和ST398則多為社區(qū)獲得性MRSA(Community- Associated Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus,CA-MRSA)的主要型別,而荷蘭[22]和德國[23]的研究則認為在北美和歐洲ST398-MRSA是家畜相關MRSA(Livestock-Associated Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus,LA-MRSA),在家畜和家畜養(yǎng)殖人員身上均有分離[24],而在亞洲[25]與豬密切相關的ST型為ST9,但在本次研究中未發(fā)現(xiàn)ST9。 因此,本研究認為臨床分離的金葡菌尤其是MRSA,社區(qū)獲得的比例可能要高于院內獲得的比例,因此導致感染人的比例也會偏高。同時本省不同地區(qū)分離的菌株在耐藥率和耐藥機制方面也存在著較為明顯的差異,因此對于預防控制金葡菌感染,除了院內做好感控措施之外,對CA-MRSA應當予以更多的關注和監(jiān)測。

      利益沖突:無

      引用本文格式:洪捷,曹陽,談忠鳴,等.江蘇地區(qū)金黃色葡萄球菌耐藥及分子分型研究[J].中國人獸共患病學報,2019,35(7):604-609. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.70

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