羅 磊 張冰潔 韋倩倩 樊金玲 馬麗蘋 關(guān)寧寧 朱文學(xué)

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 河南省農(nóng)產(chǎn)品干燥裝備工程技術(shù)研究中心 河南洛陽 471023）

機(jī)體在生理代謝過程中會(huì)產(chǎn)生自由基，當(dāng)自由基產(chǎn)生過多或清除過慢時(shí)，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，自由基作用于大分子物質(zhì)，生成大量有害物質(zhì)，影響細(xì)胞正常生理功能[1]。此外，研究表明，自由基與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，如心腦血管疾病、糖尿病、肝病、炎癥、癌癥、衰老等[2-4]。植物黃酮廣泛分布于自然界，具有抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、抗炎免疫及抗衰老等功效，被認(rèn)為是具有巨大開發(fā)前景的天然抗氧化劑[5]。

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）為食藥兼用植物，具有清熱解毒，保肝利膽，抗菌消炎等功效[6-7]，近幾年報(bào)道金銀花提取液具有清除自由基及抗氧化的作用[8]。目前，金銀花中的黃酮類化合物已成為研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在金銀花黃酮的抗氧化及抗炎功效方面進(jìn)行了大量的研究。劉昌平[9]通過豬油體系和亞油酸體系進(jìn)行檢測(cè)，表明金銀花黃酮具有顯著的抗氧化活性。沈玲玲等[10]研究證明金銀花黃酮對(duì)·OH自由基具有明顯的清除作用，清除率高達(dá)92.22%。Ok-Hwa等[11]也證實(shí)金銀花中的木犀草素能夠抑制促炎細(xì)胞介質(zhì)的釋放，從而起到抗炎作用。劉豪等[12]研究表明，金銀花黃酮乙醇提取物清除·OH和DPPH·能力較強(qiáng)，其清除自由基的能力與綠原酸、黃酮和多酚的含量具有一定的相關(guān)性。目前大部分研究報(bào)道集中于對(duì)金銀花黃酮體外清除自由基方面的評(píng)價(jià)，而金銀花黃酮對(duì)細(xì)胞及機(jī)體影響的研究較少。本研究通過過氧化氫誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞損傷，建立細(xì)胞氧化損傷模型，測(cè)定細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中TAOC、SOD、MDA、GSH、GSH-Px、LDH 及 CAT 水平，探討金銀花黃酮對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制，為揭示金銀花黃酮的抗氧化作用機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花黃酮由本實(shí)驗(yàn)室工作人員以金銀花為原料，采用超聲輔助乙醇提取，經(jīng)D101大孔吸附樹脂純化所得。

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，南京科佰生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清、胰酶、雙抗（青霉素-鏈霉素），美國(guó)Gibco公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），美國(guó) Sigma 公司；T-AOC、SOD、MDA、GSH、GSH-Px、LDH 及 CAT 測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

CKX41倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司；680全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；UV2400紫外-可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；E191IR型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)金西盟公司；微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；HL-2D型恒流泵，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金銀花黃酮的提取 準(zhǔn)確稱取過80目篩的金銀花粉末50 g，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇按料液比 1∶50（g/mL）的比例混合均勻，于超聲功率200 W，提取溫度50℃的條件下超聲提取35 min，抽濾，50℃下減壓濃縮至無醇味，真空冷凍干燥成粉，備用。

1.3.2 金銀花黃酮的純化 預(yù)處理D101樹脂，將1.3.1節(jié)中所得金銀花葉黃酮配成3.0 mg/mL的上樣液，調(diào)節(jié)其pH值至2.46，以1.50 mL/min的流速上樹脂柱純化，先用2.0 BV蒸餾水以1.50 mL/min的流速洗脫以除雜，再用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液（pH11.0）以3.0 mL/min的流速洗脫，收集乙醇洗脫液，旋蒸，凍干后于4℃保存，備用。

