郭靜靜 郭磊磊 趙云岫 戴亦軍

（1. 南京師范大學(xué)中北學(xué)院，南京 210023；2. 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江蘇省微生物與功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇省微生物資源產(chǎn)業(yè)化工程技術(shù)研究中心，南京 210023）

微生物催化的腈類轉(zhuǎn)化有兩條途徑：一條是在腈水解酶（Nitrilase，EC3.5.5.1）的催化下由腈類直接產(chǎn)生羧酸，例如Vaughan等［1］報(bào)道的Nocardia rhodochrousLL100-21可直接將3-氰基吡啶（3-CP）代謝為煙酸，但是在這一過程中腈水解酶的活性需要誘導(dǎo)。另一條代謝途徑是由腈水合酶（NHase，EC4.2.1.84）和酰胺酶（Amidase，EC3.5.1.4）聯(lián)合作用，將腈類先轉(zhuǎn)化為酰胺，然后再由酰胺酶催化產(chǎn)生羧酸。目前，已報(bào)道的微生物中含腈水合酶和酰胺酶的菌株很多，例如Rhodococcus rhodococcusJ1、Bacillussp. BR449、Brevibacterium imperialis、R.eythropolis等［2-4］，但在固氮菌中同時(shí)具有腈水合酶和酰胺酶的卻很少見［5］。

腈水合酶和酰胺酶在生物體內(nèi)是普遍存在的一類酶類，屬于腈水解酶超家族中的一員［6］，其中酰胺酶在化學(xué)品、生理藥物、農(nóng)藥等的合成及污染廢水的處理等方面均有廣泛的應(yīng)用。根據(jù)催化活性和底物特異性的不同，酰胺酶可分為很多類，有脂肪族酰胺酶、芳香族酰胺酶、α-氨基酸酰胺酶等，煙酰胺酶（NAMase）屬于芳香族酰胺酶。酰胺酶的催化反應(yīng)一般分為2類：水解反應(yīng)和?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，煙酰胺轉(zhuǎn)化成煙酸就是典型的水解反應(yīng)，產(chǎn)物煙酸對(duì)維持微生物細(xì)胞中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用［7］。在原核生物體內(nèi)，煙酰胺在NAMase的催化下產(chǎn)生的煙酸可直接進(jìn)入NAD的生理代謝途徑［8］，由于哺乳動(dòng)物體內(nèi)缺乏NAMase，使NAD的生物合成途徑較原核生物復(fù)雜［9-10］。NAMase除了能夠調(diào)控NAD的生物合成之外，對(duì)于延長(zhǎng)酵母，黑腹果蠅的壽命也具有一定的作用［11-13］。

草木樨劍菌Ensifer meliloti1021是一類固氮菌，且全基因組序列已公布，基于E. meliloti1021靜息細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，探索了3-CP的代謝途徑并對(duì)這一途徑中酰胺酶進(jìn)行了詳細(xì)研究，測(cè)定了NAMase相應(yīng)的酶學(xué)參數(shù)，同時(shí)NAMase轉(zhuǎn)化吡嗪酰胺的功能為結(jié)核病的治療提供了新的菌株選擇。3-CP對(duì)煙酸產(chǎn)量的抑制為進(jìn)一步研究微生物細(xì)胞內(nèi)酶的調(diào)控提供了參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

E. meliloti1021，表達(dá)質(zhì)粒pET-28a（+）和菌株E.coliRosetta（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室保存。DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海生工），Ni-NTA Fast Start Kit試劑盒（Sigma公司）。3-CP、煙酰胺、煙酸、苯乙酰胺、吡嗪酰胺、吡嗪酸、丙烯酰胺和乙酰胺（Sigma公司，試劑純度在98%以上）；色譜級(jí)乙腈（美國(guó)Tedia公司）；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1E. meliloti1021靜息轉(zhuǎn)化3-CP和煙酰胺 挑取-80℃低溫冰箱中保藏的E. meliloti1021，在LB固體平板上劃線，30℃倒置培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落。挑取單菌落接種到含3 mL液體LB培養(yǎng)基（含0.1 mmol/L CoCl2）的試管中，30℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。按1%的接種量接種到含有200 mL LB培養(yǎng)基（含CoCl2）的三角瓶中，30℃，200 r/min培養(yǎng)18 h。將培養(yǎng)好的菌液（以O(shè)D600=5.0為標(biāo)準(zhǔn)）收集到50 mL離心管中，4℃，8 000 r/min離心5 min，棄去上清，用PBS清洗菌體二次，分別加入5 mL 200 mg/L和1 g/L的3-CP及煙酰胺底物，渦旋振蕩混勻，取1 mL做為初始樣，每種底物濃度做3個(gè)平行，設(shè)置底物對(duì)照（底物+轉(zhuǎn)化液）和菌體對(duì)照（菌體+轉(zhuǎn)化液），分別在1 h、3 h、5 h、7 h取樣，每次取樣前需補(bǔ)足轉(zhuǎn)化過程中蒸發(fā)掉的水分。取出的樣13 200 r/min離心10 min，上清液用乙腈（終止反應(yīng)）稀釋。樣品用0.22 μm的濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。流動(dòng)相為乙腈溶液（V（乙腈）∶V（水）=30∶70），流速為1 mL/min，紫外線檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

