一株產(chǎn)毒曲霉拮抗細菌的篩選、鑒定及抑菌活性研究

劉端木 吳懌 劉沄 梁志宏

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

曲霉屬（Aspergillusspp.）真菌廣泛存在于土壤、植物性食品和飼料原料中，尤其是糧谷類作物在種植、儲藏和運輸過程中極易被污染［1］，其代謝產(chǎn)生的真菌毒素對人畜健康具有較大威脅。其中最重要的真菌毒素有黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFs）、赭曲霉毒素（Ochratoxin，OTs）、嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、伏馬毒素（Fumonisins，F(xiàn)B）等［2］。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and agriculture organization of the united nations，F(xiàn)AO）估計，世界上約有25%的谷物受到真菌毒素的污染［3］。受真菌污染的飼料不僅營養(yǎng)成分被破壞，同時真菌及其產(chǎn)生的毒素會影響動物健康及生產(chǎn)效率，且能通過食物鏈間接影響人類的健康和安全［4］。

赭曲霉（Aspergillus ochraceus）是赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）的主要產(chǎn)生菌，廣泛污染谷物、豆類、葡萄、咖啡等農(nóng)副產(chǎn)品，可以引起人類和動物的肝臟、腎臟損傷，并有致畸、致突變、致癌和免疫抑制作用［5］。黃曲霉（Aspergillus flavus）可以產(chǎn)生AFs，其中的黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）具致癌性和致畸性，被國際癌癥研究機構(gòu)（International agency for research on cancer，IARC）列為1類致癌物［6］。世界主要國家或地區(qū)的食品監(jiān)管機構(gòu)已經(jīng)制定了一系列針對不同食品中OTA和AFB1的最大允許限值（Maximum permissible limit，MPL）［5，7］，用于保障人類的健康安全，我國規(guī)定谷物及其制品類別中OTA和AFB1的最高限量標準為5 μg/kg 和 20 μg/kg［8］。

目前，防治真菌毒素污染的方法主要有化學(xué)防治法、生物防治法、加強采后貯藏管理等?；瘜W(xué)試劑的使用會使得菌株產(chǎn)生抗性，若使用不當，還會增加毒素的產(chǎn)生［9］。生物防治技術(shù)是減少或完全清除真菌及其毒素污染的最有前途和最有效的方法［10］，其中利用拮抗微生物來抑制原料生產(chǎn)和儲藏過程中真菌的污染，從源頭控制產(chǎn)毒微生物的增殖，是最大程度的減少真菌及毒素危害的有效途徑。目前，已經(jīng)報道的能夠拮抗赭曲霉或黃曲霉的細菌包括亞麻短桿菌（Brevibacterium linens）、表皮短桿菌（Brev. epidermidis）［11］、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）［12］、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）［13-14］、熒光假單胞菌（Pseudomonasfluorescens）［15］等。本研究旨在從土壤和糧食原料中篩選同時拮抗黃曲霉和赭曲霉的細菌，鑒定并確認其抑菌活性，進而利用微生物及其代謝物來抑制產(chǎn)毒曲霉的生長，從而減少毒素的產(chǎn)生，為進一步研究抑菌機制、探索高效抑菌制劑研發(fā)提供材料準備和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：采自北京市懷柔區(qū)長哨營鄉(xiāng)板栗種植園根部土壤；市售赤豆。

供試真菌：赭曲霉AS 3.4412（A. ochraceusAS 3.4412）、黃曲霉 AS 3.870（A. flavusAS 3.870），由本實驗室保存。

培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯（NA）、馬鈴薯葡萄糖（PDA）瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）液體培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨（LB）液體培養(yǎng)基均參照參考文獻［16］進行配制。

