張璟琳，張璐，賈雪穎，黃明泉*，孫寶國

1(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津,300457)2(北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京,100048)

氯丙醇酯(bound monochloropropanediol，MCPDE)是氯丙醇(monochloropropanediol，MCPD)連接不同高級脂肪酸后產(chǎn)生的酯類化合物[1]。2004年SVEJKOVSKA等[2]發(fā)現(xiàn)食品中含有高含量的氯丙醇酯。隨后氯丙醇酯在多種食用油[3-4]，油脂[5]和高油脂食品[6]，甚至在嬰兒奶粉中被檢測到[7]。氯丙醇酯本身具有一定毒性[8]，同時體外實驗顯示，氯丙醇酯可通過腸道內(nèi)的脂肪酶水解成氯丙醇[9-10]產(chǎn)生毒性。熱反應(yīng)的過程會產(chǎn)生低劑量的氯丙醇酯等毒性物質(zhì)[11]，所以對氯丙醇酯在食品中的含量進(jìn)行調(diào)查，并進(jìn)行風(fēng)險評估，對人們的身體健康十分重要。

目前，氯丙醇酯的研究多集中于油脂精煉加工[4,12]過程中，國內(nèi)外對于食品中氯丙醇酯的研究相對少[13-14]。SVEJKOVSKA等[2]發(fā)現(xiàn)在一些奶酪、黑麥芽、烤花生、臘腸、和烤雞中3-MCPDE含量較高(0.14～6.10 mg/kg)；KüSTERS等[14]采用GC-MS檢測了高油脂食品(如烘焙食品，甜食，肉汁，湯粉，食用油)中MCPDE含量，其中含量最高為人造黃油樣品，為1 417 μg/kg；里南[15]對我國的食用油、方便面和油炸食品進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，油炸食品中氯丙醇酯的污染較為嚴(yán)重，3-MCPDE和2-MCPDE的含量為0.064～7.67 mg/kg脂肪和0.072～5.02 mg/kg脂肪。

油炸作為高溫下油脂直接接觸食品的一種加工方式，很可能導(dǎo)致最終食品中含有較高含量的氯丙醇酯，對人體健康造成一定的風(fēng)險。國內(nèi)雖對油炸食品中3-MCPDE和2-MCPDE含量多有分析，但是對脂肪提取部分的優(yōu)化不足。國外研究者[16-17]使用加速溶劑萃取的方式提取食品中的氯丙醇酯。超聲波儀器屬于實驗室的常用儀器，對很多物質(zhì)提取有重要作用[18]，通過優(yōu)化超聲波提取的條件，經(jīng)過前處理及GC-MS/MS分析進(jìn)而確定3-MCPDE和2-MCPDE的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗樣品：油餅(編號1)，菜丸子(編號2)，麻花(編號3)，蝦片(編號4)，炸花生(編號5)，馓子(編號6)，鍋巴(編號7)，咯吱盒(編號8)，炸魚(編號9)，炸羊肉丸(編號10)，炸雞肉(編號11)，麻花(編號12)，超市。

試劑：叔丁基甲基醚(t-butyl methyl ether, TBME)，乙醚，乙酸乙酯，正己烷，NaOH，石油醚，甲醇，四氫呋喃(均為分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；H3PO4，苯硼酸，異辛烷(均為分析純)，百靈威科技有限公司。

3-氯-1,2-丙二棕櫚酸酯(1,2-distearoyl-3-chloropropanediol, pp-3-MCPD)，d5-3-氯-1,2-丙二棕櫚酸酯(d5-1,2-distearoyl-3-chloropropanediol, d5-pp-3-MCPD)，2-氯-1,3-丙二硬脂酸酯(1,3-distearoyl-2-chloropropanediol, pp-2-MCPD)，均為標(biāo)準(zhǔn)品，純度>97%，Toronto Research Chemicals公司。