1.2.2nam克隆及其蛋白的表達(dá)與純化 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索“E. meliloti1021 nicotinamidase”蛋白，下載編碼NAMase的基因序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物并由上海生工生物有限公司合成，上游引物5'-ACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATT CATGGCCGATGCGGCTCGGC-3'，下游引物5'-ATCTC AGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTAGATCAGCC GAACGCCG-3'（下劃線處堿基為酶切位點(diǎn)序列，酶切位點(diǎn)前序列為pET-28a載體同源序列），PCR擴(kuò)增程序 95℃ 5 min，95℃ 5 s，60℃ 40 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)?？寺〉哪康幕蚱斡肊coRI、XhoI雙酶切后，用Clone ExpressⅡ重組克隆試劑盒將目的片段導(dǎo)入pET-28a質(zhì)粒。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)報(bào)道的方法化學(xué)轉(zhuǎn)化至E. coliRosetta（DE3）感受態(tài)中［14］。菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，然后送南京思普金生物有限公司測(cè)序。

挑取測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆接種到3 mL含Kan和Chl的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h。按2%的接種量接種到含Kan和Chl抗性的100 mL LB 培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min，培養(yǎng)至 OD600= 0.6-0.7，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG溶液，30℃誘導(dǎo)6 h。4℃，8 000 r/min離心5 min，收集菌體，用PBS洗去殘留的培養(yǎng)基。Ni-NTA Fast Start Kit試劑盒純化蛋白，對(duì)純化過程中收集到的流出液進(jìn)行SDSPAGE分析。純化的蛋白用Bradford試劑測(cè)定其濃度。

1.2.3 酶學(xué)活性分析E. meliloti1021 NAMase活力通過HPLC分析，以煙酰胺為底物測(cè)定生成的煙酸的含量。定義在37℃條件下，1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1 μmol底物所需的酶量為1個(gè)NAMase活力單位，用U表示。

1.2.3.1 pH對(duì)NAMase活性的影響 配制pH分別為4、5、6、7、8、9、10的200 mg/L煙酰胺轉(zhuǎn)化液，然后測(cè)定在不同pH轉(zhuǎn)化液中NAMase的活性，定義pH=7時(shí)的相對(duì)酶活為100%。反應(yīng)體系998 μL轉(zhuǎn)化液加入2 μL純化的NAMase，于37℃恒溫孵育器上800 r/min孵育5 min，加入10%的三氯乙酸終止反應(yīng)。

1.2.3.2 NAMase的pH穩(wěn)定性 在PCR管中加入8 μL 純化的 NAMase和 92 μL pH 分別為 4、5、6、7、8、9、10緩沖液，于4℃放置12 h，定義pH=7條件下放置的酶的相對(duì)酶活為100%。反應(yīng)體系975 μL轉(zhuǎn)化液，加入25 μL不同pH條件下處理的酶液。

1.2.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)NAMase活性的影響 轉(zhuǎn)化液底物為pH=7的200 mg/L 煙酰胺，反應(yīng)體系998 μL轉(zhuǎn)化液加入2 μL純化的NAMase，分別在20，30，40，50，60，70℃反應(yīng)5 min，定義30℃反應(yīng)時(shí)的相對(duì)酶活為100%。

1.2.3.4 NAMase的熱穩(wěn)定性 在PCR管中加入30 μL純化的NAMase，分別置于20，30，40，50，60，70，80℃的水浴鍋中孵育3 h，定義30℃條件下孵育的相對(duì)酶活為100%。998 μL的反應(yīng)液加入上述不同溫度條件下孵育的酶液2 μL進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.3.5 金屬離子對(duì)NAMase活性的影響 反應(yīng)體系為988 μL的轉(zhuǎn)化液加入2 μL NAMase，再分別加入不同金屬離子溶液，至金屬離子溶液的終濃度為2 mmol/L，37℃恒溫孵育器上800 r/min反應(yīng)5 min，以不加金屬離子的相對(duì)酶活為100%。