引物27F/1492R和Bam-man-1F/Bam-man-1R以及PCR反應(yīng)體系的各種試劑均購自睿博興科生物技術(shù)有限公司；細菌DNA提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 拮抗細菌的分離、純化 細菌分離采用稀釋涂布法［17］。采集5個地點的10份土壤樣品，分別稱取2.0 g樣品于20 mL滅菌生理鹽水中充分震蕩。混合液180 r/min離心20 min取上清液，梯度稀釋為原濃度的10-2、10-3倍，用于篩選環(huán)境細菌。市售赤豆用去離子水沖洗，用75%乙醇浸泡30 s，用無菌雙蒸水清洗1 min。無菌濾紙吸干赤豆表面水分，取5粒加10 mL無菌生理鹽水充分研磨，全部轉(zhuǎn)移至離心管中，再加10 mL無菌生理鹽水，于3 500 r/min離心10 min取上清液，梯度稀釋為原濃度的10-2倍，用于篩選內(nèi)生細菌。

取100 μL稀釋液涂布于NA固體培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)。觀察16 h、24 h、32 h和48 h后的生長狀況（菌落大小、形態(tài)、色澤、邊緣、數(shù)量）。從中挑取表型差異的單菌落，轉(zhuǎn)接至新的NA平板上進行擴大培養(yǎng)。將純化后的菌種轉(zhuǎn)入斜面試管保存。

1.2.2 拮抗細菌的初篩 初篩采用平板對峙法［18］，用打孔器取直徑約為5 mm的赭曲霉、黃曲霉（以新生菌絲為主的菌塊）單獨接種在PDA平板中央。將PDA平板分為4個區(qū)域，接種分離純化培養(yǎng)的細菌于PDA平板距曲霉菌塊2 cm處的3點，另一點不接種細菌作為對照，28℃培養(yǎng)3 d。初步篩選出具有拮抗作用的細菌后，將PDA平板分為兩部分，平板中央點種曲霉菌塊，一部分中央處接種細菌，另一邊作為空白對照，28℃培養(yǎng)3 d，測定曲霉菌菌絲直徑，計算抑制率。每個菌株重復(fù)2次。

r為對照一側(cè)菌落中心到菌落邊緣的距離，r'為處理一側(cè)菌落中心到菌落邊緣的距離。

1.2.3 拮抗細菌的復(fù)篩

1.2.3.1 曲霉孢子懸液的制備 將產(chǎn)毒菌株赭曲霉AS 3.4412和黃曲霉AS 3.870接種到PDA平皿，28℃培養(yǎng)72 h。待孢子形成后，每個平板中加入10 mL含0.05%（V/V）吐溫80的無菌生理鹽水，用多層紗布過濾除去菌絲殘體，充分震蕩后制成孢子懸浮液。用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子濃度為1×107CFU/mL。

1.2.3.2 無菌發(fā)酵上清液制備 挑取在NA培養(yǎng)基上生長的菌株，接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min條件下，振蕩培養(yǎng)48 h。在4℃、10 000 r/min條件下，將發(fā)酵液離心10 min取上清液，上清液于4 500 r/min、4℃下離心40 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾作為上清液實驗材料。

1.2.3.3 牛津杯法復(fù)篩 取100 μL曲霉菌孢子懸液涂布于PDA平板上。將PDA平皿分為4個區(qū)域，每個板上放置4個牛津杯，向其中3個加入100 μL無菌上清液，另一個加入100 μL LB培養(yǎng)基作為對照［19］，28℃恒溫培養(yǎng)2 d，連續(xù)觀察。觀察牛津杯周圍是否有抑菌圈，并用十字測量法測定抑菌圈直徑。每組2個平行。

1.2.4 拮抗細菌的鑒定

1.2.4.1 形態(tài)特征鑒定 將獲得的拮抗菌于LA固體培養(yǎng)基37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，經(jīng)簡單染色和革蘭氏染色，在1 000倍顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.4.2 生理生化特征鑒定 接觸酶試驗、淀粉水解、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗、M.R試驗、糖醇發(fā)酵試驗，均參照東秀珠等《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［20］進行。各處理均進行2次重復(fù)。