溶液配制：pp-3-MCPD溶液，用四氫呋喃稀釋至10.0 μg/mL；pp-2-MCPD溶液，用四氫呋喃稀釋至10.0 μg/mL；d5-pp-3-MCPD溶液，用四氫呋喃稀釋至5.0 μg/mL；甲醇鈉溶液，0.25 gNaOH溶解于100 mL甲醇中，搖勻至全部溶解，放置于-22 ℃冰箱中；NaBr溶液，600 g NaBr加入3.0 mL H3PO4定容于1.0 L水中，移取600 μL，加入350 μL甲醇鈉溶液，放置于-22 ℃冰箱中；乙醚/乙酸乙酯溶液，將30 mL乙醚與20 mL乙酸乙酯混合放置于存儲瓶中；苯硼酸溶液，稱取200 mg苯硼酸溶解于10 mL丙酮中。

1.2 儀器與設(shè)備

T-403電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Pipetman M EF9697精密移液器，法國Gilson公司；TSQ8000三重串聯(lián)四級桿氣相質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher公司；BF-2000氮氣吹干儀，北京八方世紀(jì)科技有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；JYL-C012食物打碎機(jī)，九陽股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 總脂肪含量測定

總脂肪含量的檢測參照GB/T 5009.6—2016[19]并進(jìn)行適當(dāng)修改。稱取5.00 g樣品，移入濾紙筒內(nèi)。將濾紙筒放入脂肪提取器的抽提筒中，連接已干燥的250 mL抽提瓶，由冷凝管上端加入190 mL石油醚，于油浴鍋內(nèi)100 ℃加熱，不斷回流提取6 h。反應(yīng)結(jié)束后取下接收瓶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將有機(jī)溶劑蒸發(fā)，再于(100±5) ℃干燥2 h，放干燥器中冷卻0.5 h后稱重，重復(fù)操作直至恒重。

1.3.2 樣品前處理

MCPDE提取(油脂提取物)：將試樣均勻打碎，稱取試樣5.00 g，加入20 mL TBME，充分振搖混勻，40 ℃超聲提取20 min，以3 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移出上層溶劑。下層樣品重復(fù)提取(1次)，合并有機(jī)相，以氮氣濃縮至質(zhì)量不再減少。

MCPDE的酯化及衍生[20]：稱取100 mg油脂提取物，加入80 μL內(nèi)標(biāo)物d5-pp-3-MCPD，600 μL乙醚，搖晃至溶解。油脂提取物在-22～-25 ℃保持15 min，加入350 μL甲醇鈉溶液，于-22 ℃反應(yīng)16 h。取出反應(yīng)液，加入600 μL NaBr溶液于-22 ℃停止反應(yīng)，氮吹。加入正己烷600 μL，劇烈搖，在室溫下靜置5 min。 用吸管移去有機(jī)相，再用600 μL正己烷清洗1次，移去有機(jī)相。用600 μL乙醚/乙酸乙酯溶液提取3次，轉(zhuǎn)移有機(jī)相并用無水Na2SO4除水，加入80 μL衍生溶液，常溫超聲5 min，氮吹至干，用500 μL的異辛烷復(fù)溶。

1.3.3 儀器分析條件

(1)氣相色譜條件

HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；初溫60 ℃，以6 ℃/min升至150 ℃，保持2 min；再以10 ℃/min升至280 ℃，保持5 min；載氣He，純度99.999%，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL。

(2)質(zhì)譜條件：EI源，電子能量70 eV，離子源溫度280 ℃，傳輸線溫度280 ℃，選擇反應(yīng)掃描模式(selective reaction monitoring，SRM)參數(shù)如表1所示。

表1 MCPDEs的保留時間和二級質(zhì)譜參數(shù)Table 1 retention times and m/z of native and stable isotopelabelled MCPDEs for GC-MS/ MS SRM analysis

1.4 總脂肪及氯丙醇酯含量計算

(1) 總脂肪含量計算，見公式(1)。

(1)