1.2.3.6 有機(jī)溶劑對(duì)NAMase活性的影響 反應(yīng)體系為978 μL的轉(zhuǎn)化液加入2 μL NAMase，再分別加入不同有機(jī)溶液，至有機(jī)溶液的終濃度為2%（質(zhì)量體積比），37℃恒溫孵育器上800 r/min反應(yīng)5 min，定義不加有機(jī)溶劑的相對(duì)酶活為100%。

1.2.3.7 底物特異性及催化動(dòng)力學(xué)分析 分別配制不同的酰胺類底物包括煙酰胺、吡嗪酰胺、苯甲酰胺、丙烯酰胺、苯乙酰胺和甲酰胺，PBS溶解，濃度為200 mg/L。反應(yīng)體系為998 μL不同的酰胺底物加入2 μL NAMase，37℃恒溫孵育器上800 r/min反應(yīng)5 min。在煙酰胺濃度為0.2-4 g/L下測(cè)定NAMase動(dòng)力學(xué)，Vmax及Km根據(jù)米氏方程推斷。

1.2.4 野生菌株及過表達(dá)菌株的生物轉(zhuǎn)化E.meliloti1021野生菌株在含1 g/L 3-CP LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，以O(shè)D600=5收集菌體；構(gòu)建的含NAMase的E.coli在加入誘導(dǎo)劑的同時(shí)，加入終濃度為1 g/L 3-CP，誘導(dǎo)6 h后以O(shè)D600=3.5收集菌體；分別以1 g/L 煙酰胺為底物。以誘導(dǎo)時(shí)不加3-CP的菌體為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各作3個(gè)平行。另外，做一組純化的NAMase轉(zhuǎn)化1 g/L煙酰胺，同時(shí)在轉(zhuǎn)化液中加入終濃度1 g/L 3-CP。

1.2.5 3-CP對(duì)NAMase的調(diào)控機(jī)制研究 將E.meliloti1021單菌落接種到20 mL液體LB培養(yǎng)基中，30℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，按1%的接種量分別轉(zhuǎn)接到含終濃度為1 g/L 3-CP的LB（實(shí)驗(yàn)組）和普通LB（對(duì)照組）中，培養(yǎng)18 h。收集菌液，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以16S rRNA基因做內(nèi)參基因，反應(yīng)程序?yàn)閮刹椒〝U(kuò)增，第一步：預(yù)變性，循環(huán)數(shù)為1，95℃ 30 s。第二步：PCR反應(yīng)，循環(huán)數(shù)40，95℃ 5 s，60℃ 30 s。溶解階段：循環(huán)數(shù) 1，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。

1.2.6 NAMase固定化研究 稱取海藻酸鈉0.2 g于50 mL燒杯中，加入20 mL無菌水，用微波爐緩慢加熱溶解，靜止冷卻。將清洗好的E.coliRosetta過表達(dá)菌株與海藻酸鈉溶液按照1∶2的體積混勻，用注射器制備顆粒于提前配制的2% CaCl2溶液中固定1 h。用放有尼龍膜的漏斗過濾除去CaCl2溶液，無菌水清洗顆粒兩次，制備的包埋菌體可放于4℃冰箱儲(chǔ)存。純化后的NAMase按上述條件進(jìn)行固定化。

2 結(jié)果

2.1 E. meliloti 1021靜息轉(zhuǎn)化3-CP和煙酰胺

圖1-A1顯示以200 mg/L 3-CP為底物時(shí)終產(chǎn)物是煙酸，在3 h時(shí)煙酸的產(chǎn)量為0.29 mmol/L，轉(zhuǎn)化率為94.2%；以1 g/L 3-CP為底物時(shí)只能產(chǎn)生煙酰胺，到12 h時(shí)還無煙酸保留峰的出現(xiàn)（圖1-A2）。E.meliloti1021靜息細(xì)胞分別以200 mg/L和1 g/L煙酰胺為底物時(shí)，均出現(xiàn)了煙酸的保留峰，其中以200 mg/L煙酰胺為底物時(shí)3 h煙酸的產(chǎn)量為0.47 mmol/L，轉(zhuǎn)化率為47.5%（圖1-B1）；以1 g/L煙酰胺為底物時(shí)3 h煙酸的產(chǎn)量為0.36 mmol/L，轉(zhuǎn)化率為14%，高濃度的煙酰胺也會(huì)對(duì)酰胺酶產(chǎn)生一定的抑制作用。