1.2.4.3 16S rDNA鑒定 使用細菌DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA。以拮抗菌株基因組作為擴增的模板，用引物正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、 反 向 引 物1492R（5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）， 終 濃度 1 μL/25 μL 反應(yīng)體系（ddH2O 17.3 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、上游引物 1 μL、下游引物 1 μL、 DNA 模 板 1 μL、Taq酶 0.2 μL）。 反 應(yīng) 條 件 ：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次。

取10 μL擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR產(chǎn)物片段大小。PCR產(chǎn)物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。測序序列，登錄NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性分析，利用MEGA 7.0進行序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4.4 枯草芽孢桿菌近緣種群特異PCR鑒定 采用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA。采用枯草芽孢桿菌群解淀粉芽孢桿菌特異性引物［21］：正向引物Bam-man-1F（5'-TCGGTTTCACATCCTTCATC-3'），反向引物Bamman-1R（5'-TTTGTCAGCGTGTCTTCTG-3'），對該菌的β-甘露聚糖酶基因進行PCR反應(yīng)。以拮抗菌株基因組作為擴增的模板，終濃度1 μL/25 μL反應(yīng)體系（ddH2O 17.3 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、上游引物 1 μL、下游引物 1 μL、 DNA 模板 1 μL、Taq酶 0.2 μL）。反應(yīng)條件 ：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性45 s，50℃退火45 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次。取10 μL擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR產(chǎn)物片段大小。

1.2.5 SC-B15抑菌活性物質(zhì)的性質(zhì)研究 經(jīng)溫度、pH、蛋白酶的不同處理后，以抑菌圈直徑反映上清液的抑菌活性，抑菌圈直徑越大，抑菌效果越好。牛津杯的外徑為8 mm，抑菌圈直徑超過8 mm說明有抑菌活性。

1.2.5.1 溫度穩(wěn)定性實驗 分別取上清液1.5 mL于5支2 mL離心管中，在20、40、60、80和100℃溫度條件下水浴處理30 min［19］，恢復(fù)至室溫后，0.22 μm細菌過濾器去除菌體，用牛津杯法檢測抑菌活性，培養(yǎng)2 d后，用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.5.2 pH穩(wěn)定性實驗 取上清液2 mL于6支10 mL離心管中，分別將pH值調(diào)至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，于室溫下放置2 h，0.22 μm細菌過濾器去除菌體，用牛津杯法檢測抑菌活性，培養(yǎng)2 d后，用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.5.3 蛋白酶穩(wěn)定性實驗 分別取上清液2 mL于3支10 mL離心管中，測定其初始pH值。調(diào)節(jié)至對應(yīng)所用蛋白酶的最適pH值后，分別向其中添加木瓜蛋白酶（pH=7.0）、胰蛋白酶（pH=8.0）、胃蛋白酶（pH=2.0），37℃水浴2 h后，再調(diào)pH值至與上清液初始相同。0.22 μm細菌過濾器去除菌體，以同等濃度的酶為對照，用牛津杯法檢測抑菌活性，培養(yǎng)2 d后，用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.6 拮抗菌株生防機理的探究

1.2.6.1 利用顯微觀測拮抗細菌對曲霉菌體生長的影響 參考1.2.2步驟，從曲霉受到抑制的一側(cè)的菌絲取樣，以另一側(cè)正常生長的菌絲作為空白對照，使用棉藍試劑染色并在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.2.6.2 上清液對曲霉孢子萌發(fā)的影響 將赭曲霉AS 3.4412和黃曲霉AS 3.870的孢子濃度調(diào)整為1×107CFU/mL，按1%的接種量，分別與等體積的無菌上清液混合培養(yǎng)于PDB液體培養(yǎng)基中［13］（以加入LB培養(yǎng)基為對照），置28℃搖床培養(yǎng)，18 h后觀察曲霉孢子萌發(fā)情況。

1.2.7 SC-B15菌株鑒定方法 將測序獲得的16S rDNA序列提交至NCBI中，在GenBank中通過BLAST進行序列比對。根據(jù)同源性相似度差異，選取同源性較高的聚類菌株，使用MEGA 7.0軟件通過Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，與數(shù)據(jù)庫中登錄的近源菌株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行分析，比較遺傳進化距離。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理方法 實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差表示，用軟件SPSS 19.0中的配對樣本t檢驗分析比較處理組間的差異，在α=0.05水平下檢驗其差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離純化