1.3.3 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)[13]將RAW264.7細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底70%～80%時(shí)傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞做后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.4 過氧化氫誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷模型的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板中，每孔200 L，細(xì)胞密度2.0×105個(gè)/mL。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁，棄上清，加入用RPMI-1640培養(yǎng)基配制的不同濃度的H2O2溶液，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄上清，用PBS洗滌2次，每孔分別加入200 L培養(yǎng)基及10 L質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT，放入培養(yǎng)箱4 h后停止培養(yǎng)，棄上清，每孔加入150 L DMSO，輕微振蕩10 min使紫色結(jié)晶溶解，放入酶標(biāo)儀中于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：A0——空白組的平均吸光度；A1——特定濃度樣品液組的平均吸光度。

1.3.5 金銀花黃酮?jiǎng)┝康暮Y選 細(xì)胞培養(yǎng)過程同1.3.4節(jié)，僅將加入的RPMI-1640培養(yǎng)基配制的H2O2溶液換成同種培養(yǎng)基配制的不同濃度的金銀花黃酮溶液，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.6 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中T-AOC、SOD、MDA、GSH、GSH-Px、LDH及CAT水平的測(cè)定 將細(xì)胞密度為2.0×105個(gè)/mL的RAW264.7細(xì)胞接種于6孔板中，每孔 2.0 mL，在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁，吸棄上清液。在空白組和模型組加入2.0 mL培養(yǎng)基；在試驗(yàn)組分別加入2.0 mL不同質(zhì)量濃度的金銀花黃酮培養(yǎng)液；在對(duì)照組加入2.0 mL 250 g/mL VC培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄上清液，每孔加入750 mol/L H2O2溶液2.0 mL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h后將細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液分離。將細(xì)胞培養(yǎng)液離心（4℃，1 500 r/min，5 min）后取上清液待測(cè)；細(xì)胞用PBS清洗 2 次后離心（4 ℃，1 000 r/min，10 min），保留細(xì)胞團(tuán)塊，加入0.5 mL PBS，冰水浴條件下超聲破碎（300 W，3～5 s/次，間隔 30 s，重復(fù) 3 次），待測(cè)。參照相應(yīng)試劑盒方法測(cè)定細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中T-AOC、SOD、MDA、GSH、GSH-Px、LDH 及 CAT水平。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用DPS 7.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)定數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析并用LSD法進(jìn)行多重比較，不同小寫字母表示組間比較差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧化氫濃度

由圖1可知，不同濃度的過氧化氫對(duì)RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)均有一定抑制作用，且細(xì)胞存活率隨過氧化氫濃度的升高而降低。與空白組相比，不同濃度的H2O2均顯著抑制RAW264.7細(xì)胞的存活（P＜0.05），用750 mol/L過氧化氫處理時(shí)，RAW264.7細(xì)胞的存活率達(dá)到51.57%。過氧化氫濃度太低時(shí)對(duì)細(xì)胞造成的損傷不明顯，而過氧化氫濃度過高會(huì)造成細(xì)胞死亡過量。建模時(shí)選取過氧化氫濃度為750 mol/L。

圖1 不同濃度H2O2對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of H2O2 on proliferation of RAW264.7 cells

2.2 金銀花黃酮濃度的篩選

由圖2可知，與空白組相比，質(zhì)量濃度在0～250 mg/mL范圍的金銀花黃酮均可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖。當(dāng)金銀花黃酮質(zhì)量濃度小于62.5 mg/mL時(shí)，促增殖作用不顯著（P＞0.05）；當(dāng)其質(zhì)量濃度為62.5，125，250 mg/mL時(shí)，促增殖作用顯著（P＜0.05）；當(dāng)金銀花葉黃酮質(zhì)量濃度大于250 mg/mL時(shí)顯著抑制細(xì)胞增殖（P＜0.05）。選擇金銀花葉黃酮質(zhì)量濃度62.5，125，250 mg/mL作為推薦劑量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 不同濃度金銀花黃酮對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of different concentrations of honeysuckle flavonoids on proliferation of RAW264.7 cells