圖1 E. meliloti 1021靜息轉(zhuǎn)化3-CP和煙酰胺

2.2 nam克隆及其蛋白的表達(dá)與純化

以E. meliloti1021基因組DNA為模板，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增獲得nam序列，瓊脂糖凝膠電泳顯示目的片段長(zhǎng)約636 bp（圖2），導(dǎo)入EcoRI、XhoI雙酶切的pET-28a載體，然后轉(zhuǎn)入E.coliRosetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，陽(yáng)性克隆片段大小符合預(yù)期。

圖2 PCR擴(kuò)增nam基因的電泳結(jié)果

圖3 NAMase的SDS-PAGE圖

由nam編 碼 的NAMase在30℃，0.2 mmol/L IPTG的條件下，在E.coliRosetta-pET28a中表達(dá)情況良好，從圖3中可以看出E.coliRosetta- pET28a空載中沒有目的條帶，說明pET-28a在E.coliRosetta沒有目的蛋白表達(dá)。SDS-PAGE顯示NAMase蛋白分子量約22.6 kD，Bradford法測(cè)定蛋白濃度為1.13 mg/mL。

2.3 NAMase酶學(xué)特性

pH和溫度對(duì)NAMase的影響：圖4-A顯示在pH7-8時(shí)，酶的穩(wěn)定性最好；該酶的最適pH是7，在pH小于6和大于8的條件下，酶的活性會(huì)迅速下降（圖4-B）。在30-70℃之間NAMase對(duì)底物煙酰胺的活性最高，該酶在30-50℃之間孵育2 h后的轉(zhuǎn)化活性仍在97.1%以上（圖4-D）。

金屬離子和有機(jī)溶劑對(duì)NAMase的影響：從圖4-E可知Fe對(duì)NAMase活性有抑制，其中Fe3+抑制率為5.2%，作用不明顯，F(xiàn)e2+抑制率為13.1%；Ag2+對(duì)NAMase抑制作用更明顯，高達(dá)72.2%，而Mg2+（98.3%）、Zn2+（97.5%）和 Co2+（102.2%）對(duì)該酶活性影響不大。圖4-F顯示異戊醇對(duì)NAMase活性的抑制率最大，達(dá)到98.4%，三氯甲烷抑制作用為38.1%，丙酮（119.5%）、二氯甲烷（125.1%）及乙酸乙酯（120.5%）對(duì)NAMase的活性有促進(jìn)作用。

圖4 NAMase酶學(xué)性質(zhì)分析

底物特異性及動(dòng)力學(xué)參數(shù)：E. meliloti1021 NAMase能將煙酰胺和吡嗪酰胺分別轉(zhuǎn)化為煙酸和吡嗪酸，對(duì)上文提到的其他幾種酰胺底物均無代謝活性（表1）。對(duì)純化后的NAMase測(cè)定相關(guān)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，Kcat / Km為0.42 mmol/L/s，Km為2.28 mmol/L，Vmax為 142.86 U/mg。

表1 NAMase底物特異性

2.4 野生菌株及過表達(dá)菌株的轉(zhuǎn)化

E. meliloti1021在加入3-CP的LB中培養(yǎng)時(shí)，靜息轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的煙酸0.15 mg/L（圖5-A1），用普通LB中培養(yǎng)的E. meliloti1021靜息轉(zhuǎn)化，煙酸產(chǎn)量為0.45 mg/L（圖5-A2），3-CP對(duì)NAMase活性抑制率達(dá)到了66.7%。圖5-B1顯示E.coliRosetta-NAMase過表達(dá)菌株誘導(dǎo)時(shí)加入3-CP，收集菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其煙酸的產(chǎn)量為0.14 mg/L，而誘導(dǎo)時(shí)不加3-CP，E.coliRosetta-NAMase過表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化1 g/L煙酰胺產(chǎn)生1.35 mg/L煙酸（圖5-B2），3-CP對(duì)E.coliRosetta中過表達(dá)的NAMase活性抑制率達(dá)到了89.6%。純化的NAMase在轉(zhuǎn)化煙酰胺的過程中，3-CP不影響煙酸的產(chǎn)量。從圖6 SDS-PAGE的泳道2和6可知誘導(dǎo)時(shí)3-CP對(duì)NAMase可溶性蛋白表達(dá)影響不大。

圖5 不同條件轉(zhuǎn)化1g/L煙酰胺

圖6 不同條件下的 NAMase的SDS-PAGE分析

2.5 3-CP對(duì)NAMase轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

提取的實(shí)驗(yàn)組菌體中的RNA濃度為81.3 ng/μL，OD260/ OD280=2.04；對(duì)照組菌體中的RNA濃度為103.2 ng/μL，OD260/OD280=2.07；從轉(zhuǎn)錄水平分析 3-CP對(duì)NAMase表達(dá)量的影響結(jié)果如下：把細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)未加3-CP對(duì)照組NAMase的表達(dá)量定義為1，培養(yǎng)時(shí)加入3-CP的實(shí)驗(yàn)組NAMase表達(dá)量為1.18。