經(jīng)涂布培養(yǎng)，共從5個采集地點的10份種植園土壤和赤豆樣品中，篩選出58株能在NA培養(yǎng)基上生長良好且外表性狀不同的細菌菌株，其中有43株源于種植園土壤，15株源于赤豆樣品，屬于赤豆內(nèi)生菌。

2.2 拮抗細菌初篩結(jié)果

經(jīng)平板對峙法篩選，源于土壤的2株環(huán)境細菌（SC-B15、SC-C25）和源于赤豆的1株內(nèi)生細菌（O11）對赭曲霉AS 3.4412均有抑制作用，其中菌株SCB15同時對黃曲霉AS 3.870有抑制作用。SC-B15對赭曲霉和黃曲霉的抑菌率分別為（47.30±13.17）%、（52.44±2.78）%（表 1）。

表1 初篩菌株抑制指示霉菌生長的結(jié)果（抑菌率%）

2.3 拮抗細菌復(fù)篩結(jié)果

細菌發(fā)酵液經(jīng)離心、超濾，去除菌體后，進行牛津杯法抑菌實驗分析。結(jié)果如表2所示：SC-B15發(fā)酵上清液對赭曲霉AS 3.4412和黃曲霉AS 3.870的抑菌圈直徑分別為15.03±2.66 mm和13.95±2.62 mm，表明細菌SC-B15的代謝產(chǎn)物能顯著抑制赭曲霉和黃曲霉的生長。

表2 上清液抑制指示霉菌生長的結(jié)果（抑菌圈mm）

2.4 拮抗菌株鑒定結(jié)果

2.4.1 形態(tài)特征 SC-B15菌株在NA固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h后，如圖1所示，菌落呈圓形，凸起，表面褶皺，邊緣不規(guī)則，表面無光澤，灰白色，不透明，直徑3-4 mm，黏稠。光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體呈短桿狀，革蘭染色均勻且為陽性，大小均勻，芽孢中生，不膨大（圖2）。

圖1 SC-B15在NA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后的菌落形態(tài)

圖2 SC-B15的顯微形態(tài)觀察結(jié)果（×1000）

2.4.2 生理生化特性 結(jié)果顯示，菌株SC-B15接觸酶反應(yīng)、淀粉水解、葡萄糖、纖維二糖、D-山梨醇、乳糖、麥芽糖、甘露醇、肌醇發(fā)酵均為陽性，甲基紅試驗為陰性，該菌株符合芽孢桿菌（Bacillussp.）的基本理化特性，與解淀粉芽孢桿菌有極高的相似性。

2.4.3 16S rDNA序列同源性鑒定 采用細菌通用引物27F/1492R對SC-B15進行基因PCR擴增，得到大小1 430 bp片段。在NCBI數(shù)據(jù)庫中與已知序列進行BLAST比對，結(jié)果如圖3顯示，SC-B15與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）（登錄號：KC887505.1）的16S rDNA同源性達到99%以上。使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進一步證明拮抗菌SC-B15屬于解淀粉芽孢桿菌。

2.4.4 枯草芽孢桿菌近緣種群特異PCR鑒定結(jié)果 采用枯草芽孢桿菌群特異性引物Bam-man-1F/Bam-man-1R對SC-B15的β-甘露聚糖酶基因進行PCR反應(yīng)［21］，PCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小約1 300 bp片段（圖4），對應(yīng)解淀粉芽孢桿菌PCR引物大小為1 275 bp。出現(xiàn)的單一條帶與預(yù)期產(chǎn)物分子量一致，再一次證實SC-B15為解淀粉芽孢桿菌。