式中：x，試樣中粗脂肪含量，g/100g;m1，接收瓶和粗脂肪的總質(zhì)量, g;m0，接收瓶的質(zhì)量, g;m2，試樣的質(zhì)量, g。

(2)氯丙醇酯的含量

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：3-MCPDE和2-MCPDE的定量結(jié)果均以游離態(tài)3-MCPD、2-MCPD，換算系數(shù)如表2所示。以pp-3-MCPD(或pp-2-MCPD)與d5-pp-3-MCPD的峰面積比與相對應(yīng)的pp-3-MCPD(或pp-2-MCPD)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合回歸方程(見公式(2))。

y=a×x+b

(2)

式中：y，標(biāo)準(zhǔn)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比;a，擬合曲線的斜率;b，擬合曲線的截距;x，pp-3-MCPD(或pp-2-MCPD)的質(zhì)量(以MCPD計)，μg。

樣品中pp-3-MCPD(或pp-2-MCPD)的含量計算(以MCPD計，μg)，見公式(3)。

(3)

式中:w，樣品中pp-3-MCPD(或pp-2-MCPD)的含量，μg/g；x/100，pp-3-MCPD(或pp-2-MCPD)在油脂提取物中的含量，μg/mg，100是提取的質(zhì)量,mg；m油，油脂提取物含量，mg；w樣，稱取的樣品質(zhì)量，g。

表2 MCPDE及其同位素折算系數(shù)Table 2 Conversion coefficient of MCPDE and d5-MCPDE

2 結(jié)果與分析

2.1 MCPDE提取優(yōu)化

為保證MCPDE在分析時不受到食品復(fù)雜基質(zhì)干擾，先要進(jìn)行脂肪提取。為使提取過程更加完全，需要對提取參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。提取過程的主要優(yōu)化參數(shù)包含有機(jī)溶劑的種類和提取的溫度。溶劑的選擇是重要因素之一，因為不同溶劑對目標(biāo)物的萃取效率不一樣；同時，需要避免引入氯離子，氯離子的存在可能會造成副反應(yīng)。有研究者認(rèn)為叔丁基甲基醚(TBME)被認(rèn)為是最適合的溶劑[21]，然而MA等[22]認(rèn)為TBME與乙酸乙酯在體積比為1∶5混合時提取效果更好，因為混合溶劑的極性不同，可以增加提取效率。提取溫度也是影響提取效率的重要因素，過高的溫度會使有機(jī)溶劑揮發(fā)，導(dǎo)致提取率偏差較大；同時，高溫可能引起一些副反應(yīng)。過低的溫度會導(dǎo)致提取不完全，提取率低。所以，選擇40 ℃和60 ℃兩個提取溫度進(jìn)行優(yōu)化。最優(yōu)條件根據(jù)脂肪提取率和MCPDE含量結(jié)果確定，結(jié)果如圖1、圖2所示。

1-40 ℃ TBME; 2-60 ℃ TBME;3-40 ℃正己烷：TBME(體積比1∶2);4-60 ℃正己烷：TBME(體積比1∶2)圖1 不同超聲提取條件下脂肪提取率的比較Fig.1 Comparison of different extraction protocols based on ultrasonic extraction technique for fat recovery from the fried dough twist

1-40 ℃ TBME；2-60 ℃ TBME；3-40 ℃正己烷：TBME(體積比1∶2)；4-60 ℃正己烷:TBME(體積比1∶2)圖2 不同超聲提取條件下MCPDEs含量的比較Fig.2 MCPDEs content measured in fried dough twist with different extraction protocols

以麻花(編號12)作為優(yōu)化樣品，根據(jù)國標(biāo)方法測定其脂肪含量為31.5%。在4種提取條件中，在40 ℃條件下，正己烷∶TBME=1∶2(體積比)的提取效率最高，40 ℃ TBME提取效率次之，而在60 ℃條件下，提取效率較低?？梢姡?0 ℃提取效率高于60 ℃的提取效率，這可能是由于在提取過程中，高溫使有機(jī)溶劑揮發(fā)過多，提取效率下降。在溶劑的選擇上，正庚烷與TBME因其極性不同，溶劑混合后提取效果更好。