2.6 NAMase固定化對(duì)酶活的影響

用最適包埋條件（2%海藻酸鈉和2% CaCl2）對(duì)過表達(dá)菌株及純化后的蛋白分別進(jìn)行包埋，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包埋的純化后的酶活只有純酶酶活的1/3，但是固定化的在E.coliRosetta中過表達(dá)的NAMase（轉(zhuǎn)化率為94%）與自由細(xì)胞（轉(zhuǎn)化率為95.1%）相比活性并未下降。

3 討論

E. meliloti1021靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化200 mg/L 3-CP終產(chǎn)物是羧酸，以煙酰胺為底物時(shí)也能產(chǎn)生煙酸。在這一代謝過程中可能存在腈水解酶或腈水合酶和酰胺酶，進(jìn)一步查找E.meliloti1021的全基因組（NC_003047.1）發(fā)現(xiàn)沒有編碼腈水解酶的基因。E.meliloti1021催化1 g/L 3-CP產(chǎn)生煙酰胺，沒有煙酸產(chǎn)生，在這一過程推測(cè)3-CP會(huì)抑制NAMase的活性，不同濃度的煙酰胺底物其轉(zhuǎn)化率不同，煙酰胺對(duì)煙酸的產(chǎn)生也具有抑制作用。有研究稱3-CP作為底物時(shí)在轉(zhuǎn)化的過程中會(huì)出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象，酰胺水解酶也會(huì)被大量的煙酰胺類似物抑制，其中3-CP的抑制常數(shù)為2.2 μmol/L［15］。野生菌株和過表達(dá)菌株在培養(yǎng)及誘導(dǎo)時(shí)加3-CP的對(duì)比結(jié)果顯示3-CP會(huì)抑制煙酸的產(chǎn)量，在轉(zhuǎn)錄水平及純化的NAMase在轉(zhuǎn)化煙酰胺時(shí)不受3-CP的干擾，推測(cè)3-CP在轉(zhuǎn)化的過程中并非是底物抑制效應(yīng)。

克隆并異源表達(dá)了E. meliloti1021 NAMase的基因，誘導(dǎo)后分離純化NAMase 研究其酶學(xué)性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在pH=7時(shí)活性最高。該酶在30-70℃之間酶活均維持在很高的活性，與Oceanobacillus iheyensisHTE831 酰胺酶（55℃以上，酶活大幅度下降）及一些最適溫度在30-40℃的酰胺酶相比在高溫下更具有優(yōu)勢(shì)［16-18］。NAMase是一類金屬離子依賴性的酶，大部分這類酶的活性中心含有Zn2+［7，10］，有研究表明Fe2+可增加NAMase的活性［19］，本實(shí)驗(yàn)Fe2+會(huì)輕微抑制E. meliloti1021 NAMase的活性，抑制率為13%。底物特異性與Mycobacterium tuberculosis中NAMase相似［20］，這與酶本身的活性位點(diǎn)殘基有關(guān)［16］。目前報(bào)道的吡嗪酰胺酶大都來自于M.tuberculosis［22-24］，E. meliloti1021 NAMase 轉(zhuǎn)化吡嗪酰胺的活性比Zhang等［20］研究中吡嗪酰胺酶的活性（81.9 U/mg）高1.8倍，為結(jié)核病治療提供了新的目標(biāo)菌株選擇。固定化的E.coli過表達(dá)菌株對(duì)煙酰胺具有很高的活性，實(shí)現(xiàn)了酶反復(fù)利用的可能。

4 結(jié)論

從E. meliloti1021中克隆了長(zhǎng)636 bp的NAMase基因，編碼的蛋白分子量為22.6 kD，PI為5.5。利用親和層析柱純化異源表達(dá)的NAMase然后測(cè)定酶活，該酶的最適pH為7，30-70℃之間NAMase對(duì)底物煙酰胺的活性最高，在30-50℃之間孵育2 h后NAMase活性仍保持在97.1%以上，Ag2+和異戊醇會(huì)抑制NAMase的活性。NAMase不僅能轉(zhuǎn)化煙酰胺，對(duì)吡嗪酰胺也具有很高的活性。高濃度3-CP和煙酰胺對(duì)E. meliloti1021野生菌株代謝酰胺有抑制作用，固定化的E.coliNAMase過表達(dá)菌株對(duì)煙酰胺轉(zhuǎn)化率達(dá)到94%。