2.3 RAW264.7細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中T-AOC活性

機(jī)體防御體系中總抗氧化能力（T-AOC）的作用主要是維持內(nèi)環(huán)境活性氧的動(dòng)態(tài)平衡，清除過多的活性氧，使機(jī)體處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)[14]。如圖3所示，與空白組相比，模型組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中T-AOC活性均顯著降低（P＜0.05）。添加金銀花黃酮可以提高細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中T-AOC活性（P＜0.05）。除金銀花黃酮高劑量組在細(xì)胞培養(yǎng)液中的T-AOC活性接近VC對(duì)照組（P＞0.05）外，其它劑量組在細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中的T-AOC活性均低于VC對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05）。

圖3 RAW264.7細(xì)胞（a）及細(xì)胞培養(yǎng)液（b）中T-AOC活性Fig.3 T-AOC activities in RAW264.7 cells （a） and cell culture medium （b）

2.4 RAW264.7細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性

SOD幾乎存在于所有生物細(xì)胞中，能夠催化超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫，是一種重要的抗氧化劑[15]。如圖4所示，與空白組相比，模型組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的SOD活性均顯著下降（P＜0.05），而添加金銀花黃酮能有效升高細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。除金銀花黃酮高劑量組在細(xì)胞中的SOD活性接近VC對(duì)照組（P＞0.05）外，其它劑量組在細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中的GSH含量均低于VC對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05）。

2.5 RAW264.7細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，其含量的高、低間接反映膜系統(tǒng)受損程度[16]。如圖5所示，與空白組相比，模型組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的MDA含量均顯著上升（P＜0.05）。金銀花黃酮低、中、高劑量組均顯著抑制由H2O2引起的細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量的增加，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。VC對(duì)照組的MDA含量低于金銀花黃酮各劑量組，且有顯著差異（P＜0.05）。

圖4 RAW264.7細(xì)胞（a）及細(xì)胞培養(yǎng)液（b）中SOD活性Fig.4 SOD activities in RAW264.7 cells （a） and cell culture medium （b）

圖5 RAW264.7細(xì)胞（A）及細(xì)胞培養(yǎng)液（B）中MDA含量Fig.5 MDA content in RAW264.7 cells （A） and cell culture medium （B）

2.6 RAW264.7細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH含量

GSH可以幫助機(jī)體保持正常的免疫功能，且具有抗氧化和整合解毒功效，在機(jī)體解毒代謝過程中具有重要作用[17]。如圖6所示，與空白組相比，模型組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的GSH含量明顯降低（P＜0.05），而金銀花黃酮低、中、高劑量組抑制了細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH含量的下降，并呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05）。除金銀花黃酮高劑量組在細(xì)胞液中的GSH含量接近VC對(duì)照組（P＞0.05）外，其它劑量組在細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中的GSH含量均低于VC對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05）。VC對(duì)照組與空白組無顯著差異（P＞0.05）。

圖6 RAW264.7細(xì)胞（a）及細(xì)胞培養(yǎng)液（b）中GSH含量Fig.6 GSH content in RAW264.7 cells （a） and cell culture medium （b）

2.7 RAW264.7細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH-Px活性

GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種過氧化物分解酶，它可以保護(hù)機(jī)體免受脂質(zhì)過氧化物的損傷[18]。如圖7所示，與空白組相比，模型組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的GSH含量明顯降低（P＜0.05），金銀花黃酮各劑量組顯著抑制了細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH-Px活性的降低（P＜0.05）。對(duì)于細(xì)胞，金銀花黃酮低、中、高劑量組之間存在明顯的劑量依懶性（P＜0.05）。VC對(duì)照組在細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中的GSH-Px活性顯著高于金銀花黃酮各劑量組，且具有顯著差異（P＜0.05）。

圖7 RAW264.7細(xì)胞（a）及細(xì)胞培養(yǎng)液（b）中GSH-Px活性Fig.7 GSH-Px activities in RAW264.7 cells （a） and cell culture medium （b）