2.5 解淀粉芽孢桿菌SC-B15抑菌活性物質(zhì)的性質(zhì)研究

圖3 SC-B15的系統(tǒng)進化樹

圖4 枯草芽孢桿菌群特異PCR產(chǎn)物電泳分析

2.5.1 溫度穩(wěn)定性 上清液經(jīng)不同溫度處理后，對赭曲霉的抑菌活性變化很小，抑菌圈直徑均在19.4-21.2 mm之間，仍保持著較強的抑菌活性；對黃曲霉抑菌活性在20-40℃范圍內(nèi)較強，抑菌圈直徑均在18.9-21.0 mm之間，60、80、100℃處理后抑菌活性減小，抑菌圈直徑均在8.5-9.3 mm（圖5）。

圖5 解淀粉芽孢桿菌SC-B15對曲霉菌的溫度抑菌穩(wěn)定性

2.5.2 pH穩(wěn)定性 上清液經(jīng)不同pH值處理后，對赭曲霉的抑菌活性在pH為2、4和12的條件下減弱許多，抑菌圈直徑平均為8.3-8.9 mm，在pH 6-10的范圍內(nèi)抑菌活性較強，抑菌圈直徑平均為17.4-19.5 mm，pH=10時對赭曲霉抑菌活性最高；對黃曲霉的抑菌活性在pH為2、4和12的條件下同樣減弱許多，抑菌圈直徑平均為8.0 mm，在pH 6-10的范圍內(nèi)抑菌活性較強，抑菌圈直徑平均為16.0-24.5 mm，pH=8時對黃曲霉抑菌活性最高（圖6）。

2.5.3 蛋白酶穩(wěn)定性 上清液分別用胃蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶處理后發(fā)現(xiàn)（圖7），胃蛋白酶處理使得對赭曲霉的抑菌活性下降，抑菌圈平均直徑為8.5 mm，與未處理組對照相比，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶處理對赭曲霉抑菌效果無影響，抑菌圈直徑平均為19.8 mm和19.5 mm；胃蛋白酶處理同樣使

圖6 解淀粉芽孢桿菌SC-B15對曲霉菌的pH抑菌穩(wěn)定性

得對黃曲霉的抑菌活性下降，抑菌圈平均直徑為8.0 mm，與未處理組對照相比，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶處理對黃曲霉抑菌效果有一定影響，但仍有較強的抑菌活性，抑菌圈直徑平均為18.5 mm和12.0 mm。

2.6 解淀粉芽孢桿菌SC-B15生防機理研究

2.6.1 解淀粉芽孢桿菌SC-B15菌株對曲霉菌體生長的影響 如圖8所示，與對照組對比，光學(xué)顯微鏡下受到解淀粉芽孢桿菌SC-B15拮抗作用的赭霉菌絲彎曲、變形，出現(xiàn)大量空泡，內(nèi)部原生質(zhì)體分布不均。黃曲霉菌絲有部分腫大、凸起、變形現(xiàn)象。

2.6.2 上清液對孢子萌發(fā)的影響 如圖9-10所示，按1%接種量接種曲霉菌孢子，與對照組相比，實驗組的孢子萌發(fā)較少，說明SC-B15對曲霉孢子萌發(fā)有一定的抑制作用。

3 討論

芽孢桿菌（Bacillusspp.）作為自然界中具有抗逆優(yōu)勢的微生物菌群，大多為非致病性，并且很多種類都具有抑制真菌生長的能力［22］，包括枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）、地衣芽孢桿菌（B. lichniformis）及解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）等［23-26］。解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等10個有效發(fā)表種［27］被稱為枯草芽孢桿菌近緣種群，該種群表型相近，大多能夠產(chǎn)生較豐富的功能酶和功能蛋白［22］，本文結(jié)合傳統(tǒng)的16s rDNA結(jié)合β-甘露聚糖酶基的聚類分析進行鑒定，能夠更加確證該菌株的分類地位，相比單一的分子鑒定方法，具有更多的明確性。