另外，MANIRAKIZA等[23]認(rèn)為正己烷與丙酮(體積比4∶1)混合時對樣品中總脂肪的提取最好，但是SAMARAS等[24]指出這種溶劑組合的方式提取會將含水量高食品中的水分一同提取出來，不利于后面氯丙醇酯的分析。為進(jìn)一步驗證結(jié)果的有效性，對比不同超聲提取條件下MCPDE檢測的含量結(jié)果，如圖2所示。

由圖2可知，40 ℃提取溶劑為MTBE時提取效率最高，3-MCPDE含量為12.695 mg/kg，2-MCPDE含量為9.183 mg/kg。所以，選擇40 ℃，MTBE為溶劑對油炸食品進(jìn)行提取。

2.2 MCPDE檢測方法驗證

選取9個不同質(zhì)量濃度分別建立3-MCPDE和2-MCPDE 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由表3可知，2條標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.992，線性良好；以信噪比(S/N)=3確定3-MCPDE和2-MCPDE的檢出限(LOD)為0.006 8 μg/g和0.0062 μg/g，以信噪比(S/N)=10確定定量限(LOQ)為0.026 μg/g和0.012 μg/g。

檢測方法的準(zhǔn)確度可以通過添加已知含量的標(biāo)準(zhǔn)物來確定。在咯吱盒(編號8)中加入2種不同質(zhì)量濃度的pp-3MCPD和pp-2-MCPD，質(zhì)量濃度分別為0.11 mg/L 和0.086 mg/L，0.22 mg/L和0.17 mg/L，每個樣品重復(fù)進(jìn)樣6次確定方法的重復(fù)性，分析結(jié)果如表4所示。由表4可知，兩種氯丙醇酯的回收率為93.8%～111.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%～4.8%。

表3 MCPD的標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限及檢出限結(jié)果Table 3 Standard curves, limits of detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) of MCPDs

表4 MCPD的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 The accuracy and relative standard deviation of MCPDs

注：an=6；bd5-pp-3-MCPD作為內(nèi)標(biāo)物。

2.3 油炸食品中MCPDEs含量分析

根據(jù)上述的檢測方法，分析中國油炸食品中3-MCPDE 和2-MCPDE的含量，每個分析樣品平行進(jìn)行3次，檢測結(jié)果如表5所示。

由表5可知，在檢測的12個樣品中，油脂的含量為8.1%～38.9%，3-MCPDE的含量為0.056～0.672 μg/g， 2-MCPDE的含量為ND～0.424 μg/g，其中3-MCPDE含量最高的樣品為蝦片(樣品4)，最低的為炸花生(樣品5)，2-MCPDE的含量最高的為麻花(樣品12)，最低的為炸花生(樣品5)。

表5 油炸食品中3-MCPDE和2-MCPDE的含量Table 5 Levels of 3-MCPD esters and 2-MCPD esters in fried foods in China

注：40 ℃TBME提??；b平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；cND表示未檢出。

3 結(jié)論

以TBME為溶劑，選擇40℃超聲提取食品中的油脂部分，采用低溫下堿水解的方式檢測提取物中3-MCPDE及2-MCPDE的含量。該方法的內(nèi)標(biāo)定量曲線的線性，方法的回收率和重復(fù)性良好。在所有樣品檢測中，除了油炸花生中檢測到2-MCPDE，其他樣品均檢測到3-MCPDE及2-MCPDE；3-MCPDE含量最高的樣品為蝦片(樣品4)，2-MCPDE的含量最高的為麻花(樣品12)；在所有樣品中2-MCPDE的含量均低于3-MCPDE的含量，2-MCPDE∶3-MCPDE的含量百分比為33%～75%，但二者的比例關(guān)系的形成原因有待進(jìn)一步研究。