2.8 RAW264.7細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性

LDH存在于細(xì)胞內(nèi)，能催化丙酮酸生成乳酸，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)LDH將大量釋放，導(dǎo)致細(xì)胞外LDH水平的顯著升高，因此LDH活性可以反映細(xì)胞受氧化損傷程度[19]。如圖8所示，與空白組相比，模型組細(xì)胞中的LDH活性顯著降低（P＜0.05），而細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活性顯著升高（P＜0.05），表明H2O2使細(xì)胞膜受損導(dǎo)致LDH外漏。與模型組相比，金銀花黃酮各劑量組顯著升高了細(xì)胞中LDH活性，降低了細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性（P＜0.05），并呈劑量依賴性，表明金銀花黃酮可以預(yù)防或減緩細(xì)胞膜受損程度，阻止細(xì)胞內(nèi)LDH外漏。金銀花黃酮中、高劑量組在細(xì)胞中的LDH活性接近VC 對(duì)照組，無顯著差異（P＞0.05）；金銀花黃酮高劑量組在細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活性顯著高于VC對(duì)照組（P＜0.05）。

2.9 RAW264.7細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中CAT活性

CAT普遍存在于生物機(jī)體內(nèi)，它可以催化H2O2分解為H2O與O2，保護(hù)機(jī)體免受有害物質(zhì)損傷[20]。如圖9所示，與空白組相比，模型組細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中的CAT活性明顯降低 （P＜0.05），金銀花黃酮各劑量組顯著提高了細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液中CAT活性，并呈劑量依賴性（P＜0.05）。金銀花黃酮高劑量組在細(xì)胞及細(xì)胞液中的CAT活性均接近 VC 對(duì)照組（P＞0.05）。

圖8 RAW264.7細(xì)胞（a）及細(xì)胞培養(yǎng)液（b）中LDH活性Fig.8 LDH activities in RAW264.7 cells （a） and cell culture medium （b）

圖9 RAW264.7細(xì)胞（a）及細(xì)胞培養(yǎng)液（b）中CAT活性Fig.9 CAT activities in RAW264.7 cells （a） and cell culture medium （b）

3 討論與結(jié)論

本研究通過過氧化氫處理RAW264.7細(xì)胞來制備氧化應(yīng)激損傷模型，探討金銀花黃酮對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。研究結(jié)果表明，經(jīng)750 mol/L過氧化氫處理的RAW264.7細(xì)胞存活率顯著下降，在質(zhì)量濃度0～250 mg/mL范圍的金銀花黃酮均可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，其中質(zhì)量濃度在62.5～250 mg/mL范圍時(shí)，促增殖作用顯著。

通過測(cè)定細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中總抗氧化能力（T-AOC）、 超氧化物歧化 酶 （SOD）、 丙 二醛（MDA）、谷胱苷肽（GSH）、谷胱苷肽過氧化物酶（GSH-Px）、 乳酸脫氫酶 （LDH） 及過氧化氫酶（CAT）的水平來反映金銀花黃酮對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)損傷的RAW264.7細(xì)胞的保護(hù)程度。研究發(fā)現(xiàn)處理RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量顯著升高，T-AOC 水平、SOD、GSH-Px、CAT活性及GSH含量均顯著降低；細(xì)胞中LDH活性下降，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性升高，這表明過氧化氫對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞具有明顯的毒性作用，會(huì)使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，細(xì)胞內(nèi)各種酶活性下降。而不同劑量金銀花黃酮修復(fù)損傷細(xì)胞時(shí)，上述指標(biāo)較模型組均獲得不同程度的改善。金銀花黃酮一方面通過提高細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液中GSH含量及SOD、GSH-Px、CAT活性，清除有毒有害物質(zhì)和自由基，緩解細(xì)胞所受到的損傷；另一方面通過減少M(fèi)DA含量來降低脂質(zhì)過氧化物含量，減緩細(xì)胞膜系統(tǒng)受氧自由基攻擊后的損傷，從而間接增強(qiáng)機(jī)體抵抗自由基攻擊的能力[21]，保持生物膜的結(jié)構(gòu)完整和膜表面蛋白質(zhì)的功能，減輕LDH向細(xì)胞外擴(kuò)散的程度。

綜上所述，金銀花黃酮可以顯著緩解過氧化氫損傷導(dǎo)致的RAW264.7巨噬細(xì)胞活力下降，其保護(hù)作用可能與增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，清除氧自由基及有害物質(zhì)，維持細(xì)胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性有關(guān)。