圖7 解淀粉芽孢桿菌SC-B15對曲霉菌的蛋白酶抑菌穩(wěn)定性

圖8 受到解淀粉芽孢桿菌SC-B15拮抗作用的曲霉菌菌絲變化

圖9 SC-B15對赭曲霉AS 3.4412孢子萌發(fā)影響

圖10 SC-B15對黃曲霉AS 3.870孢子萌發(fā)影響

解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）可以拮抗多數(shù)真菌的生長［28］，已得到廣泛的研究，但目前已知解淀粉芽孢桿菌多為拮抗單一真菌生長，Han等［29］從黃瓜根際土壤中分離得到的解淀粉芽孢桿菌B1408可減輕黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum）誘導(dǎo)的危害。司世飛等［30］發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌B11可拮抗煙草赤星病菌（Alternaria alternata）。Siahmoshteh等［31］發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌UTB2能夠抑制寄生曲霉（A. parasiticus）的生長。本研究中，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌SC-B15對赭曲霉和黃曲霉的生長均具有較強的抑菌作用，并能一定程度上抑制霉菌孢子的萌發(fā)，霉菌孢子萌發(fā)是美軍擴散和繁殖的主要途徑，因此該菌株具有較好的應(yīng)用價值預(yù)期。

本研究發(fā)現(xiàn)拮抗作用主要是解淀粉芽孢桿菌SC-B15發(fā)酵上清液產(chǎn)生的，因此對其作用溫度、pH、蛋白酶耐受性等因素進行研究。該抑菌物質(zhì)與其他報道的結(jié)果接近，大部分在中性及堿性環(huán)境中穩(wěn)定，例如，陳成［32］獲得的解淀粉芽孢桿菌HN-06的抗真菌物質(zhì)其抑菌活性高的pH范圍 6-10，陳楠楠等［33］報道的解淀粉芽孢桿菌SSY2的抗菌物質(zhì)可在pH 6-8的環(huán)境中保持穩(wěn)定。本實驗的抑菌物質(zhì)在100℃處理30 min后對赭曲霉還有一定的抑菌作用，可能其抑菌主要成分也包含脂肽類物質(zhì)，孫力軍等［34］也有類似的報道，從豆豉中分離出的枯草芽孢桿菌（B.subtilis）NT-6的發(fā)酵液抗菌提取物的主要成分是抗菌脂肽類物質(zhì)iturin、fengycin、surfactin同系物的混合物，在121℃條件下加熱30 min活性不喪失，具有良好的耐熱性；在對黃曲霉的抑菌實驗中，抑菌物質(zhì)對溫度敏感，可能上清液中存在某種抑菌蛋白，對于抑菌蛋白的研究，劉洋等［35］報道內(nèi)生芽孢桿菌1A通過分泌蛋白酶和纖維素酶，降解核桃根腐病菌等幾種林木病原菌的細胞壁中蛋白質(zhì)和纖維素，破壞其菌絲使得真菌的生長受到抑制。本實驗的抑菌物質(zhì)對胃蛋白酶敏感，對胰蛋白酶和木瓜蛋白酶不敏感，可能是由于胃蛋白酶具有一定的氨基酸序列選擇特異性，優(yōu)先斷裂由芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）或亮氨酸形成的肽鍵［36］，而胰蛋白酶能選擇性的水解蛋白質(zhì)中賴氨酸或精氨酸的羧基端肽鍵［37］，木瓜蛋白酶可水解精氨酸和賴氨酸的羧基端［38］，所以解淀粉芽孢桿菌SC-B15的抑菌蛋白的活性位點可能含有芳香族氨基酸或亮氨酸，無精氨酸和賴氨酸。對于解淀粉芽孢桿菌SC-B15上清液中脂肽和抑菌蛋白的分離純化，還有待進一步研究。

4 結(jié)論

從種植園土壤中篩選出一株生防菌株解淀粉芽孢桿菌SC-B15，能同時抑制赭曲霉和黃曲霉的生長，其代謝產(chǎn)物上清液有較強的抑制效果，能夠影響菌絲形態(tài)和孢子萌發(fā)。抑菌物質(zhì)在中性及堿性條件下穩(wěn)定，拮抗赭曲霉熱穩(wěn)定性強，對胃蛋白酶敏感，對胰蛋白酶和木瓜蛋白酶不敏感。